使用 zSpRY-ABE8e 对斑马鱼进行人类遗传病建模的高效无 PAM 碱基编辑

该协议允许研究人员建立许多以前不可用的斑马鱼疾病相关单核苷酸变体模型。PAM 限制是创建准确动物模型的主要障碍，zSpRY-ABE8e 能够以低换位和宽松的 PAN 限制实现腺嘌呤到鸟嘌呤碱基的高效转化。该工具可用于构建精确的斑马鱼模型，用于研究与单核苷酸海洋相关的致病特征疾病机制，以及该疾病的药物筛选。

首先，设置微量移液器拉拔器系统并预热至少 30 分钟。要拉动玻璃毛细管，请选择一个程序，将斜坡测试值设置为热量，50 设置为拉力，速度为 100，时间设置为 50，压力设置为 30。接下来，安装毛细管，确保它位于凹槽中。

按拉动开始/停止"运行程序。为了保护拉动的毛细管，将它们插入含有间隙的泡沫中，保持针头悬浮。对于实验，使用手稿中描述的zSpRY-ABE8e mRNA，并在两端用2'O-甲基硫代磷酸酯轻松编辑sgRNA。

对于gRNA设计，优先选择NRN作为PAM序列，因为zSpRY-ABE8e显示NRN PAM的偏好高于NYN PAM。 输入目标腺嘌呤核苷酸处于沿着原间隔条从第三核苷酸到第九核苷酸的高度活跃编辑窗口。在注射前一天晚上设置繁殖池。

插入一个分隔器，在每个水箱中放置两条雌性和一条雄性斑马鱼。在每个水箱上盖上盖子。第二天早上，使用不含RNA酶的吸头，试管和手套，将解冻的mRNA和EEgRNA在冰上混合至最终浓度分别为每微升400和200纳克。

要配置气动微型注射器，首先，关闭气泵的分压阀。然后，打开主阀，拧下气瓶，将分压阀的压力调节到0.2兆帕。现在，打开显微注射器并将模式设置为计时器。

将参数压力阀调整为每平方英寸 20 磅，将计时器值调整为 0.040 秒。使用细镊子，在体视显微镜下的角度折断拉动的玻璃毛细管的针。使用微量加载器移液器吸头，将mRNA / gRNA混合物添加到玻璃毛细管的尖端，并将针头连接到显微操纵器上。

配置压力和计时器值，以使用微帽每次注射产生两纳升混合物。繁殖鱼 10 到 15 分钟后，将卵收集在过滤器中。在体视显微镜下检查细胞阶段和卵子质量。

选择单细胞卵子进行注射，以提高编辑效率。将卵子排列在1.5%琼脂糖注射板上，并使用显微镜将两纳升RNA混合物注射到胚胎细胞中。用E3缓冲液将鸡蛋收集在培养皿中，并在28摄氏度下孵育。

取出死卵，受精后48小时每12小时更换一次培养缓冲液。受精后48小时后，将三个随机选择的六个注射胚胎池收集到PCR管中。收集六个随机选择的对照胚胎后，使用移液器吸出残留的E3缓冲液。

向胚胎中加入40微升50毫摩尔氢氧化钠。将试管放入95摄氏度的金属浴中20分钟，然后涡旋15秒。向每个试管中加入四微升一摩尔三盐酸盐，pH 8。

在室温下以2000g离心管10秒钟。将上清液转移到新的PCR管中。从PCR管中取出一微升上清液并将其用于Sanger测序。

然后将剩余的上清液储存在20摄氏度。要分析 Sanger 测序数据，首先将测序文件上传到上传 ab1 File"框中。将 20 个碱基对 gRNA 序列以 5'至 3' 方向输入到输入 gRNA"序列框中。

在 5'start 和 3'end 框中输入相应的基本位置。通过点击预测编辑"并检查测序数据的质量来获得基础编辑效率。通过将Tsr2起始密码子的腺嘌呤转化为鸟嘌呤，构建了菱形黑扇贫血斑马鱼模型。

序列数据的EditR分析表明，Tsr2起始密码子的腺嘌呤碱基存在AG重叠。与对照胚胎相比，两个日龄Tsr2胚胎的表型显示出更小的眼睛。在突变胚胎中也观察到心包肿胀。

为了实现高效的基础编辑，请严格遵循前面提到的指南设计原则，这是实验成功的先决条件。准确的模型对于研究单核苷酸变异相关疾病至关重要。SprY-ABE8e的开发为精确建模提供了有效的工具，有助于促进疾病机制和治疗方法的研究。