Name: 使用 zSpRY-ABE8e 对斑马鱼进行人类遗传病建模的高效无 PAM 碱基编辑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 了解利用zSpRY-ABE8e系统在斑马鱼中进行高效无PAM碱基编辑的方法，用于构建人类遗传病模型。该技术可精确模拟单核苷酸变异相关疾病，为研究发病机制和药物筛选提供重要工具。

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我们感谢来自理文编辑（Edanz）的Barbara Garbers博士对本手稿初稿英文文本的编辑。本工作由广东省重点领域研发计划（2019B030335001）、国家重点领域研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2019YFE0106700）、国家自然科学基金（32070819，31970782）以及广东省水产经济动物病原生物学与流行病学重点实验室（PBEA2020YB05）研究基金项目。

本研究严格遵守华南师范大学动物护理与使用委员会的指导方针进行。
1. 准备合成修饰的gRNA和zSpRY-ABE8e mRNA
<ol>
	<li>根据先前发表的文献设计gRNA37,38.
	<ol>
		<li>优先选择NRN作为PAM序列，因为zSpRY-ABE8e对NRN PAM的偏好性高于NYN PAM（其中R代表A或G，Y代表C或T）。18确保目标腺嘌呤核苷酸位于高活性编辑窗口内（原间隔序列中第3至第9个核苷酸）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>订购在两端经 2′-O-甲基-3′-硫代磷酸酯（MS）修饰的 EasyEdit sgRNA（EE gRNA）图1). 
	注意：EE gRNA 应溶解于无 RNase 水中，并于 −80 °C 保存。</li>
	<li>线性化zSpRY-ABE8e质粒18.
	<ol>
		<li>用限制性内切酶将6 µg质粒线性化 XbaI 酶材料表在37 °C金属浴中孵育3小时。</li>
		<li>使用DNA纯化试剂盒纯化线性化质粒（参见 材料表按照制造商的说明进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下方法转录 mRNA 体外 转录试剂盒（材料表).
	<ol>
		<li>以线性化质粒为模板，按照制造商说明书转录 zSpRY-ABE8e mRNA。 
		注意：所有涉及 mRNA 和 gRNA 的操作均需使用无 RNase 的实验耗材。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用RNA纯化试剂盒（材料表）按照制造商说明书纯化 mRNA。 
	注意：洗脱前必须干燥乙醇，以避免细胞毒性；若 mRNA 不能立即使用，应保存在 −80 °C。</li>
</ol>
2. 准备受精显微注射用玻璃毛细管
<ol>
	<li>设置微电极拉制仪系统，并预热至少 30 分钟。</li>
	<li>运行梯度加热测试，根据制造商说明书确定熔融硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1 mm，内径 0.58 mm）所需的加热值。</li>
	<li>选择一个程序，点击键盘上的数字输入参数值。设置以下参数以拉制玻璃毛细管：加热值 = 梯度测试结果，拉力 = 50，速度 = 100，时间 = 50，气压 = 30。</li>
	<li>安装毛细管，确保其位于凹槽中。按下 PULL START/STOP 以运行程序。</li>
	<li>将拉制好的毛细管插入带有缝隙的泡沫中保存，使针尖保持悬空状态。</li>
</ol>
3. 将zSpRY-ABE8e mRNA与EE gRNA混合物显微注射入斑马鱼胚胎
<ol>
	<li>在注射前一晚设置繁殖用鱼缸。插入隔离板，每缸放入两条雌性与一条雄性AB品系斑马鱼（3-18月龄），并盖上盖子。性别区分方法参见以往文献39。 
	注意：为获得更多的胚胎，应选择至少一周内未进行过繁殖的斑马鱼。</li>
	<li>注射次日清晨，将zSpRY-ABE8e mRNA和EE gRNA置于冰上解冻。将mRNA与gRNA混合，使其终浓度分别为400 ng/µL和200 ng/µL。
	<ol>
		<li>整个操作过程需在冰上进行，使用无RNase的枪头和离心管，并佩戴手套操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配置气动显微注射仪。先关闭气泵的减压阀并打开主阀，再打开气瓶，调节减压阀压力至0.2 MPa/29 psi。
	<ol>
		<li>开启气动显微注射仪，将模式设为TIMER，初始参数压力值设为20.0 psi，TIMER值设为0.040 s。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在体视显微镜下使用精细镊子小心折断拉制好的玻璃毛细针尖，确保针尖呈一定角度断裂，以便穿透卵膜和卵细胞。 
	注意：针尖断裂位置需恰当，既要足够坚固以刺穿卵细胞，又要足够细以尽量减少对卵的损伤。</li>
	<li>使用微量移液器枪头将zSpRY-ABE8e mRNA与gRNA的混合液加入玻璃毛细针尖，避免毛细管内产生气泡。将针头安装至显微操作仪上，并调节注射器的压力和TIMER值，使用微毛细管校准确保每次注射输出2 nL混合液。</li>
	<li>移除繁殖缸中的隔离板，让斑马鱼交配10-15分钟。用滤网收集卵，并在体视显微镜下检查卵的细胞期和质量。选择处于单细胞期的卵进行注射，以提高编辑效率。</li>
	<li>将卵整齐排列于1.5%琼脂糖注射板上，在显微镜下向胚胎细胞（而非卵黄）注射2 nL混合液，以提高编辑效率。至少保留15枚卵作为对照组。</li>
	<li>用1×E3缓冲液将卵转移至培养皿中，并置于28 °C培养箱内孵育。清除死亡的卵，每隔12小时更换一次培养缓冲液，直至受精后48小时（hpf）。</li>
</ol>
使用 EditR 进行碱基编辑效率分析
<ol>
	<li>在48 hpf时，分别将三组随机选取的注射胚胎（每组六只）和六只随机选取的对照胚胎收集到PCR管中。使用移液器吸除残留的E3缓冲液。</li>
	<li>向PCR管中加入40 µL的50 mM NaOH。将PCR管置于95 °C金属浴中孵育20分钟，然后涡旋振荡15秒。</li>
	<li>向每根PCR管中加入4 µL的1 M Tris·HCl（pH 8.0）以中和NaOH。在室温下以2,000 x g短暂离心10秒，以去除管壁上的液滴。将上清液转移至新的PCR管中，并于−20 °C保存。</li>
	<li>在gRNA靶位点的上下游设计合适的引物。使用1 µL上述上清液作为模板进行50 µL体积的PCR反应。本研究中所用PCR引物列于补充表1中。</li>
	<li>进行DNA琼脂糖凝胶电泳，确认获得正确且特异的条带，随后按先前描述的方法进行Sanger测序40。</li>
	<li>使用EditR（1.0.10）程序分析Sanger测序数据41。
	<ol>
		<li>将测序文件（ab1格式）上传至&#34;上传.ab1文件&#34;框中。</li>
		<li>将20 bp的gRNA序列以5′-3′方向输入&#34;输入gRNA序列&#34;框中。</li>
		<li>打开测序文件（ab1格式），确认20 bp gRNA序列起始和终止的碱基位置。将相应的碱基位置分别填入&#34;5′起始&#34;和&#34;3′终止&#34;框中。</li>
		<li>点击预测编辑以获得碱基编辑效率。检查gRNA靶序列附近的测序数据质量，避免出现杂乱峰或插入缺失（indels）。 
		注：通常可通过调整PCR退火温度有效去除杂乱峰。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Eichler, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completing+the+map+of+human+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Completing the map of human genetic variation.</a> Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).</li>
<li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li>
<li>Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+studying+complex+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).</li>
<li>Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+CRISPR-Cas+nucleases%2C+base+editors%2C+transposases+and+prime+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).</li>
<li>Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+editing+of+a+target+base+in+genomic+DNA+without+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.</a> Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).</li>
<li>Nishida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+editing+using+hybrid+prokaryotic+and+vertebrate+adaptive+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems.</a> Science. 353 (6305), (2016).</li>
<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+adenine+base+editors+with+increased+activity+and+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+base+editing+in+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit.</a> Nature Communications. 9, 2717(2018).</li>
<li>Levy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+and+adenine+base+editing+of+the+brain%2C+liver%2C+retina%2C+heart+and+skeletal+muscle+of+mice+via+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses.</a> Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+mouse+models+of+human+diseases+via+ABE-+and+BE-mediated+base+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing.</a> Nature Communications. 9, 2338(2018).</li>
<li>Landrum, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClinVar%3A+Public+archive+of+interpretations+of+clinically+relevant+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants.</a> Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+A%E2%80%A2T+to+G%E2%80%A2C+base+editing+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome.</a> BMC Biology. 16 (1), 139(2018).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeted+single-nucleotide+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8, 11423(2018).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+zebrafish+genome+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 8, 118(2017).</li>
<li>Rosello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+base+editing+for+the+in+vivo+study+of+developmental+signaling+and+human+pathologies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish.</a> eLife. 10, 65552(2021).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpG+and+SpRY+variants+expand+the+CRISPR+toolbox+for+genome+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish.</a> Nature Communications. 13, 3421(2022).</li>
<li>Qin, W., Lu, X., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+in+zebrafish+using+a+modified+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 150, 19-23 (2018).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+CRISPR%2FCas9+genome+editing+capacity+in+zebrafish+using+SaCas9%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9.</a> G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+zebrafish+by+ScCas9+recognizing+NNG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM.</a> Cells. 10 (8), 2099(2021).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nucleases+with+altered+PAM+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.</a> Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).</li>
<li>Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR+toolbox+in+zebrafish+for+studying+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13(2019).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li>
<li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+plants+by+engineered+CRISPR-Cas9+recognizing+NG+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM.</a> Nature Plants. 5, 14-17 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genome+editing+using+xCas9+with+expanded+PAM+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility.</a> Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).</li>
<li>Ren, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAM-less+plant+genome+editing+using+a+CRISPR-SpRY+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox.</a> Nature Plants. 7, 25-33 (2021).</li>
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<li>Vicencio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+animals+with+minimal+PAM+CRISPR-Cas9+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes.</a> Nature Communications. 13, 2601(2022).</li>
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<li>Kluesner, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EditR%3A+A+method+to+quantify+base+editing+from+Sanger+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing.</a> The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).</li>
<li>Gripp, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamond-Blackfan+anemia+with+mandibulofacial+dystostosis+is+heterogeneous%2C+including+the+novel+DBA+genes+TSR2+and+RPS28%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+using+CRISPR%2FCas+nucleases+and+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs.</a> Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了使用碱基编辑器 zSpRY-ABE8e 构建斑马鱼疾病模型的方法。与传统的通过同源定向修复（HDR）途径实现碱基替换的方法相比，本方案可实现更高效的碱基编辑，并减少插入缺失（indels）的发生。同时，本方案涉及在斑马鱼中实施近期提出的 i-Silence 基因敲除策略。综上所述，zSpRY-ABE8e 将增强斑马鱼模型在疾病研究中的应用。
脱靶效应是CRISPR/Cas9系统中的常见问题。尽管先前一项包含靶向tsr2的研究未发现显著的脱靶效应18，但由于缺乏PAM序列限制，zSpRY-ABE8e的脱靶效应可能更高。幸运的是，通过严格的gRNA设计标准可避免这一问题，这些标准确保仅有一个基因组序列能与gRNA及其PAM序列完全匹配，并将预测的脱靶位点总数降至最低。此外，已有研究表明，与注射mRNA和gRNA相比，注射核糖核蛋白复合物（RNP）和gRNA可降低脱靶概率43。进一步地，对gRNA和Cas9的修饰也可减少脱靶效应...

导致错义或无义突变的单核苷酸变异（SNVs）是人类基因组中最常见的突变来源1。为了确定特定SNV是否具有致病性，并阐明其致病机制，需要建立精确的动物模型2。斑马鱼是良好的人类疾病模型，其与人类在生理和遗传上具有高度同源性，且发育周期短、繁殖能力强，有利于致病特征与机制的研究以及药物筛选3。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统已广泛应用于包括斑马鱼在内的多种物种的基因组编辑4。在gRNA的引导下，CRISPR/Cas9系统可在靶位点产生DNA双链断裂（DSBs），随后通过同源定向修复（HDR）途径将靶位点与供体DNA模板重组，实现单碱基替换。via然而，由于细胞DNA修复过程主要通过非同源末端连接（NHEJ）途径进行，该方法的碱基替换效率较低，且通常伴随插入和缺失（indel）突变5。幸运的是，基于CRISPR/Cas9的单碱基编辑技术通过使用碱基编辑器（base editors），在不诱导DSBs的情况下实现了更高效的单碱基编辑，显著缓解了这一问题。目前已开发出两类主要的碱基编辑器：腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）和胞嘧啶碱基编辑器（CBEs），分别用于实现A·T到G·C和C·G到T·A的碱基替换6,7,8,9,10,11。这四种碱基替换类型涵盖了30%的人类致病性变异12。已有报道表明，包括PmCDA1、BE系统、CBE4max、ABE7.10和ABE8e在内的这两类碱基编辑器均能在斑马鱼中发挥作用，其中BE4max和ABE8e尤其被报道具有较高的编辑活性13,14,15,16,17,18,19。
来自不同物种的Cas9蛋白，包括Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes和S. canis，已被应用于斑马鱼基因编辑，其中Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）的应用最为广泛20,21,22,23。然而，SpCas9只能识别具有NGG原间隔序列邻近基序（PAM）的靶位点，这限制了其可编辑范围，可能导致在感兴趣的致病位点附近无法找到合适的序列24。为了扩展靶向范围，已通过定向进化和结构导向设计构建了多种SpCas9变体，以识别不同的PAM序列。然而，这些变体中仅有少数在动物体内有效，尤其是在斑马鱼中，这限制了斑马鱼在单核苷酸变异（SNV）相关疾病研究中的应用25,26,27,28。最近，报道了两种PAM限制更宽松的SpCas9变体SpG和SpRY（SpG识别NGN，SpRY识别NNN，且对NRN的偏好高于NYN），在人类细胞和植物中表现出高效的编辑活性29,30,31,32。随后，SpG和SpRY以及多种由其介导的碱基编辑器，如SpRY介导的CBEs和SpRY介导的ABEs，也被证实可在斑马鱼中发挥作用，这将增强斑马鱼模型在SNV相关疾病机制研究和药物筛选中的应用18,33,34,35。此外，i-Silence被提出作为一种高效且精确的基因敲除策略，通过ABE介导将起始密码子从ATG转换为GTG或ACG36。i-Silence策略与SpRY介导的碱基编辑器zSpRY-ABE8e的结合，为疾病建模提供了新方法18。本实验方案展示了如何在斑马鱼中利用zSpRY-ABE8e结合i-Silence策略构建tsr2（M1V）模型，并对斑马鱼模型中的编辑效率和表型进行了评估与分析。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>用于制备注射平板的1.5%琼脂糖</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 30-0016</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒</td><td>Vazyme</td><td>C115</td><td>用于Infusion克隆的试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>密码子优化服务</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drummond微量毛细管</td><td>Drummond Microcaps</td><td>P1299-1PAK</td><td>长度：32 mm，容量：0.5 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>EasyEdit gRNA服务</td><td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Scientific Instrument</td><td>11254-20</td><td>用于折断针头</td></tr><tr><td>Flaming/Brown微电极拉制仪&amp;nbsp;</td><td>Stutter Instrument</td><td>P-97</td><td>用于拉制玻璃毛细管</td></tr><tr><td>HotStart Taq PCR StarMix</td><td>Genstar</td><td>A033-101</td><td>用于PCR反应</td></tr><tr><td>智能人工气候箱</td><td>TENLIN</td><td>PRX-1000A</td><td>用于培养斑马鱼胚胎</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>拍摄时用于固定斑马鱼</td></tr><tr><td>Microloader移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>mMACHINE试剂盒&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mut Express II快速定点突变试剂盒V2</td><td>Vazyme</td><td>C214-01</td><td>用于定点突变的试剂盒</td></tr><tr><td>气动显微注射仪</td><td>ZGene Biotech</td><td>ZGPCP-1500 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>pT3TS-zSpCas9</td><td>Addgene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>用于RNA纯化的试剂盒</td></tr><tr><td>Sanger测序服务</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠，颗粒状</td><td>Sangon</td><td>A100173-0500</td><td>基因组提取中使用的NaOH</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>SZX10</td><td>用于表型拍照</td></tr><tr><td>SZ系列变倍体视显微镜</td><td>CNOPTEC</td><td>SZ650</td><td></td></tr><tr><td>T3 mMESSAGE</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td>用于体外转录的试剂盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TIANprep迷你质粒提取试剂盒</td><td>TIANGEN</td><td>DP103-03</td><td>质粒提取试剂盒</td></tr><tr><td>TIANquick迷你纯化试剂盒</td><td>TIANGEN</td><td>DP203-02</td><td>用于线性化质粒纯化的试剂盒</td></tr><tr><td>三卡因</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>用于麻醉斑马鱼</td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷</td><td>Sangon</td><td>A600194-0500</td><td>基因组提取中Tris&amp;middot;HCl的组分</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;XbaI&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>用于质粒线性化的限制性内切酶</td></tr></tbody></table>

利用zspry-abe8e实现高效无pam限制的碱基编辑以构建斑马鱼人类遗传病模型

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 技术提高了斑马鱼在模拟人类遗传疾病、研究疾病发病机制以及药物筛选中的价值。然而，原间隔序列邻近基序（PAM）的限制仍是构建由单核苷酸变异（SNVs）引起的人类遗传病精准动物模型的主要障碍。迄今为止，一些具有广泛PAM兼容性的SpCas9变体已在斑马鱼中显示出编辑效率。优化后的SpRY介导的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）、zSpRY-ABE8e以及合成修饰的gRNA在斑马鱼中的应用，实现了不受PAM限制的高效腺嘌呤-鸟嘌呤碱基转换。本文描述了一种利用zSpRY-ABE8e在斑马鱼中实现高效腺嘌呤碱基编辑且不受PAM限制的实验方案。通过将zSpRY-ABE8e mRNA与合成修饰的gRNA混合物注射到斑马鱼胚胎中，成功构建了一个携带精确突变的斑马鱼疾病模型，该突变模拟了核糖体成熟因子TSR2（tsr2）的一个致病位点。该方法为建立精准疾病模型以研究疾病机制和治疗方法提供了有价值的工具。

已报道TSR2基因突变可导致戴蒙德-布莱克凡贫血症（DBA）42。本研究利用i-Silence策略构建了携带tsr2（M1V）突变的DBA斑马鱼模型。通过使用zSpRY-ABE8e，成功将斑马鱼tsr2基因起始密码子中的腺嘌呤转换为鸟嘌呤（图3）。
Sanger测序结果的EditR分析显示，在tsr2起始密码子的腺嘌呤碱基位置存在A/G重叠峰（图4）。
将F0代创始个体与先前获得的tsr2杂合突变成鱼进行交配后，在受精后2天（dpf）于显微镜下观察胚胎表型。与对照组相比，部分胚胎表现出眼睛较小及心包肿胀的表型（图5）。随后使用0.03%三卡因麻醉胚胎，固定于4%甲基纤维素中，并进行拍照记录。
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本方案描述了如何在无PAM限制的情况下进行高效的腺嘌呤碱基编辑，以利用zSpRY-ABE8e构建精确的斑马鱼疾病模型。

利用zSpRY-ABE8e实现高效无PAM限制的碱基编辑以构建斑马鱼人类遗传病模型

CRISPR/Cas9 技术提高了斑马鱼在模拟人类遗传疾病、研究疾病发病机制以及药物筛选中的价值，但……

该方案使研究人员能够构建多种此前无法获得的与疾病相关的斑马鱼单核苷酸变异模型。PAM限制是构建精确动物模型的主要障碍，而zSpRY-ABE8e能够实现高效的腺嘌呤到鸟嘌呤的碱基转换，具有较低的脱靶突变率和宽松的PAN限制。该工具可用于构建精确的斑马鱼模型，以研究与单核苷酸变异相关的致病特征和疾病机制，以及开展针对此类疾病的药物筛选。首先，设置微电极拉制仪系统并预热至少30分钟。拉制玻璃毛细管时，选择一个程序，将斜率测试值设为加热，拉力设为50，速度设为100，时间设为50，压力设为30。接着，安装毛细管，确保其位于凹槽内。按下“拉制启动/停止”按钮以运行程序。为保存拉制好的毛细管，将其插入带有缝隙的泡沫中，使针头保持悬空状态。实验时使用文中所述的zSpRY-ABE8e mRNA，以及两端经2'O-甲基硫代磷酸修饰的easy edit sgRNA。在设计gRNA时，优先选择NRN作为PAM序列，因为zSpRY-ABE8e对NRN PAM的偏好性高于NYN PAM。目标腺嘌呤核苷酸应位于原间隔序列第3至第9个核苷酸之间的高活性编辑窗口内。在注射前一晚设置好交配用鱼缸。插入隔板，将两条雌性斑马鱼和一条雄性斑马鱼放入每个水箱中。在每个水箱上加盖。次日早晨，使用无RNase的枪头、离心管和手套，将解冻的mRNA和EEgRNA在冰上混合，终浓度分别为每微升400纳克和每微升200纳克。配置气动显微注射器时，首先关闭气泵的减压阀。然后打开主阀门，拧开气瓶，并将减压阀的压力调节至 0.2 兆帕。现在打开显微注射器，并将模式设置为定时模式。将参数压力阀调节至20磅每平方英寸，定时器值调节至0.040秒。在体视显微镜下，使用精细镊子以倾斜角度折断拉制的玻璃毛细管针头。使用微量加样器吸头，将mRNA/gRNA混合物加入玻璃毛细管尖端，并将针头安装到显微操作器上。使用微毛细管，设置压力和定时器参数，使每次注射产生两纳升的混合液。鱼类交配10至15分钟后，用滤网收集卵子。在体视显微镜下观察细胞阶段和卵子质量。选择单细胞期卵子进行显微注射，以提高基因编辑效率。将卵子排列在1.5%琼脂糖注射板上，利用显微镜将2纳升RNA混合物注入胚胎细胞中。将注射后的卵子收集至培养皿中，加入E3缓冲液，并在28°C条件下孵育。移除未受精卵，并在受精后48小时内每12小时更换一次培养缓冲液。受精后48小时，将六枚随机选取的已注射胚胎分为三组，收集至PCR管中。待六枚随机选取的对照组胚胎收集完毕后，使用移液器吸除残留的E3缓冲液。向胚胎中加入 40 微升 50 毫摩尔的氢氧化钠。将试管置于 95 摄氏度的金属浴中孵育 20 分钟，然后涡旋 15 秒。向每个试管中加入 4 微升 pH 为 8 的 1 摩尔 Tris 盐酸盐。在室温下以 2000g 离心 10 秒。将上清液转移至新的 PCR 管中。从 PCR 管中取出 1 µL 上清液用于 Sanger 测序。然后将剩余的上清液保存在 20 摄氏度。为分析 Sanger 测序数据，首先将测序文件上传至“上传 ab1 文件”框中。将 20 个碱基对的 gRNA 序列以 5' 到 3' 方向输入“输入 gRNA 序列”框中。在“5'端起始”和“3'端结束”框中输入相应的碱基位置。点击“预测编辑”并检查测序数据质量，以获得碱基编辑效率。通过将Tsr2基因起始密码子中的腺嘌呤转换为鸟嘌呤，构建了钻石-黑扇型贫血斑马鱼模型。EditR 对序列数据的分析显示，在 Tsr2 起始密码子的腺嘌呤碱基处存在 AG 重叠。两天大的 Tsr2 胚胎表型显示，与对照组胚胎相比，眼睛更小。在突变胚胎中还观察到心包肿胀。为了实现高效的碱基编辑，请严格遵循前述的指南设计原则，这是实验成功的基本前提。精确的模型对于单核苷酸变异相关疾病的研究至关重要。SprY-ABE8e 的开发为精准建模提供了有效工具，有助于推动疾病机制及治疗策略的研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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