Name: 硬膜下软皮质电图 （ECoG） 阵列植入和小型猪的长期皮质记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 了解在小型猪体内植入软质硬膜下电极阵列并进行长期皮层记录的方法。该技术通过电生理监测和体内成像评估慢性皮层装置的安全性与有效性，为神经假体开发提供可靠的动物模型。

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作者感谢Bertarelli基金会以及瑞士国家科学基金会（SNSF）Sinergia项目（CRSII5_183519）提供的资金支持。作者还感谢洛桑联邦理工学院（EPFL）的Katia Galan在组织学染色方案开发方面的帮助，感谢日内瓦Wyss生物与神经工程中心神经微系统平台工作人员在器件制备过程中的协助，感谢日内瓦大学（UNIGE）日内瓦大学医学中心（CMU）动物实验平台工作人员在小型猪的动物护理、手术协助及术后管理方面的支持（John Diaper、Xavier Belin、Fabienne Fontao和Walid Habre），感谢日内瓦大学生物医学成像中心（CIBM）团队成员（Julien Songeon、François Lazeyras和Rares Salomir）的帮助，感谢日内瓦大学医院（HUG）病理科工作人员（Sami Schranz、Francesca Versili、Ruben Soto和Coraline Egger）的协助，以及感谢格勒诺布尔-阿尔卑斯大学（Université Grenobles-Alpes）的Blaise Yvert在慢性小型猪实验方面的建议与交流。作者还感谢Neurosoft Bioelectronics SA公司的员工（Benoit Huguet和Margaux Roulet）在器件制备过程以及小型猪实验中提供的帮助。

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F.F. 和 S.P.L. 是 Neurosoft Bioelectronics SA 的联合创始人及股东，该公司致力于开发柔性电极阵列。

本文报道了一种用于长期植入和评估柔性ECoG阵列的方法。在本研究中，我们设计了一种稳定且微创的手术方案，用于在双侧颞叶（此处靶向听觉皮层）表面植入功能性电极网格。首先，我们通过在整个研究期间（6个月）成功记录诱发电位，并追踪电极的电化学特性（见图6），评估了电极网格的功能性。其次，我们通过使用磁共振成像（MRI）并建立完全兼容MRI的系统，在活体（in vivo）条件下评估了网格的生物安全性；同时，通过设计组织取材和免疫染色的实验流程，在死后进行了组织学评估。
为了尽量减少侵入性，我们优化了开颅窗的尺寸。为了到达位于颞叶的听觉皮层并避免切除颞肌，我们开发了一种将植入物在硬脑膜下进行滑入的技术。该技术可显著减少脑组织暴露的表面积，同时仍能到达较远的目标区域。尽管此类植入看似缺乏直视引导，但在设备上设置可在术中X光平片中显影的放射显影标记物，能够验证植入位置，并确保电极阵列在硬脑膜下未发生折叠。在我们进行的多次实验中，硬脑膜下滑入技术已被证实是安全的。此外，采用狭缝状切开硬脑膜的方式可最大程度减少开颅期间脑组织的膨出，并便于在植入物周围直接闭合硬脑膜，无需使用人工硬脑膜等可能影响炎症反应的附加材料。最后，该手术方法的优势在于其可推广性，通过调整立体定位坐标、开颅位置以及可定制的设备尺寸，该技术能够覆盖大脑皮层的大部分区域。
本文所介绍的手术方法，以及功能评估和随时间推移对生物整合性的研究，并不仅限于本报告中使用的柔性电极技术。其他正在开发用于临床转化的硬膜下电极也可采用相同的方案进行评估。该方法的优势在于，大多数组件（如电缆和基座）均为模块化、可个性化设计，并可根据被测设备的具体需求进行调整。此外，也可使用皮层内或深部穿透探针，单独使用或与硬膜下电极联合使用，仅需相应调整开颅和硬脑膜切开的几何形状即可。随后可将这些长期结果与其临床对应物进行比较，正如我们在本研究中所做的那样。
本方法的一个主要局限在于小型猪颅骨中存在鼻窦，这些鼻窦在出生后第一年内逐渐发育12。因此，需要考虑的重要因素包括植入时动物的年龄及其体型大小。在成年颅骨上实施开颅手术会破坏鼻窦的完整性，从而在慢性实验条件下导致严重感染的高风险。这些鼻窦在术前的X光平片和CT扫描中可见。另一方面，若在动物过小、颅骨仍处于快速生长和重塑阶段时过早进行慢性植入，也并非理想选择。我们推测，术后颅骨的&#34;移动&#34;可能导致植入物移位或折叠，最终对实验造成不利影响。本研究发现，植入时年龄约为5至6个月、体重约8&#160;kg的哥廷根小型猪可获得最佳实验结果。
为了评估植入式硬膜外皮层脑电图（ECoG）在电生理记录中的性能，我们建立了一种快速的听觉诱发电位（AEP）记录方案，该方案可用于自由活动的动物以及在镇静状态下进行记录。该方案包括在几分钟内呈现一系列特定频率的声学纯音短声刺激。此类方案的优势在于，可通过减少探测频率的数量，根据可用的记录时长灵活调整实验参数。在麻醉状态下记录皮层信号时，一个挑战是在分析和比较数据时必须考虑动物的意识水平。
通过观察提取脑组织的质量，我们逐步优化了灌注方案。实际上，我们发现仅插管颈动脉而不插管颈外静脉更为简便。最初，文献中描述的方法包括插管颈外静脉以排出废液20。但在实际操作中，这种方法限制了液体从脑组织中的流出，导致血液清除不充分，整体灌注质量下降。通过切断颈外静脉，并让液体直接流入动物所处的大容量容器中，可显著提高灌注效率。
我们开发了一种可靠的组织制备方法，可与常规用于炎症示踪的抗体兼容。出于操作便利性考虑，我们将大脑分为两个半球，因为猪脑的一半可适配标准显微镜载玻片，从而兼容组织学实验室中大多数现有的成像设备。通过将脑组织切割成若干组织块，可直接接触目标区域，而无需对整个脑组织进行进一步切片或大量修剪。40 µm 的脑切片可收集于标准多孔板中，并采用游离漂浮法进行染色，其操作流程与其它物种的免疫染色相比无需重大调整。此外，也可通过例如 CLARITY 方法实现全脑免疫染色21。
总体而言，本方案涵盖了个性化植入体设计、植入手术、功能随访及生物安全性评估，具有良好的稳健性和可重复性。我们在此证明了其用于研究听觉系统的可行性，但该方案也可推广应用于其他生理功能的测试。此外，本方法的优势在于不仅限于小型猪，还可完全适用于绵羊、山羊或非人灵长类等其他物种。在一定程度上，该方法也可便捷地 adapted 用于大鼠。

神经系统损伤和疾病可通过皮层脑电图（ECoG）阵列进行诊断或治疗。这些电极网格被植入大脑表面，可用于记录或刺激人类大脑皮层1。例如，在药物难治性癫痫的情况下，它们有助于界定需要切除的致痫区域2。在脑机接口等长期应用中，这些皮层电极可用于记录大脑的运动意图，以控制瘫痪患者的机械肢体3。然而，目前的电极网格由嵌入刚性聚合物基底中的坚硬金属块制成，无法满足高分辨率脑电记录和长期硬膜下生物整合（&#62;30 天）的需求。相反，它们会引发局部组织反应，导致植入设备被纤维化包裹，从而随时间推移性能下降。近年来，已提出采用微加工技术制造的薄型聚合物基底的柔性或可拉伸电极阵列，以通过减少组织反应实现长期植入的高性能表现4,5。然而，这些新型植入技术仍需开展临床前研究，以验证其长期功能性和安全性，从而推动其向临床患者的转化应用。在此背景下，由于小型猪和猪模型器官尺寸较大且易于动物操作，已在其他医学领域（如心血管、骨骼或胃系统）的器械开发中被常规使用6,7,8。然而，针对神经生理学脑部应用的研究在文献中报道较少，主要受限于手术入路以及在活体动物上整合植入系统的技术难题9,10,11,12。这些方法通常难以适用于活体动物的慢性植入，因为可能需要开发复杂的硬件，例如可植入的嵌入式电子设备。此外，这些研究往往未考察植入系统对靶组织的影响，而这一点在转化研究的生物安全性评估中至关重要。猪模型在皮层结构、颅骨以及皮肤厚度方面与人类解剖结构相近13。此外，其具备学习行为任务的能力，使其成为研究功能康复策略或感觉感知的有力模型14。
将新技术和疗法转化至人体应用，必须按照相关医疗监管机构的要求，对其安全性和有效性进行评估。这些要求通常在技术文件和规范中有详细说明15，但这些规范仅要求通过基本测试，通常并不涉及对植入装置实际效应的深入研究，或在安全性研究的同时收集其他有用数据。为了全面评估脑部植入物的生物安全性和性能，本文在猪模型中开展了一项纵向、系统性的研究，内容包括脑部影像数据的采集、电生理测量、对植入电极电化学特性的评估，以及动物死亡后的组织病理学分析。为实现这一目标，需综合考虑多个关键方面，以建立一个完整的实验模型：（i）采用微创手术方式植入装置，并配备机械稳定的经皮接口以连接电极；（ii）建立可靠的电生理记录方案，能够在麻醉状态和自由活动状态下，均有效评估植入电极的性能输出；（iii）在多个时间点进行in vivo成像（计算机断层扫描 [CT] 和/或磁共振成像 [MRI]），以追踪脑组织和植入物的演变过程，并评估植入系统与成像设备之间的兼容性；（iv）建立标准化的组织处理流程，用于取出脑组织并进行组织学分析。
本文报道了在小型猪模型中进行软性ECoG阵列长期植入（6个月）及评估的方法（示意图见图1）。此类软性电极阵列已在我们先前的研究中报道，由嵌入弹性金薄膜作为导电通路的薄硅胶膜制成16,17。电极与组织的接触通过在硅胶基质中嵌入铂纳米颗粒实现，从而形成柔软且高效的脑组织电化学界面18。植入物通过一根柔性的电缆连接，该电缆经皮下和颅骨下隧道通向一个经皮端口，该端口固定于动物头部并容纳连接器。植入物的尺寸和形状可根据研究目标和需求进行定制。本研究中使用的电极条带与临床实际使用的条带尺寸一致。临床可用的硬质皮下条带和网格电极作为对照，采用相同方法植入。聚合物材质的磁共振兼容经皮端口通过底板系统固定于颅骨上，确保其牢固锚定。本文详细描述了从双侧大脑半球皮下植入到动物术后恢复的完整手术流程。我们以听觉皮层为例，作为目标脑区，在麻醉状态和自由活动状态下均通过声学刺激诱发脑电位。在不同时间点，动物在麻醉状态下接受脑部MRI扫描（对于临床电极则使用CT扫描），同时测量电极的电化学特性。采用电极表征方法监测植入物及其与组织界面的演变情况（详见Schiavone等人的研究19）。这些方法包括：利用计时安培法评估电极接触点的刺激能力；通过电化学阻抗谱（EIS）分析电极电阻性和电容性组分的变化；以及进行通道间电阻测量，以检测是否存在密封封装失效。最后，我们建立了一套组织提取流程，在动物安乐死后对其进行脑组织灌注，连同电极一并取出脑组织，进行切片，并使用多种炎症标志物开展组织学分析。总体而言，该方法可为未来脑部新技术和疗法的临床转化提供具有稳健多模态数据支持的临床前研究基础。

<table><tbody><tr><td>骨钻</td><td>BBraun</td><td>Elan 4 配&amp;nbsp;GA861 手柄</td><td></td></tr><tr><td>骨钻头</td><td>BBraun</td><td>Neurocutter GP204R</td><td></td></tr><tr><td>骨蜡</td><td>Ethicon</td><td>W31G</td><td></td></tr><tr><td>导管</td><td>Venisystems</td><td>Abbocath 14G</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>明胶海绵</td><td>Pfizer</td><td>Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>插入式耳机</td><td>Etymotic</td><td>Etymotic ER2 插入式耳机</td><td></td></tr><tr><td>万用表</td><td>Fluke</td><td>Fluke 1700</td><td></td></tr><tr><td>示波器</td><td>Tektronix</td><td>MDO3014 混合域示波器</td><td></td></tr><tr><td>灌注泵</td><td>Shenzen</td><td>LabS3/UD15</td><td></td></tr><tr><td>恒电位仪</td><td>Gamry Instruments</td><td>Reference 600</td><td></td></tr><tr><td>一抗 Anti-GFAP</td><td>Thermofischer</td><td>Anti-GFAP, 大鼠, # 13-0300</td><td></td></tr><tr><td>一抗 Anti-Iba1</td><td>Fujifilm</td><td>Anti Iba1, 兔, 019-19741</td><td></td></tr><tr><td>一抗 Anti-NeuN</td><td>SigmaAldrich</td><td>Anti-NeuN, 豚鼠, ABN90</td><td></td></tr><tr><td>脉冲发生器</td><td>AM Systems</td><td>Model 2100 隔离式脉冲刺激器</td><td></td></tr><tr><td>记录头级</td><td>Multichannel systems</td><td>W2100-HS32</td><td></td></tr><tr><td>记录系统</td><td>Multichannel systems</td><td>W2100</td><td></td></tr><tr><td>螺丝刀</td><td>Medtronic</td><td>手柄: 001201, 杆: 8001205</td><td></td></tr><tr><td>二抗 488</td><td>Thermofischer</td><td>山羊抗大鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗, Alexa Fluor 488, # A-11006</td><td></td></tr><tr><td>二抗 555</td><td>Thermofischer</td><td>山羊抗豚鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗, Alexa Fluor 555, # A-21435</td><td></td></tr><tr><td>二抗 647</td><td>Thermofischer</td><td>山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗, Alexa Fluor 647, # A-21245</td><td></td></tr><tr><td>切片扫描仪</td><td>Olympus</td><td>VS120</td><td></td></tr><tr><td>速冻装置</td><td>Excilone</td><td>Excilone Snapfrost</td><td></td></tr><tr><td> stab刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>10316-14</td><td></td></tr><tr><td>皮肤缝合线</td><td>Ethicon</td><td>Vicryl 2-0</td><td></td></tr><tr><td>硬脑膜缝合线</td><td>Ethicon</td><td>Mersilk 5-0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>导管固定缝合线</td><td>Ethicon</td><td>Vycril 3-0 无针</td><td></td></tr><tr><td>提拉硬脑膜用缝合线</td><td>Ethicon</td><td>Prolene 6-0 配 BV-1 针</td><td></td></tr><tr><td>皮下缝合线</td><td>Ethicon</td><td>Vicryl 4-0</td><td></td></tr><tr><td>钛桥</td><td>Medtronic</td><td>TiMesh 015-2001-4</td><td>裁剪至所需尺寸</td></tr><tr><td>钛螺钉</td><td>Medtronic</td><td>9001635, 9001640</td><td></td></tr><tr><td>X射线系统</td><td>GE</td><td>GE OEC 9800 Plus C型臂</td><td></td></tr></tbody></table>

皮层下柔性脑皮层电图（ecog）阵列植入及小型猪长期皮层记录

Subdural Soft Electrocorticography (ECoG) Array Implantation and Long-Term Cortical Recording in Minipigs

神经功能障碍和神经系统疾病的诊断与治疗可采用皮层脑电图（ECoG）阵列。在耐药性癫痫中，这些阵列有助于明确需切除的致痫区域。在脑机接口等长期应用中，这些皮层电极用于记录大脑的运动意图，以控制瘫痪患者的机械肢体。然而，目前刚性电极网格尚无法满足高分辨率脑信号记录和长期生物整合的需求。近年来，可延展电极阵列被提出，旨在实现长期植入稳定性与高性能记录。然而，这些新型植入技术仍需开展临床前研究，以验证其长期功能性和安全性，从而推动其向临床患者的转化应用。在此背景下，由于猪模型器官尺寸较大且动物操作方便，常被用于医疗器械的开发。然而，文献中报道的猪脑相关应用仍较少，主要原因在于手术操作的限制以及植入系统在活体动物上的整合困难。
本文报道了在小型猪模型中对柔性ECoG阵列进行长期植入（6个月）及评估的方法。研究首先介绍了植入系统，该系统由一种柔软的微加工电极阵列组成，该阵列与一个磁共振成像（MRI）兼容的聚合物经皮端口集成，该端口内含用于电生理记录的仪器连接器。随后，研究描述了从硬膜下植入到动物术后恢复的完整手术流程。我们以听觉皮层为例，展示通过声学刺激诱发脑电位的靶向区域。最后，我们描述了一套数据采集流程，包括全脑MRI成像、植入电极的电化学表征、术中及自由活动状态下的电生理记录，以及取出脑组织后的免疫组织化学染色分析。
该模型可用于研究新型皮层假体设计的安全性和功能，是设想将其转化为人类患者应用所必需的临床前研究。

为了确认装置的位置（图3A）和功能，在基台放置后术中进行电生理记录。首先，在无刺激条件下记录2分钟的基础信号，作为基础活动的对照。其次，使用不同频率（500-20,000 Hz）的声调脉冲对动物进行声学刺激，并对刺激期间的原始数据进行平均，以绘制阵列上的听觉诱发电位（例如，800 Hz时与基础状态的比较；图3B）。此处显示的数据未经处理，但如果噪声过大，可应用陷波滤波器和带通滤波器。手术室中常见的噪声来源包括加热垫、已插入电源的钻头、吸引器或电凝器（以及其他设备），应在数据采集前移除。在清醒状态下的记录中，应避免头部周围的大范围肌肉运动（如咀嚼），以获得更清晰的数据集。
该方案应用于每次记录的时间点，可对单个通道的信号进行时间上的比较。一个示例如图3C所示，展示了反应的稳健性及其演变过程。通过计算每个时间点基线信号的标准差，可评估各电极触点在整个实验过程中的记录能力（图3D）。在本研究中，信噪比在第0天至第6个月期间逐渐下降并趋于稳定，尽管由于记录时间较短（即2分钟）而存在一定的波动性。这一变化可进一步与电极阻抗相关联。
术后进行体内成像以评估脑部状态和植入物的位置。在本方案的首次实施中，未进行术中X射线检查，导致植入设备发生折叠，这一点在图4A的T1加权MRI序列中可见（另见图4B）。动物未表现出行为改变，但随着时间推移，由于植入部位周围脑组织受到宏观压迫，导致设备周围出现纤维化包裹（图4C）。基于此次经验，后续引入了术中X射线检查，如图4D所示，其中放射显影标记物（见插图图4D中植入物上的黑色条带）位置良好。此后，脑表面保持完整，可在术后MRI图像中观察到（图4E）。总体而言，采用该植入物与基座系统可实现全脑成像。冠状面的不同成像序列可显示解剖结构（图4F、G；T1和T2 MRI序列）或植入物周围液体及血液的存在情况（图4H；TSE加权MRI序列）。基座系统几乎不产生伪影，仅在钛螺钉周围出现少量低信号暗区（见图4G）。此外，本研究中使用临床电极作为对照，但由于发热和安全性问题，这些电极无法进行MRI成像。因此，对这些动物进行了CT扫描，结果如图4I所示。电极清晰可见，且基座系统未影响图像质量。
植入期结束后，对动物进行灌注并取出脑组织。本研究中，炎症反应的分析分别在每个半脑独立进行。将脑组织一分为二有利于切片前的组织处理，并且其优势在于切片可直接贴附于标准显微载玻片上。下图显示了一个脑组织样本在（图 5A）以及之后（图5B）切成块状。植入物的轮廓清晰可见，并在脑组织上形成了一个小凹陷。通过平行切面进行切割，组织已与冷冻切片机对齐，可直接切片，无需修片即可避免组织损失。图5C）。染色完成后，对整个组织切片进行成像（图5D），例如，神经元层的细节清晰可见（参见NeuN标记）。整个切片较为脆弱，有时可能导致部分组织丢失（参见底部 图 5D），但感兴趣区域保持完整。通过40倍共聚焦显微镜成像的近距离观察，细胞轮廓清晰，可对炎症标志物等进行精细研究（图5E可进一步进行定量分析，以比较对照组与植入侧半脑之间的炎症反应。 图6 显示植入电极的电化学表征。 体外 柔性电极阵列的电化学阻抗谱，显示了阻抗模量和相位 图6A 以及植入后6个月内1 kHz时的阻抗模量如图所示 图6B.
<img alt="硬膜下ECoG阵列植入示意图，磁共振兼容，长期皮层记录，小型猪。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：实验示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="手术操作流程：开颅、切口置入、足板设置及用于研究的基座。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：软质 ECoG 在脑部的微创植入。（A）颅骨手术入路，标示出前囟位置。（B）双侧开颅，硬脑膜清晰可见。（C）第一侧半球的硬脑膜切开。（D）软质 ECoG 的硬膜下植入及硬脑膜闭合。（E）第二侧半球的硬脑膜切开；使用钛桥固定第一侧半球骨瓣。（F）第二侧半球软质 ECoG 的植入及硬脑膜闭合。（G）第二侧半球骨瓣的固定。（H）足板在颅骨上的定位。（I）将基座固定至足板上。（J）围绕基座底部的皮肤缝合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑刺激示意图；听觉诱发电位幅度图和反应分析图表；神经科学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：听觉诱发电位的记录。（A）颞叶表面电极放置的示意图。（B）基线活动（灰色轨迹）和对800 Hz声调脉冲刺激的听觉诱发电位（紫色轨迹）的代表性图谱。每条平均轨迹对应柔性ECoG阵列上的一个通道。平均过程由声音刺激的模拟输入信号触发。左下角的一个通道中标注了“开启”（ON）和“关闭”（OFF）声学刺激时段。（C）单个通道在声学刺激后的反应随时间的变化（第0天、第2个月和第5个月），与无刺激时的基线信号（灰色）进行比较。平均过程由声音刺激的模拟输入信号触发。“开启”和“关闭”刺激时段在底部标出。“开启”刺激的诱发电位用箭头标示。（D）基线记录中每个时间点各通道的标准差（彩色圆点）。中位数值以粗体蓝色表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑部 MRI 与 CT 序列；T1、T2 加权、灰度扫描及用于诊断的植入方法" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4: 体内 脑部成像与植入电极的影像。 (A) 术后冠状位 T1 加权 MRI。箭头指示折叠的植入物。B) 放大部分的 A，其中植入物的折叠在脑组织上形成一个凹痕。 (C植入1个月后的T1加权MRI，显示由于脑部在相同位置发生纤维化包裹，导致脑组织受压 C. (D术中X光平片验证植入物位置及无折叠，通过显影标记物位置观察确认。插图：可见显影标记物的植入物照片。E术后冠状面T1加权MRI，显示植入物位置理想。F) 植入后1个月的T1加权MRI。G) 植入后1个月的T2加权MRI。箭头指示固定颅骨足板的钛钉所产生的成像伪影。H) 植入后1个月的TSE加权MRI。I) 植入临床电极的动物的CT扫描图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠脑切片、包埋、免疫染色；荧光显微镜；GFAP、NeuN、Iba1 标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5：长期植入后脑组织的组织学分析。 （A）取出并灌注后的脑组织——左半球照片。（B）灌注后的脑组织在冷冻前被切割成组织块。（C）冷冻切片机上完整组织块切片装置的照片；可对整个“预切组织块”进行切片。（D）整个半脑的免疫染色成像（切片扫描仪，20倍物镜），以及（E）皮层最表层的局部放大图像（共聚焦成像，40倍物镜），显示胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="电化学阻抗谱结果；频率与模量、相位及体内阻抗的关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64997/64997fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6植入电极的电化学表征。 (A) 体外 柔性电极阵列的电化学阻抗谱（每通道以灰色细线表示，红色为平均值），包括阻抗模量（上图）和相位（下图）。B) 植入后6个月内1 kHz阻抗模量的变化（蓝色为平均值；灰色线为各个通道） 体外 测量值以红色标示作为参考。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/64997fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图1：与MRI兼容的基座。（A）用于连接柔性电极阵列的慢性植入式、与MRI兼容的经皮连接系统（基座）。（B）带有电极的基座，其电极已安装在用于颅骨固定的底板上。插图：底板的细节。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/FigS1_Pedestal.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 2：优化脑灌注的手术通路。 （A）切开皮肤，暴露颈动脉和颈外静脉的位置。（B）解剖血管周围的组织。（C、D）识别并解剖颈动脉和颈外静脉周围的组织。（E）将颈动脉从其下方组织中分离出来。（F）将颈外静脉从其下方组织中分离出来。（G）在颈动脉周围放置缝合线（缝合线 1 和缝合线 2）以及在颈外静脉周围放置缝合线（缝合线 3）。（H）在颈动脉根部（靠近心脏一侧）结扎缝合线 3，以防止血管切开时出血。（I）在与 H 相对的一侧夹闭颈动脉。（J）切断颈动脉。（K）将导管插入 J 所示切口处。插图：用注射器将生理盐水从导管末端冲洗导管，使其预充填。（L）结扎缝合线 2，以固定导管位置并使其贴合动脉走向。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/FigS2_Catheter.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1：T1加权（第1-2页）、T2加权（第3-4页）和TSE加权（第5-6页）MRI序列的参数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/Supplementary%20File%201_MRIparameters.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：用于染色脑切片全片成像的切片扫描仪元数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/Supplementary%20File%202_Metadata%20Slide%20Scanner%20(1).pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件3：染色脑切片放大区域共聚焦成像的元数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64997/Supplementary%20File%203_Original%20Metadata%20-%20confocalsettings.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种在小型猪模型中对柔性硬膜下电极阵列进行长期性能与安全性评估的方法，详细描述了手术方法与工具、术后磁共振成像、听觉皮层的电生理学特性、植入物的电化学特性以及死后免疫组织化学分析。

皮层下柔性脑皮层电图（ECoG）阵列植入及小型猪长期皮层记录

神经功能障碍和神经系统疾病的诊断与治疗可采用皮层脑电图（ECoG）阵列。在耐药性癫痫中，这些阵列有助于……

该模型有望成为评估慢性皮层器件在生物相容性、分辨率和信号质量方面安全性和有效性的标准。我们的实验流程描述了一种可重复且可扩展的方法，用于对器件的安全性和有效性进行长期随访评估，包括随时间推移的神经监测，以及体内和离体成像。我们的方法将有助于感觉和运动皮层神经假体的开发。该方法是一种用于理解大脑皮层网络大规模活动的工具。此方法可用于基础神经科学，以研究不同皮层区域之间的功能连接性。也可应用于其他大型动物模型。手术方法需要一定的练习，可先在尸体或急性实验中掌握。随后，测量过程将相对简单直接。首先，使用手术刀沿中线切开麻醉动物的皮肤。用骨刮匙分离肌肉和骨膜，并放置牵开器以获得最佳操作视野。进行开颅手术时，使用带圆形切割钻头的骨钻，根据X光片测量的颅骨厚度，钻出开颅轮廓。用生理盐水冲洗钻孔位置，以避免骨骼过热。小心均匀地钻出轮廓，直至到达硬脑膜。在首次穿透时，继续完成轮廓的钻孔，直到其变薄至几乎穿透为止。然后使用平头刮勺，以开颅边缘为支点，将骨瓣完整地撬下。进行硬脑膜切开时，取6-0缝合包中的针头，在开颅窗的前端或后端、内外侧中点处，小心刺破并提起硬脑膜，再用刺刀式刀片开始切口。随后将一小片平头刮勺插入硬膜下腔，作为切割基底以保护皮层。使用两件工具同时向前推进，在硬脑膜上创建一个前后方向的切口。确保切口略大于植入物的宽度。将植入物置于硬脑膜切口上方，用小型镊子沿切口边缘依次滑动，将其插入硬脑膜下腔。小心握住装置的基座端，并推动植入物以避免产生阻碍插入的张力。当连接器边缘到达切口上方时，停止插入。为固定植入物，可在颅骨开孔边缘或锚定翼片上方的导线处放置一个钛桥，并使用合适的螺丝刀用一或两个钛螺钉将其固定。接下来，仔细将硬脑膜在植入电缆周围缝合。使用3-0可吸收缝线和小型持针器，尽可能将硬脑膜两侧边缘对合，注意避免缝线撕裂这一薄层膜结构。进行骨瓣复位时，使用钛钉将钛桥固定在每块骨瓣的前部和后部。将钛合金桥接器的末端拧入颅骨。接下来，规划底板的方向，以确保所有支脚均可拧入颅骨。然后通过拧入底板的钛合金螺钉，将底板固定到位，直至其牢固稳定。然后将基座拧紧到足板上。使用4-0不可吸收缝合线，在皮下进行缝合，针距为3毫米。从远离基座的位置开始，沿切口两侧向基座方向进行缝合。接下来，使用6-0不可吸收缝合线缝合皮肤，关闭真皮层，缝线间距为5毫米。从基座远端开始，沿切口两侧向基座方向进行缝合。注意使两个皮瓣之间及基座边缘附近实现良好的组织对合，以避免出现空隙。将无线头戴装置插入动物体内时，可通过手持固定动物或用零食喂食使其分心，随后记录清醒状态下的脑信号。记录信号时，应确保将放大器天线和外置扬声器放置在猪笼附近。可在电极阵列上绘制无声音刺激时的基线活动以及对800赫兹短声刺激产生的听觉诱发电位。单个电极通道中的听觉诱发电位随时间变化情况以图示显示，箭头标记了“开启”反应，同时展示了基线活动作为对照。体内成像在术中和术后进行，以评估脑状态和植入物的位置。术中平面X光片验证了植入物的位置，未见由放射显影标记物显示的折叠现象。术后MRI显示脑表面保持完整。总体而言，利用该植入物及基座系统，在整个植入期间可实现全脑成像，以观察解剖结构或植入物周围液体及血液的存在情况。此外，本研究使用临床电极作为对照，但由于加热和安全问题，这些电极无法在 MRI 中成像，需进行 CT 扫描。所展示的流程能够实现全脑提取和切片，以对整个脑半球进行成像。对整块组织切片的成像显示出了清晰的神经元层。在20倍共聚焦成像下，细胞轮廓清晰，可对炎症标志物进行精细研究。通过电化学表征提取了器件的阻抗模量和相位，并在植入后的六个月内持续监测1千赫兹下的变化。必须仔细选择动物的年龄和大小，以避免手术过程中打开鼻窦。这将影响慢性实验的结果。在暴露硬脑膜或植入器件时，必须避免出血。这有助于防止进一步的并发症和炎症反应。一旦建立该模型，即可用于在小型猪中进行自由活动状态下的电生理记录，并采集大脑皮层感兴趣区域的神经活动信号。该方法可用于开发将要应用于人类的新型神经假体时，收集支持临床试验申报所需的生物安全性数据。

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