Name: 监测存根1介导的吞噬 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 了解Stub1介导的过氧化物酶体自噬机制，利用活细胞成像技术在人SHSY5Y和小鼠NIH 3T3细胞中研究活性氧应激下的过氧化物酶体降解过程。该方法为细胞器质量控制研究提供了新工具。

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本工作部分得到了中国台湾国家科学与技术委员会资助项目MOST 111-2311-B-001-019-MY3的支持。

1. 准备表达二聚化KillerRed或过氧化物酶体腔内自标记蛋白（SLPs）的细胞
<ol>
	<li>在玻璃底细胞培养皿中接种所需细胞。本实验中，在直径为35 mm、带有直径20 mm玻璃微孔的培养皿中，接种2 × 105个人源SHSY5Y细胞于840 µL培养基（DMEM/F-12，添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素）中，或接种6 × 104个小鼠NIH3T3细胞于840 µL培养基（DMEM，添加10%牛血清和1%青霉素/链霉素）中。 
	注意：若使用其他规格的玻璃底培养皿，应根据玻璃微孔面积按比例调整接种细胞数量。</li>
	<li>将细胞置于5% CO2、37 °C条件下培养24小时。</li>
	<li>使用转染试剂将目标质粒转染至细胞中。
	<ol>
		<li>使用PMP34-TagBFP标记活细胞中的过氧化物酶体。为在过氧化物酶体腔内产生活性氧（ROS），可选用靶向过氧化物酶体的diKillerRed-VKSKL或SLP-VKSKL（联合染料标记的SLP配体）（通过光激活产生ROS）。在本方案中，我们使用自标记蛋白HaloTag-VKSKL21。为监测Stub1/Hsp70的转位、泛素化蛋白的聚集以及自噬体在受ROS应激的过氧化物酶体上的形成，分别转染EGFP-Stub1、EGFP-Hsp70、EGFP-Ub或EGFP-LC3B。为检测过氧化物酶体腔内的ROS生成，可将diKillerRed-VKSKL与定位于过氧化物酶体的荧光氧化还原探针roGFP2-VKSKL22共转染。</li>
		<li>对于SHSY5Y细胞的转染，将质粒稀释于55 µL无血清DMEM/F-12中，将1 µL转染试剂稀释于55 µL无血清DMEM/F12中。将稀释后的DNA与稀释后的试剂混合，轻轻混匀，并在室温下孵育30分钟。</li>
		<li>将上述复合物加入先前已接种SHSY5Y细胞并含有100 µL无抗生素培养基（含10%胎牛血清的DMEM/F-12）的20 mm微孔中。轻轻前后摇动培养皿。</li>
		<li>对于NIH3T3细胞的转染，使用低血清培养基替代无血清DMEM/F-12用于稀释质粒和转染试剂。将接种用的培养基替换为不含抗生素的NIH3T3细胞培养基（含10%牛血清的DMEM）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染2小时后，移除含转染试剂的培养基，加入1 mL新鲜培养基。将NIH3T3或SHSY5Y细胞在37°C、5% CO2条件下继续孵育24小时。 
	注意：也可使用其他细胞系研究Stub1介导的过氧化物酶体自噬（例如HeLa细胞）。</li>
</ol>
2. 使用染料标记的 SLP 配体对过氧化物酶体进行染色（用于光激活 ROS 产生）
<ol>
	<li>转染后24小时，移除培养基，向20 mm玻璃微孔中加入100 µL 200 nM HaloTag TMR配体或200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag配体。 
	注意：染料标记的SLP配体应使用各细胞系对应的培养基进行稀释。选择Janelia Fluor 646标记的配体可保留蓝色、绿色和红色荧光通道，用于后续荧光成像。</li>
	<li>将培养皿转移至37°C、5% CO2的培养箱中，染色1小时。染色结束后彻底移除染色液，并加入1 mL新鲜培养基。</li>
</ol>
3. 在激光扫描共聚焦显微镜上对过氧化物酶体进行活性氧应激处理
<ol>
	<li>将含有目标细胞的玻璃底培养皿置于配备载物台式培养箱的激光扫描共聚焦显微镜上。</li>
	<li>点击 工具窗口，选择 眼部，然后点击 DIA 按钮（图2A打开透射光源，通过显微镜目镜观察培养皿，并调节焦距旋钮使细胞清晰对焦。</li>
	<li>选择 激光扫描显微镜，然后点击 染料 &amp;#38; 检测器选择 按钮（图2B）。在弹出窗口中双击所需染料，以选择适当的激光器和滤光片设置，用于细胞成像（图 2C）。点击 Livex4 在 活体 启动快速激光扫描以开始检测细胞的荧光信号图 2D).</li>
	<li>使用操纵杆控制器移动载物台，找到表达 medium diKillerRed-VKSKL 或 SLP-VKSKL 的细胞，以对过氧化物酶体施加活性氧（ROS）应激。获取目标细胞的图像。</li>
	<li>点击 工具窗口，并选择 LSM 刺激 (图2E）。点击 椭圆 按钮，在实时图像窗口中使用鼠标绘制一个直径为 15 µm 的圆形 ROI（感兴趣区域）图 2F) 包含步骤 3.4 中获得的所需过氧化物酶体，将对其施加活性氧（ROS）应激（参见 图3 （例如）。</li>
	<li>为施加活性氧（ROS）应激，对转染diKillerRed-PTS1或用TMR标记SLP配体染色的细胞使用561 nm激光，对用Janelia Fluor 646标记SLP配体染色的细胞使用640 nm激光。</li>
	<li>选择用于施加活性氧（ROS）胁迫的激光波长。输入所需的激光功率百分比和持续时间（图 2G).</li>
	<li>点击 获取，然后点击 刺激 按钮（图 2H使用561/640 nm激光对ROI分别扫描30秒，以启动成像。此处所用共聚焦显微镜上，561 nm和640 nm激光的功率均设置为约5%。该操作将导致过氧化物酶体中活性氧（ROS）的产生。 
	注意：可选择不同大小的感兴趣区域（ROI）。应根据每个ROI的面积，按比例调整其照射时间。</li>
	<li>激光照射30秒后，ROI内的过氧化物酶体将失去其diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646信号。该信号的丧失使得能够区分细胞内被照射的与未被照射的过氧化物酶体（受损 vs. 健康）。</li>
</ol>
4. 通过延时成像在活细胞中监测过氧化物酶体自噬
<ol>
	<li>通过时间间隔为10分钟的延时成像，追踪EGFP标记的Stub1、Hsp70、Ub、p62或LC3B向受光照/活性氧（ROS）应激的过氧化物酶体的转位过程（示例见图3-7）。 
	注意：EGFP-Stub1或EGFP-Hsp70信号在光照后10–20分钟开始出现，并持续存在于所有受损的过氧化物酶体上，直至光照后约40分钟。EGFP-Ub信号在光照后30分钟出现，持续2–3小时。EGFP-p62的转位在光照后60分钟出现，而EGFP-LC3B信号则在光照后约3小时变得可见。</li>
	<li>使用ImageJ对受损过氧化物酶体上（来自Stub1、Ub、p62或LC3B）的EGFP信号进行定量分析。以下为使用ImageJ定量分析三通道图像（PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL）的操作步骤：
	<ol>
		<li>打开图像，使用椭圆选区或自由手绘选区圈定包含所有受光照过氧化物酶体的区域（PMP34-TagBFP信号阳性且HaloTag配体信号淬灭；图8A）。</li>
		<li>点击复制以提取PMP34-TagBFP通道（图8A）。通过下拉菜单图像 &#62; 调整 &#62; 阈值设置阈值，以标记过氧化物酶体（图8B）。</li>
		<li>选择分析 &#62; 分析颗粒，以确定受光照过氧化物酶体的精确区域。ImageJ将这些感兴趣区域（ROIs）记录在ROI管理器中（图8C）。</li>
		<li>点击复制以提取EGFP通道，用于分析EGFP偶联的Ub、p62或LC3B的荧光信号（图8D）。在ROI管理器中选择所有ROIs（图8E）。</li>
		<li>在ROI管理器中应用测量功能，以测定过氧化物酶体上的EGFP信号（图8E）。在结果表中查找每个ROI的面积和积分密度（所有像素强度之和）值（图8E）。</li>
		<li>为获得光照后不同时间点的平均EGFP荧光强度，将积分EGFP强度除以受光照过氧化物酶体的总面积（PMP34-TagBFP信号阳性且HaloTag配体信号阴性区域）。为获得过氧化物酶体上信号的累积量，用某一时间点的平均强度减去时间=0时的平均强度，再除以时间=0时的平均强度进行归一化处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 在培养皿中全局性破坏所有细胞中的过氧化物酶体
<ol>
	<li>执行步骤1（制备表达过氧化物酶体靶向的diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] 或 SLP [SLP-VKSKL] 的细胞）和步骤2（用SLP配体对过氧化物酶体进行染色[用于光激活产生活性氧]）。</li>
	<li>使用TMR标记的配体染色1小时后，移除染色培养基，并加入1 mL含有30 mM 3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑；一种过氧化氢酶抑制剂）的新鲜培养基。 
	注意：过氧化氢酶是一种在过氧化物酶体腔内表达的活性氧清除酶，因此使用3-AT处理有助于增强光照引发的过氧化物酶体氧化损伤。</li>
	<li>将培养皿置于LED光源（555–570 nm）上方，在培养箱中以1.8 W/cm2的功率密度照射所有细胞9小时。 
	注意：若在培养箱外进行此步骤，需将培养皿放置于37°C加热板上。在含3-AT的培养基中添加20 mM HEPES，并用透明封膜覆盖培养皿以减少气体交换。HEPES是一种缓冲剂，可在LED照射期间维持细胞培养在非CO2培养箱环境下的生理pH值。</li>
	<li>通过成像检测过氧化物酶体上的EGFP-Ub、EGFP-p62或EGFP-LC3B信号，验证LED诱导损伤的成功。根据上述光照条件，稳定表达HaloTag-VKSKL的SHSY5Y细胞中有82%表现出由Stub1介导的过氧化物酶体自噬（pexophagy）。</li>
	<li>收集细胞用于后续生化分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本方案详细描述了如何通过光照升高过氧化物酶体内的活性氧（ROS）水平，从而在细胞培养物中诱导Stub1介导的过氧化物酶体自噬（pexophagy）。由于该方案依赖于染料辅助的ROS生成，因此需要确保目标细胞中充分表达diKillerRed-VKSKL或染料标记的SLP配体。鉴于不同细胞类型或不同遗传背景的细胞其过氧化物酶体可能具有略微不同的特性，可能需要调整具体的光照条件以确保有效诱导过氧化物酶体自噬。检测Stub1介导的过氧化物酶体自噬是否被成功激活的一个可靠指标是观察EGFP-Ub是否在光照后转位至受照的过氧化物酶体上（光照后1小时）13。在健康细胞中，EGFP-Ub信号通常均匀分布于细胞质中，因此其向受照过氧化物酶体的转位易于观察。为优化光照条件，可调整光照强度或光照时间。在试图损伤过氧化物酶体时，应尽量避免对染料过度照射，因为某些染料可能发生光化学反应，干扰后续成像。例如，已有研究表明，KillerRed过度照射后会呈现微弱的绿色荧光。过度照射会在光照结束后立即在受照的过氧化物酶体上产生微弱的绿色信号23（这与基于EGFP的报告蛋白的...

过氧化物酶体是存在于大多数真核细胞中的单层膜细胞器。过氧化物酶体是一种重要的代谢区室，负责极长链脂肪酸的β-氧化、嘌呤降解以及醚磷脂和胆汁酸的合成1。过氧化物酶体来源的乙酰辅酶A通过调控代谢中的核心信号通路来维持脂质稳态2。因此，过氧化物酶体功能受损与多种疾病相关，包括神经退行性疾病、衰老、癌症、肥胖和糖尿病，这并不令人意外3,4,5。维持过氧化物酶体正常功能的一个关键过程是过氧化物酶体自噬（pexophagy）。过氧化物酶体自噬是一种通过自噬选择性降解过氧化物酶体的分解代谢过程。细胞利用过氧化物酶体自噬来调控过氧化物酶体的数量和质量，从而确保其正常功能。最近一项研究表明，由于PEX1和PEX6过氧化物酶体生物发生因子突变导致的过氧化物酶体丢失，是由于失控的过氧化物酶体自噬所致6。值得注意的是，在所有过氧化物酶体生物发生障碍（PBD）患者中，有65%存在哺乳动物细胞中由PEX1、PEX6和PEX26组成的过氧化物酶体AAA ATP酶复合物的缺陷7。
有多种方法可用于启动和研究过氧化物酶体自噬。在酵母中，当提供的营养物质从依赖过氧化物酶体的碳源转换为不依赖过氧化物酶体的碳源时（以降低细胞内过氧化物酶体数量），会触发过氧化物酶体自噬8。例如，将甲醇培养的Pichia pastoris细胞从甲醇培养基转移至葡萄糖培养基或乙醇培养基，可分别诱导微过氧化物酶体自噬和巨过氧化物酶体自噬8,9,10。微过氧化物酶体自噬通过重塑液泡形成杯状的液泡隔离膜和一种称为微过氧化物酶体自噬特异性膜结构（MIPA）的盖状结构，将成簇的过氧化物酶体隔离以进行降解。在巨过氧化物酶体自噬中，单个过氧化物酶体被双层膜结构（称为过氧化物酶体自噬体）包裹，随后与液泡融合以实现降解8,9,10。过氧化物酶体自噬受体（如Saccharomyces cerevisiae中的Atg36p和Pichia pastoris中的Atg30p）的磷酸化对于招募核心自噬机制以及促进过氧化物酶体靶向自噬体至关重要8,11。
在哺乳动物细胞中，过氧化物酶体自噬（pexophagy）可由泛素化诱导。在细胞质侧对过氧化物酶体膜蛋白 PMP34 或 PEX3 进行泛素标记，可诱导过氧化物酶体自噬12。PEX3 的过表达可诱导过氧化物酶体的泛素化，并通过溶酶体介导其降解13。此外，将 PEX5 与 C 末端 EGFP 融合会阻碍单泛素化 PEX5 的外排，从而导致过氧化物酶体自噬14。另一方面，过氧化物酶体自噬也可由 H2O2 处理触发。过氧化物酶体可产生活性氧（ROS）；特别是过氧化物酶体酶 Acox1，在催化极长链脂肪酸（&#62;22 个碳）β-氧化的初始步骤时，不仅生成乙酰辅酶 A（acetyl-CoA），还会产生过氧化物酶体来源的 ROS。在 H2O2 处理导致 ROS 水平升高时，哺乳动物细胞会激活过氧化物酶体自噬，以降低 ROS 的产生并缓解细胞应激。已有研究报道，H2O2 处理可驱动共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ataxia-telangiectasia mutated, ATM）向过氧化物酶体募集。ATM 随后磷酸化 PEX5，促进通过过氧化物酶体自噬实现过氧化物酶体的更新15。
由于过氧化物酶体是活性氧（ROS）的产生中心，因此也容易受到ROS的损伤。ROS引发的过氧化物酶体损伤会促使细胞启动过氧化物酶体自噬（pexophagy），以启动过氧化物酶体质量控制通路（通过自噬清除受损的过氧化物酶体）。本文概述了一种按需触发ROS诱导的过氧化物酶体损伤的方法。该方案利用了细胞器内光激活产生ROS的技术16,17,18,19,20（图1）。通过照射标记有染料的过氧化物酶体，可在其腔内产生ROS，从而特异性地触发过氧化物酶体损伤。利用该方案可证明，受ROS应激的过氧化物酶体通过依赖泛素的降解途径被清除。受ROS应激的过氧化物酶体会招募泛素E3连接酶Stub1，使其被包裹进自噬体中，进而通过过氧化物酶体自噬实现单个清除16。研究者可利用此方法通过延时显微镜在同一细胞内比较受损与健康过氧化物酶体的命运。该方法还可用于在培养皿中全局性地损伤所有细胞中的全部过氧化物酶体，从而便于对过氧化物酶体自噬通路进行生物化学分析。

<table><tbody><tr><td>直径20 mm玻璃微孔的35 mm培养皿&amp;nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>20 mm 玻璃底</td></tr><tr><td>3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16170060</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>Nuaire</td><td>NU-4750</td><td></td></tr><tr><td>diKillerRed-PTS1</td><td>中国台湾中央研究院</td><td></td><td>通过将 KillerRed 串联二聚体与 PTS1（VKSKL）融合而成</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco改良型Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F-12）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>pEGFP-C1</td><td>EGFP-C1 载体骨架用于克隆 EGFP-Stub1、EGFP-Hsp70、EGFP-p62</td></tr><tr><td>EGFP-Hsp70</td><td>中国台湾中央研究院</td><td></td><td>Hsp70 基因（HSPA1A）从 HeLa cDNA 中通过 PCR 扩增，并克隆至 EGFP-C1 载体</td></tr><tr><td>EGFP-LC3B</td><td>Addgene</td><td>11546</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-p62</td><td>中国台湾中央研究院</td><td></td><td>通过将人 SQSTM1 基因（经 PCR 扩增自 HeLa 细胞 cDNA）插入 EGFP-C1 载体构建而成</td></tr><tr><td>EGFP-Stub1</td><td>中国台湾中央研究院</td><td></td><td>通过将小鼠 Stub1 基因（经 PCR 扩增自小鼠肾总 cDNA）插入 EGFP-C1 载体构建而成</td></tr><tr><td>EGFP-Ub</td><td>Addgene</td><td>11928</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag TMR 配体&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8252</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag-PTS1</td><td>中国台湾中央研究院</td><td></td><td>将PTS1添加并克隆至EGFP-C1载体骨架中</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>倒置共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>FV3000RS</td><td>405 nm 激发，488 nm 激发，561 nm 激发&amp;nbsp; 配备TOKAI HIT腔室培养箱和UNIV2-D35培养皿支架的显微镜</td></tr><tr><td>Janelia Fluor 646 HaloTag 配体</td><td>Promega</td><td>GA1120</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>VitaStar</td><td>PAR64</td><td>80 W，555-570 nm</td></tr><tr><td>lipofectamine 2000&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11668</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>NIH3T3 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td>贴壁的</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>319850</td><td>低血清培养基</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PMP34-TagBFP</td><td>中国台湾中央研究院</td><td></td><td>从HeLa cDNA中PCR扩增PMP34并克隆至TagBFP-C（Evrogen FP171）</td></tr><tr><td>roGFP2-PTS1</td><td>中国台湾中央研究院</td><td></td><td>通过将 eroGFP（源自 Addgene 质粒 20131）的 C 末端添加氨基酸序列 VKSKL，并克隆至 EGFP-C1 载体中构建而成</td></tr><tr><td>SHSY5Y 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>贴壁的</td></tr></tbody></table>

监测 stub1 介导的过氧化物酶体自噬

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

哺乳动物细胞可通过 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬（pexophagy）来更新过氧化物酶体。该通路可能使细胞能够调控过氧化物酶体的数量与质量。在此过程中，热休克蛋白 70 和泛素 E3 连接酶 Stub1 会转位至将被降解的过氧化物酶体上，从而启动过氧化物酶体自噬。Stub1 的连接酶活性可促使泛素及其他自噬相关模块在靶向的过氧化物酶体上聚集。过氧化物酶体腔内活性氧（ROS）水平的升高可激活 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬。因此，可利用染料辅助的 ROS 生成来触发并监测这一通路。本文概述了使用两类染料——荧光蛋白和合成荧光探针——在哺乳动物细胞培养中诱导过氧化物酶体自噬的操作步骤。这些基于染料辅助 ROS 生成的实验方案不仅可用于全局性地靶向细胞群体中的全部过氧化物酶体，还可实现对单个细胞内特定过氧化物酶体的操控。我们还描述了如何通过活细胞显微镜示踪 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬过程。

本文所示的 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬诱导方案利用了过氧化物酶体腔内染料辅助的活性氧（ROS）生成。该操作仅需极低的光照强度，因此含有荧光蛋白或染料的过氧化物酶体可使用标准的激光扫描共聚焦显微镜进行照射。局部照射可在单个过氧化物酶体内瞬时且特异性地产生 ROS，如荧光报告分子 roGFP2-VKSKL 所示（图9）。在进行 roGFP2-VKSKL 检测时，我们未对 diKillerRed-VKSKL 进行成像，以避免成像过程中产生额外的 ROS。位于 图9 右下角的 diKillerRed-VKSKL 图像是在完成所有 roGFP2-VKSKL 检测后采集的，以清晰标示受损过氧化物酶体的位置13。实验数据还显示，未受照射的过氧化物酶体未受到影响，表明该方法具有高度精确性。ROS 会导致少量过氧化物酶体驻留分子发生氧化，从而引起过氧化物酶体功能障碍。这种急性操作可有效用于深入研究多种过氧化物酶体质量控制通路。
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本方案提供了在活细胞中诱导并监测 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬的实验指导。

监测 Stub1 介导的过氧化物酶体自噬

哺乳动物细胞可通过Stub1介导的过氧化物酶体自噬降解过氧化物酶体。该途径可能使细胞能够调控过氧化物酶体的数量和质量……

过氧化物酶体执行β氧化反应，且易受活性氧（ROS）损伤。本方法可用于研究细胞如何应对ROS应激的过氧化物酶体。该方案不仅可用于靶向细胞群体中所有的过氧化物酶体，还可实现对单个细胞内单个过氧化物酶体的操作。染料辅助的活性氧生成也可用于靶向过氧化物酶体以外的细胞器，以探究细胞如何应对细胞器损伤。首先，在35毫米培养皿（内含直径为20毫米的玻璃底微孔）中加入840微升培养基，分别接种2×10⁵个人源SHSY5Y细胞或6×10⁴个小鼠源NIH H3T3细胞。将细胞在37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时。接着，使用转染试剂或SHSY5Y细胞转染方法将目标质粒转染入细胞中。在55微升无血清的DMEM/F-12培养基中稀释质粒，在另一管中将1微升转染试剂稀释于55微升无血清的DMEM/F-12培养基中。将稀释后的DNA与稀释后的试剂混合。轻轻混匀，并在室温下孵育30分钟。将复合物加入先前接种了100 µL含SHSY5Y细胞（不含抗生素）培养基的20毫米微孔板中。轻轻前后摇动培养皿。按照之前所述方法进行NIH 3T3细胞转染，但在质粒稀释和转染试剂配制时，使用低血清培养基替代无血清DMEM/F-12培养基。转染2小时后，移除含有转染试剂的培养基，并加入1毫升新鲜培养基。将NIH 3T3或SH-SY5Y细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。为了进行光激活的活性氧（ROS）生成，在转染后24小时，移除培养基，并向20毫米的玻璃微孔中加入10微升200纳摩尔的HaloTag TMR配体或200纳摩尔的Janelia Fluor 646 HaloTag配体。将培养皿转移至37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，孵育一小时以标记细胞。一小时后，彻底移除染色液，并加入1毫升新鲜培养基。将含有目标细胞的玻璃底培养皿置于配备载物台式培养箱的激光扫描共聚焦显微镜上。在软件中，点击工具窗口，选择目镜，然后点击DIA按钮以开启透射光。通过显微镜目镜观察培养皿，并旋转调焦旋钮使细胞清晰对焦。选择激光扫描显微镜（LSM），然后点击染料检测选择按钮。在弹出窗口中双击所需的染料，以选择适当的激光和滤光片设置，用于对细胞进行成像。在实时成像面板中点击“Live4x”，启动快速激光扫描，开始筛查细胞的荧光信号。使用操纵杆控制器移动载物台，找到表达中等强度 diKillerRed VKSKL 或 SLP-VKSKL 的细胞，以对过氧化物酶体施加活性氧（ROS）压力。获取目标细胞的图像后，点击工具窗口并选择 LSM 刺激功能。然后点击椭圆按钮，在实时图像窗口中使用鼠标绘制一个直径为15微米的感兴趣区域（ROI），其中包含需要施加活性氧（ROS）应激的过氧化物酶体。为施加ROS应激，对于表达diKillerRed VKSKL或TMR标记的SLP配体的细胞，使用561纳米激光；对于经Janelia Fluor 646标记的SLP配体染色的细胞，使用640纳米激光。选择用于施加ROS应激的激光波长。输入所需的激光百分比和持续时间。为在过氧化物酶体中产生活性氧（ROS），请点击“采集”，然后点击“刺激”按钮，分别使用561或640纳米的激光对ROI区域进行30秒的扫描刺激。该刺激对应的激光功率设置约为561和640纳米波长下的5%。激光照射30秒后，ROI内的过氧化物酶体失去其diKillerRed VKSKL、TMR或Janelia Fluor 646信号。这种信号丢失使得能够区分细胞内被照射和未被照射的过氧化物酶体。为了监测pexophagy过程中的活细胞，可通过时间推移成像，以每10分钟为间隔，观察EGFP标记的Stub1、Hsp70、泛素、p62或LC3B向被照射或ROS应激的过氧化物酶体的转位情况。局部光照可导致单个过氧化物酶体内部瞬时且定位的活性氧（ROS）产生，这由荧光报告分子 roGFP2-VKSKL 指示。在完成所有 roGFP2-VKSKL 测量后，拍摄了 diKillerRed VKSKL 图像，以标示受损过氧化物酶体的位置。数据还显示，未受光照的过氧化物酶体未受到影响，表明该方法具有高度精确性。该方法用于监测Stub1介导的过氧化物酶体自噬。在此过程中，Hsp70、Stub1、泛素化蛋白以及自噬接头蛋白p62和LC3B会相继出现在受到活性氧应激的过氧化物酶体中，从而驱动过氧化物酶体自噬。利用相同的策略，可同时损伤培养皿中所有的过氧化物酶体，以进行Stub1介导的过氧化物酶体自噬的生物化学表征。在LED照射之前，EGFP-泛素荧光在细胞质中呈均匀分布，且不与过氧化物酶体共定位。经过9小时LED照射后，EGFP-泛素信号聚集到共聚焦培养皿中细胞的所有过氧化物酶体上。通过本实验方案，我们发现受活性氧应激的过氧化物酶体通过依赖泛素的降解途径被清除。ROS应激的过氧化物酶体招募泛素E3连接酶Stub1，从而使其可通过过氧化物酶体自噬被清除。

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