Name: 用于追踪斑马鱼径向胶质细胞祖细胞不对称分裂期间缺口/δ内吞作用的抗体摄取测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习抗体摄取测定法，用于追踪斑马鱼胚胎大脑中径向胶质细胞祖细胞分裂期间的Notch/DeltaD内吞作用。该方法可高效标记配体，适用于发育生物学研究。

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该项目由美国国立卫生研究院（NIH）R01NS120218项目、加州大学旧金山分校（UCSF）Mary Anne Koda-Kimble 创新种子奖以及陈-扎克伯格生物中心（Chan Zuckerberg Biohub）资助。

本研究使用了AB野生型品系及转基因品系Tg [ef1a:Myr-Tdtomato]。所有动物实验均经美国加利福尼亚大学旧金山分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（批准编号：AN179000）。
1. 斑马鱼胚胎的制备
<ol>
	<li>在当天下午5:00前设置鱼类交配缸，每个缸中放入一条野生型雌鱼和一条Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] 雄鱼，并使用隔离板将它们分隔开。</li>
	<li>次日上午11:00前，从所有交配缸中移除隔离板。保持安静，避免干扰鱼类交配。产卵通常在移除隔离板后30分钟内发生，受精卵会留在缸底。
	<ol>
		<li>使用筛网从缸中收集受精卵，通过冲洗将卵转移至盛有卵水的培养皿中，并在解剖显微镜下以10倍至20倍放大倍数观察胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用大口径玻璃巴斯德移液管将受精胚胎转移至含有约20 mL胚胎培养基的洁净培养皿中（100 mL 1,000倍浓缩储备液包含29.4 g NaCl、1.27 g KCl、4.85 g CaCl2·2H2O和8.13 g MgSO4·7H2O）。将胚胎置于28 °C环境中培养。每30 mL胚胎培养基中放置50个受精胚胎，培养温度为28.5 °C。 
	&#8203;注意：一对鱼类通常可产生100–300个胚胎，每次交配的健康胚胎受精率和存活率均超过95%。</li>
	<li>次日上午8:00从培养箱中取出胚胎，此时胚胎已发育至约受精后18–20小时（hpf）的阶段。先使用白光在落射荧光显微镜下以20倍放大倍数观察胚胎。此时斑马鱼胚胎处于20体节期。
	<ol>
		<li>使用玻璃移液管在显微镜下剔除浑浊或破裂的死亡胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开荧光灯，将显微镜切换至RFP滤光片设置，挑选出具有强红色荧光的胚胎，并将其转移至盛有卵水的新培养皿中。
	<ol>
		<li>在白光下使用两把精细镊子（镊子尖端应锋利且无损伤）手动去除胚胎的绒毛膜（见材料表）。</li>
		<li>用一把镊子夹住绒毛膜，另一把镊子在其上撕开一个小口。小心地用镊子扩大裂口，并轻轻推动胚胎，使其从裂口处缓缓挤出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将去绒毛膜的胚胎转移至盛有新鲜胚胎培养基的新培养皿中，短暂清洗后即可进行显微注射。</li>
</ol>
2. 显微注射的准备
<ol>
	<li>使用毛细管（外径 1.2 mm，内径 0.9 mm，带纤维丝）在拉针仪上制备精细的注射针。根据仪器手册设计并优化拉针程序。</li>
	<li>在体视解剖显微镜下用镊子打开针尖，使针尖直径约为 10 µm，锥角约为 30°。</li>
	<li>在注射前将小鼠单克隆抗-Dld 抗体与抗小鼠 IgG-Atto647N 进行偶联。
	<ol>
		<li>每次注射实验中，用移液器将 0.5 µL 抗-Dld 抗体（0.5 mg/mL）与 2 µL 抗小鼠 IgG-Atto647N 抗体（1 mg/mL）反复吹打混合 5–10 次。然后在室温下孵育至少 30 分钟（或在冰上孵育 2–3 小时）。</li>
		<li>孵育后，在抗体混合物中加入 2.5 µL 封闭缓冲液（10 mg/mL 小鼠 IgG）和 0.5 µL 0.5% 酚红，吹打 10 次充分混匀，以封闭混合物中残留的未偶联抗体。 
		注意：每次实验需额外准备一份不含抗-Dld 抗体的混合液，作为对照使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在胚胎培养基中配制 1% 低熔点琼脂糖。将含有琼脂糖的混合液在 70 °C 加热至透明。
	<ol>
		<li>将琼脂糖溶液分装至 2 mL 微离心管中。将分装样品置于约 40 °C 的加热块中保温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将胚胎在含有 1% 低熔点琼脂糖的试管中冲洗 3 秒。</li>
	<li>将胚胎与单独的琼脂糖液滴（约 30–40 µL）一起放置于倒置的塑料培养皿盖上，如 图 1 所示，将每个胚胎单独固定在盖上。将胚胎在琼脂糖中平放呈侧卧位，并保持该位置直至琼脂糖在室温下凝固。</li>
	<li>按上述方法逐个将 12 个胚胎以三行排列固定。用卵培养基覆盖所有固定在琼脂糖中的胚胎。</li>
</ol>
3. 显微注射
<ol>
	<li>将包埋的胚胎置于体视显微镜下，并用胚胎培养液覆盖琼脂糖。</li>
	<li>将气压注射仪与显微操作器组装好，并放置在显微镜附近，如图1所示。使用装有高压氮气（N2）的钢制气瓶作为气源。
	<ol>
		<li>待胚胎在琼脂糖中固定好后，再打开气体阀门。使用显微注射仪的前端加样模块时，如图1所示，将2 µL抗体混合液从前端加载至显微操作器上的玻璃针尖中。</li>
		<li>调节输入压力至约80–90 psi，注射压力至约20 psi。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如前所述15，在显微镜下使用微米尺校准注射体积。根据玻璃针尖开口大小，将调节时间设定为10 ms至120 ms。通过轻按踏板触发每次注射脉冲，并调节每次注射的体积至约4–5 nL。</li>
	<li>将显微注射针尖刺入菱脑背部 roof plate，在r0/r1铰链点后方，注入约10 nL（两到三个脉冲）抗体混合液，避免触碰脑组织。观察红色液体在脑室内的流动情况。 
	注：菱脑室位于中脑-菱脑边界后方。所注射的含酚红抗体混合液会随脑脊液迅速扩散，立即充满从菱脑至前脑的整个脑室系统。</li>
	<li>注射完成后，通过旋转显微操作器的旋钮迅速将针尖从胚胎中撤出。成功注射的标志是，注射液中的红色染料稳定保留在脑室内，未泄漏至周围琼脂糖中。</li>
	<li>移动载片板至显微镜下，定位下一个已固定的胚胎，以便重复操作。
	<ol>
		<li>每注射六至八个胚胎后，使用显微外科刀剥离琼脂糖，释放包埋其中的胚胎。将显微注射后的胚胎转移至含30 mL胚胎培养基的新培养皿中，并于室温下放置，进行后续步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 样品固定与延时活体成像
<ol>
	<li>30 分钟后，将选定的胚胎转移至 10 mL 胚胎培养液中。向 10 mL 胚胎培养液中加入 420 µL 三卡因储备液（4 mg/mL），以麻醉胚胎。</li>
	<li>为固定胚胎，准备含有相同浓度三卡因的 0.8% 低熔点琼脂糖溶液并置于离心管中。将分装的琼脂糖置于约 40 °C 的加热块中保温。</li>
	<li>使用玻璃移液器将注射后的胚胎浸入温热的琼脂糖中 3 秒。然后立即用同一根玻璃移液器将胚胎从琼脂糖中取出，并将胚胎连同一滴琼脂糖转移至 35 mm 玻璃底培养皿的中央。每个液滴中仅放置一个胚胎。</li>
	<li>使用纤维探针或加样枪头轻轻调整胚胎方向，使胚胎脑部的背侧尽可能贴近玻璃底部。在琼脂糖逐渐凝固的过程中，轻柔地调节胚胎位置，使其充分伸展而不发生卷曲。</li>
	<li>随后，将玻璃底培养皿翻转，检查胚胎位置。确保在显微镜下可清晰观察到整个前脑背侧区域，并确认胚胎已正确固定。</li>
	<li>向培养皿中加入 2–3 mL 预热至 28.5 °C 并含有三卡因的胚胎培养液，以覆盖胚胎。将培养皿正确放置于共聚焦显微镜的温控载物台上，如图 1所示。调节成像室温度至 28.5 °C。此时胚胎已准备就绪，可用于成像。</li>
	<li>使用 40 倍水浸物镜，以固定时间间隔进行延时活体成像。
	<ol>
		<li>使用成像与显微镜控制软件（µMANAGER：https://micro-manager.org/）16。</li>
		<li>选择 564 nm 和 647 nm 成像通道，分别用于成像 MyR-Tdtomato 转基因斑马鱼的膜荧光信号以及细胞内内涵体标记的 anti-Dld-Atto647N（图 1）。</li>
		<li>将两个通道的激光功率均设置为 30%。每个通道每层 z 平面的曝光时间为 200 ms。</li>
		<li>对每个固定的斑马鱼胚胎，设置 z 轴扫描步进为 1 µm，共采集 20 层 z 平面，扫描循环总数为 100 个时间帧。</li>
		<li>设置每次扫描循环之间的时间间隔为 20 s，扫描模式为“通道优先，切片次之”（channel, slice）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Baonza, A., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+directly+controls+cell+proliferation+in+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).</li>
<li>Chitnis, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChitnis%2C+A+%22Developmental+Dynamics%22">Developmental Dynamics</a>. 235 (4), 886-894 (2006).</li>
<li>Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+trafficking+during+mitosis+and+notch-dependent+asymmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+and+Subcellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division.</a> Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).</li>
<li>Le Borgne, R., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+endocytosis+makes+delta+signal+better%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: endocytosis makes delta signal better.</a> Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).</li>
<li>Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+endocytosis+is+induced+by+ligand+and+is+required+for+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-1+signalling+requires+ligand-induced+proteolytic+release+of+intracellular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain.</a> Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).</li>
<li>Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Delta+and+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division.</a> Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).</li>
<li>Derivery, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+by+spindle+asymmetry+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division.</a> Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).</li>
<li>Matsuda, M., Chitnis, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Notch+determines+endocytosis+of+specific+Delta+ligands+in+zebrafish+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue.</a> Development. 136 (2), 197-206 (2009).</li>
<li>Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+Notch+trafficking+in+Sara+endosomes+during+asymmetric+cell+division+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord.</a> Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).</li>
<li>Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralineage+directional+Notch+signaling+regulates+self-renewal+and+differentiation+of+asymmetrically+dividing+radial+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia.</a> Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+endosome+dynamics+engage+cytoplasmic+Par-3+that+recruits+dynein+during+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division.</a> Science Advances. 7 (24), (2021).</li>
<li>Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+analysis+for+cryosectioned+and+immunostained+tissue+samples+with+or+without+label+retention+expansion+microscopy+%28LR-ExM%29+by+JACoP%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP.</a> Bio-Protocol. 12 (5), 4336(2022).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+brain+ventricle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Zebrafish brain ventricle injection.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1218(2009).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+the+injection+volume+for+microinjection+of+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).</li>
<li>Lukinavičius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+probes+for+multicolor+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们开发了一种高效的抗体摄取检测方法，用于标记和成像斑马鱼放射状胶质前体细胞中内体内的 Notch/Delta 转运过程。与先前用于追踪果蝇 SOP 细胞中标记抗 DeltaD 抗体的方法相比7,8，本方法采用显微注射而非将样品与偶联抗体共同孵育。将荧光标记的抗Dld抗体显微注射至后脑室；该技术不会造成损伤，注射后胚胎发育正常并完全恢复即为证据。胚胎脑室系统相互连通，使得注射后的抗体在显微注射后可自由扩散至前脑。注射的抗Dld-atto647N在脑内可持续稳定存在超过24小时，为持续性抗体摄取提供了稳定来源。与此前报道的神经管注射相比10斑马鱼后脑脑室注射不会造成组织损伤，并能实现有丝分裂期放射状胶质前体细胞选择性摄取抗-Dld-Atto647N，这些细胞位于脑室壁内衬 体内尽管我们尚未检测抗体在脊髓神经上皮细胞中的摄取情况，但抗Dld-Atto647N抗体的摄取在该区域也应适用，与在脑部的情况一致。注射至后脑室的偶联抗体预计同样可沿脊髓扩散。 
...

Notch 信号通路在后生动物发育过程中调控细胞命运决定和模式形成1，近期研究表明，干细胞分裂中的 Notch 信号主要依赖于内吞运输2,3。内吞后的 Notch/Delta 可激活细胞核内的 Notch 信号，增强 Notch 靶基因的转录4,5,6。定向的 Notch/Delta 内体运输最初在果蝇感觉器官前体（SOP）细胞的不对称细胞分裂（ACD）过程中被观察到，导致 pIIa 细胞中的 Notch 信号活性高于 pIIb 细胞7,8。已有研究利用抗 Delta 和抗 Notch 抗体的抗体摄取实验，监测有丝分裂期 SOP 细胞中的内吞过程。Notch/Delta 内体在细胞质分裂期间随驱动蛋白马达蛋白向中心纺锤体移动，并由于细胞分裂末期不对称中心纺锤体的反平行排列，被不对称地转移到 pIIa 细胞中3,8。这些研究揭示了调控果蝇 SOP 细胞不对称分裂的分子机制，但尚不清楚类似的内吞过程是否在脊椎动物放射状胶质前体细胞（RGPs）中发生。
此外，调控脊椎动物放射状胶质前体细胞（RGP）分裂过程中不对称 Notch/DeltaD 信号传导的分子机制尚不明确。在斑马鱼中，已有研究报道 Notch 与 Delta 的相互作用可促进 DeltaD 配体的内吞9。目前尚不清楚 DeltaD 的内吞是否会影响发育中脊椎动物大脑子代细胞的命运决定。最近的研究表明，将荧光标记的抗-DeltaD 抗体注射到神经管中，可特异性地标记神经上皮细胞中的 Sara 内体，且含有抗-DeltaD 的 Sara 内体优先分配至增殖型子代细胞10。有研究推测，来自内体的 Notch 信号可能调控子代细胞的命运。先前的研究结果显示，发育中斑马鱼前脑中的大多数 RGP 细胞经历不对称细胞分裂（ACD），且子代细胞命运的决定依赖于细胞谱系内部的 Notch/DeltaD 信号传导11。为了阐明斑马鱼 RGP 中谱系内 Notch/DeltaD 信号传导的本质，我们建立了在发育中斑马鱼大脑中进行抗-DeltaD 抗体摄取的检测方法。利用该实验方案，我们成功实现了对有丝分裂期 RGP 中 DeltaD 内吞运输过程的活体标记与成像。
荧光标记的抗DeltaD抗体可高效内化至前脑脑室周围的放射状胶质前体细胞（RGPs）中，这极大地促进了对不对称分裂的RGPs中DeltaD内体定向转运现象的发现。12,13与之前为果蝇notum培养物和斑马鱼脊髓开发的抗体摄取方案相比10该方案已实现在脑室细胞层中持久且高效的抗-DeltaD标记，仅需微量注射少于10 nL的抗体混合物。后脑室注射便于在发育中的大脑中应用抗体摄取检测，因为斑马鱼胚胎在早期发育阶段后脑室充分扩张，并充满脑脊液。14通过将抗体混合物注射至后脑室，避免损伤任何关键的发育组织，该方案已尽可能最大限度地减少了对前脑成像区域的潜在损害。同时，减少注射的一抗剂量也避免了干扰内源性Delta-Notch信号通路的潜在副作用。 体内该方案可轻松与其他药理学或遗传学干预手段相结合，适用于不同发育阶段，并可能适用于成年大脑以及由人多能干细胞衍生的二维/三维脑类器官。综上所述，本方案使得研究者能够阐明Notch信号在不对称细胞分裂过程中不对称性建立的时间与机制。成功实施该方案的主要挑战在于，根据特定的实验条件，实现抗体精确浓度的准确递送。

<table><tbody><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿&amp;nbsp;</td><td>MatTek 公司</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>气压注射仪&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG-Atto647N&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50185</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2.&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>毛细管，外径 1.2 mm，内径 0.9 mm，带纤维丝</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-6</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 转盘式/高速宽场共聚焦系统</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Nikon&amp;nbsp;Ti 倒置荧光显微镜，配备 CSU-W1 大视野共聚焦系统。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont 医用镊子 5 号</td><td>Thomas Scientific</td><td>72877-D</td><td></td></tr><tr><td>Flaming-Brown P897 拉针仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4.&lt;/sub&gt;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI M3301R</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 Dld 抗体&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>AB_1268496</td><td></td></tr><tr><td>Zenon 小鼠 IgG 封闭缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z25008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure™ 低熔点琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr></tbody></table>

追踪斑马鱼放射状胶质前体细胞不对称分裂过程中 notch/delta 内吞作用的抗体摄取实验

Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors

不对称细胞分裂（ACD）可产生命运不同的两个子细胞，是生成细胞多样性的基本机制。在无脊椎动物和脊椎动物发育中的器官内，不对称分裂的前体细胞产生 Notch你好 自我更新和Notchlo 分化子细胞。在胚胎期斑马鱼大脑中，放射状胶质前体细胞（RGPs）——主要的脊椎动物神经干细胞——通常通过不对称细胞分裂（ACD）产生一个RGP和一个正在分化的神经元。斑马鱼胚胎具有光学通透性强和易于操作的优势，使其成为理想的研究模型 体内 延时成像以直接观察不对称Notch信号在不对称细胞分裂（ACD）过程中建立的时间与机制。近期研究表明，Notch配体DeltaD的动态内吞在ACD期间的细胞命运决定中起关键作用，该过程受进化上保守的极性调节因子Par-3（又称Pard3）和驱动蛋白dynein复合物的调控。为实现对这一过程的可视化 体内 我们开发了这种抗体摄取实验，以研究有丝分裂期放射状胶质前体细胞（RGPs）中Notch信号内体的运输模式。利用该实验，我们揭示了含有DeltaD的内体在RGP分裂过程中的动态行为。

在图2A中，注射了Atto647N但未与一抗结合的胚胎在脑室中显示出背景荧光，细胞中几乎观察不到被吞噬的荧光颗粒。而注射了抗-Dld-Atto647N的斑马鱼胚胎在发育中的前脑大多数细胞内显示出大量内化的荧光颗粒（图2A，右图）。如图2B所示，通过放大聚焦于有丝分裂的放射状胶质前体细胞（RGPs），我们能够记录细胞分裂过程中细胞内抗-Dld-Atto647N内吞体的动态运动（视频1）。大多数有丝分裂的RGPs表现出抗-Dld-Atto647N内吞体向两个子细胞的前部或后部不对称分配12。我们还注意到，这种不对称性在后期末趋于稳定，导致子细胞随后不对称地继承Notch信号内吞体12。
<img ...

本研究建立了一种抗体摄取检测法，用于成像胚胎斑马鱼大脑中分裂的放射状胶质前体细胞内同一谱系中的 Notch/DeltaD 信号传导。

追踪斑马鱼放射状胶质前体细胞不对称分裂过程中 Notch/Delta 内吞作用的抗体摄取实验

不对称细胞分裂（ACD）产生命运不同的两个子细胞，对于生成细胞多样性具有基础性作用。在发育中的……

Notch 信号通路调控后生动物发育过程中的细胞命运决定和模式形成。我们建立了一种抗体摄取检测方法，用于标记 Notch 配体 Delta-D，并在斑马鱼前脑发育过程中的放射状胶质前体细胞中成像其内吞运输过程。通过斑马鱼隐脑脑室注射，可实现有丝分裂期的放射状胶质前体细胞高效且选择性地摄取 Anti-Dld-Atto-647N 抗体，并具有持久的作用效果。该方案可轻松地与其他药理学或遗传学干预手段相结合，这些干预手段可用于不同发育阶段，并可能适用于成年大脑以及由人多能干细胞衍生的二维或三维脑类器官。在获得受精胚胎并培养18至20小时后，将其从培养箱中取出。首先在落射荧光显微镜下使用白光以20倍放大倍数进行观察。在显微镜下使用玻璃移液管弃去呈浑浊或破裂的死亡胚胎。然后打开荧光灯，并将显微镜的滤光片设置为RFP模式。挑选出具有强红色荧光的胚胎，并将其转移至含有卵水的新培养皿中。现在在白光下用两把精细镊子手动去除胚胎的卵膜。用一把镊子夹住卵膜，用另一把镊子在卵膜上撕开一个小口。用镊子小心地扩大裂口，并用另一把镊子的尖端轻轻推动胚胎，使裂口足够大，以便胚胎能够通过。将去壳的胚胎转移至含有新鲜胚胎培养基的新培养皿中，显微注射前进行快速冲洗。在拉针仪上拉制精细注射针后，在体视解剖显微镜下用镊子打开针尖，使针尖直径约为10微米，锥角约为30度。现在，用移液器将 0.5 微升抗 Dld 抗体与 2 微升抗小鼠 IgG Atto-647N 抗体混合，反复吹吸 5 至 10 次以使二者偶联，并在室温下孵育至少 30 分钟。孵育结束后，向抗体混合物中加入 2.5 微升封闭缓冲液和 0.5 微升 0.5%酚红，通过移液混匀，以封闭混合物中残留的未偶联抗体。接下来，用胚胎培养基配制 1%低熔点琼脂糖。将含有琼脂糖的混合物加热至70摄氏度，直至混合物变为透明。分装琼脂糖溶液后，置于40摄氏度的加热块中保温。将管中含1%低熔点琼脂糖的胚胎冲洗三秒钟。将胚胎放置在倒置的塑料培养皿盖上，使用单独的琼脂糖液滴分别固定每个胚胎。将胚胎在琼脂糖中侧向平放，并保持该位置直至琼脂糖在室温下凝固。用胚胎培养基覆盖所有固定在琼脂糖中的胚胎。将包埋的胚胎置于体视显微镜下，并用胚胎培养液覆盖琼脂糖。设置带有显微操作器的气压注射仪，将其放置在显微镜附近。使用装有高压氮气的钢制气瓶作为气源。将胚胎固定在琼脂糖中后，打开气体阀门。使用显微注射仪的前端填充模块，在显微操作器上用2 µL抗体混合物对制备好的玻璃针尖进行前向装填。随后将输入压力调节至80至90磅每平方英寸，注射压力调节至20磅每平方英寸。在显微镜下使用千分尺校准注射体积。根据针头开口的大小，将调谐时间设置为10至120毫秒。轻按踏板以输送每次注射脉冲，并将每次输送的注射体积调节至4到5纳升。然后将显微注射针的尖端穿过菱脑背部的顶板，在rondimere零一铰链点后方刺入，注入约10纳升抗体混合物，注意避免触碰脑组织。观察脑室中红色液体的流动情况。注射完成后，通过旋转显微操作仪的旋钮，迅速将针尖从胚胎中抽出。为确保注射成功，注射混合物中的红色染料应稳定保留在脑室中，不得渗入周围的琼脂糖。将载片移至显微镜下，定位另一个已固定的胚胎，以便进行重复实验。注射六至八个胚胎后，用显微手术刀剥离琼脂糖，使胚胎从包埋的琼脂糖中释放出来。将显微注射后的胚胎转移至含有30毫升胚胎培养基的新培养皿中，并于室温下放置以进行后续步骤。30分钟后，将筛选出的胚胎转移至10毫升胚胎培养基中。为固定胚胎，需在离心管中制备含有相同浓度三卡因的0.8%低熔点琼脂糖。使用玻璃移液管将注射后的胚胎浸入温热的琼脂糖中三秒钟。然后立即用同一根玻璃移液管将胚胎从琼脂糖中取出，并将胚胎连同来自试管的一滴琼脂糖置于35毫米玻璃底培养皿的中央。用纤维探针或上样枪头轻轻调整胚胎方向，使胚胎脑部的背侧尽可能贴近玻璃底部。轻轻调整胚胎位置，使胚胎在琼脂糖逐渐凝固的过程中保持伸展，避免卷曲。随后，将玻璃底培养皿翻转，检查胚胎位置。确保在显微镜下能够观察到完整的背侧前脑以及正确安装的胚胎。加入 2 至 3 毫升含有三卡因、预热至 28.5 摄氏度的胚胎培养基，以覆盖胚胎。将培养皿正确放置在共聚焦显微镜的温度可控载物台上，并将成像室的温度调节至 28.5 摄氏度。此时胚胎已准备好进行成像。 注射了Atto-647N的胚胎在脑室中显示出背景荧光。注射了抗Dld-Atto-647N的斑马鱼胚胎在发育中的前脑大多数细胞内显示出大量内化的荧光颗粒。延时成像显示了细胞分裂过程中细胞内抗Dld-Atto-647N内体的运动。大多数有丝分裂的放射状胶质前体细胞表现出抗-Dld-Atto-647N 内体在两个子细胞中的前-后不对称分配。这种不对称性在后期结束时趋于稳定，从而导致子细胞随后不对称地继承 Notch 信号内体。确保将针头准确插入隐藏的脑室指定位置，并在显微注射后检查是否有泄漏。除了标记 Notch Delta 信号外，如果存在针对胞外结构域的优质抗体，本方案也可采用类似策略用于标记其他膜蛋白或胞外蛋白。

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发育生物学

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本文描述了用于分析斑马鱼发育中脑内不同微管群体的免疫标记方法，这些方法也可广泛适用于其他组织。第一个方案概述了一种优化的免疫标记稳定和动态微管的方法。第二个方案提供了一种特异性成像和定量新生微管的方法。...

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追踪斑马鱼放射状胶质前体细胞不对称分裂过程中 Notch/Delta 内吞作用的抗体摄取实验

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