芯片上辛醇辅助脂质体组装用于生物工程

OLA 是一种多功能的微流控平台，对合成生物学领域，特别是人工细胞的生物工程构建具有重要价值。基于 OLA 制备的脂质体有助于我们理解生物学中的自组织原理，并构建模拟细胞的组装体系。

OLA 能够以高通量的方式制备单一分散、单层、细胞大小的脂质体，并具有优异的包封效率。该方法仅需极小的样品体积，约为 50 微升，且所形成的脂质体可立即用于后续芯片上的实验。OLA 适用于研究微限域内的生物反应、囊泡动力学以及生物分子凝聚体及其与膜的相互作用。

OLA 还被用作高通量药物筛选平台，例如用于测试抗菌剂的渗透性和膜活性。表面功能化（即 PV 处理）是该方案中的关键步骤，需谨慎操作，以防止 PV 溶液进入内部含水相以及携带脂质的有机相通道。此外，生产后的通道长度应恰好足以实现辛醇液滴的分离，从而形成脂质体。

来自我实验室的博士生 Ketan Ganar 将协助张昌演示该实验步骤。首先，取一个直径为四英寸的洁净硅片，并使用加压空气进一步清洁，以去除任何灰尘颗粒。将硅片固定在匀胶机上，然后轻轻在硅片中心滴加约五毫升负性光刻胶。

为获得厚度为10微米的光刻胶层，首先将旋涂参数设置为500 RPM，持续30秒，加速度为100 RPM/秒，用于初始铺展；随后以500 RPM/秒的加速度加速至3,000 RPM，继续旋涂60秒。然后对晶圆进行旋涂。将晶圆置于加热板上，在65°C下烘烤2分钟，随后在95°C下烘烤5分钟。

待晶圆冷却后，将其安装至直写式光学光刻机的打印腔室中，并将辛醇辅助脂质体组装（OLA）设计导入软件。设计打印完成后，先在65摄氏度下烘烤晶圆1分钟，随后在95摄氏度下烘烤3分钟。为洗去未固化的光刻胶，将晶圆浸入盛有显影液的玻璃烧杯中，直至未固化光刻胶完全去除。

在 150 摄氏度下对晶圆进行 30 分钟的硬烘烤，以确保打印的图案牢固地附着在晶圆表面，并且在后续的加工过程中不会脱落。为制备微流控装置，将主晶圆放置在一块方形铝片上，并用铝箔包裹晶圆，形成类似井状的结构。轻轻将 PDMS 混合物倒入主晶圆上。

将组装件置于70摄氏度的烘箱中孵育至少两小时。将主晶圆从烘箱中取出并使其冷却。为去除固化的聚二甲基硅氧烷（即PDMS块），先移去铝箔，然后从晶圆边缘小心地剥离PDMS块。

取一片透明玻璃盖玻片，将约 0.5 毫升的 PDMS 倒在玻片中央，通过轻轻倾斜玻片使 PDMS 均匀铺展至整个盖玻片表面，确保 PDMS 完全覆盖玻片。将玻片安装到旋涂仪上，确保其位于中心位置，使玻片中心与压力轴中心重合。

然后以每秒100转的增速将玻片以500转/分钟的速度旋转15秒，再以每秒500转的增速升至1,000转/分钟并旋转30秒。将PDM涂层玻片涂层面朝上放置在覆盖的培养皿内一个抬高的平台（如一块PDMS）上。在70摄氏度下烘烤两小时。

将带有刻蚀通道的PDMS块和PDMs包被的玻片（包被面朝上）放入等离子清洗仪的真空腔中。开启真空泵，以12兆赫的射频对腔内物质进行15秒的空气等离子体处理，以活化表面。氧气等离子体呈现粉红色光晕。

等离子处理后，立即将PDMS涂层的玻片放置在洁净表面上，PDMS面朝上。轻轻将带有微流控图案的PDMS块置于其上，使微流控图案面朝向PDMS涂层的玻片，使其自然键合。将键合好的器件在70摄氏度下烘烤两小时。

取200微升5%聚乙烯醇（PVA）或OVA溶液，加入1.5毫升离心管中，并将其连接至微流控储液池支架。插入导管，使一端浸入PVA溶液中，另一端连接至微流控装置外水相通道的入口。将外水相压力升至100毫巴，使PVA溶液流入外水相通道。

将内层水相和载脂有机相的压力增加至120毫巴，以防止PVA溶液倒流进入这些通道。以这种方式使PVA溶液流动约五分钟，确保出口通道完全功能化。将载脂有机相和内层水相通道的压力升至2巴，以清除PVA溶液，并立即从外层水相入口处拆下管路。

同时，使用连接至负压通道的管路从出口通道中移除多余的PVA。将装置在120摄氏度下烘烤15分钟，然后冷却至室温后再使用。该装置可在常温条件下保存至少一个月。

将溶液分装至三个1.5毫升离心管中并组装好。将其连接至经PVA处理的微流控芯片，并对三个通道施加正压，内层水相和携带脂质的有机相通道压力约为100毫巴，外层水相通道压力约为200毫巴。当三个相在交汇处开始共流后，确保双乳液生成开始，并根据其质量调节压力。

当双重乳液液滴流动时，辛醇全囊泡变得越来越明显，最终被掐断，形成脂质体。此处展示了快速生成双重乳液液滴的明场图像。荧光脂质通道显示了由于部分去润湿而形成的辛醇全囊泡。

内部水相通道显示了黄色荧光蛋白的包封。该图展示了出口通道中辛醇小室去润湿并形成脂质体的过程。该图像表示脂质体内包封的聚赖氨酸与ATP均相溶液在pH依赖性条件下转变为相分离的聚赖氨酸-ATP凝聚体的示意图。

脂质体内部初始的酸性环境使ATP分子呈电中性，从而抑制了共凝聚现象。当脂质体内部pH值随着外部pH升高而达到平衡时，ATP获得负电荷，进而触发共凝聚。本图展示了多聚赖氨酸与膜的空间分布，以及脂质体内多聚赖氨酸-ATP共凝聚体形成的延时图像。

通过外部添加基础缓冲液，可在数分钟内提高脂质体内部的pH值，从而启动凝聚作用。时间零点（T等于零分钟）指的是首次发生凝聚现象之前的时刻。在演示操作过程中，必须耐心调节通道压力，以确保生成稳定的双重乳液。

OLA 及其各种变体已被应用于多种研究中，例如脂质体的生长与分裂、生物大分子凝聚体动力学的研究、无细胞蛋白质表达以及细菌的包封。因此，综上所述，我们认为 OLA 是一个适用于合成生物学的多功能平台。