Name: 用于生物工程的片上辛醇辅助脂质体组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学习辛醇辅助脂质体组装技术，利用微流控平台高效制备单分散脂质体，用于合成生物学和人工细胞生物工程研究。该方法封装效率高，可实现片上即时实验。

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我们感谢 Dolf Weijers、Vera Gorelova 和 Mark Roosjen 慷慨提供 YFP。S.D. 感谢荷兰研究理事会提供的经费支持（资助编号：OCENW.KLEIN.465）。

1. 制备主晶圆
<ol>
	<li>取一个直径为 4 英寸（10 cm）的洁净硅片（参见材料表），并使用加压空气进一步清洁，以去除任何灰尘颗粒。</li>
	<li>将硅片固定在旋涂仪上，轻轻在硅片中心滴加约 5 mL 负性光刻胶（参见材料表）。尽量避免产生气泡，因为气泡可能干扰后续硅片的打印过程。</li>
	<li>为获得厚度为 10 µm 的光刻胶层，先以 100 rpm/s 的加速度在 500 rpm 下旋涂 30 秒以实现初步铺展，随后以 500 rpm/s 的加速度在 3,000 rpm 下继续旋涂 60 秒。若需不同厚度，可根据制造商说明调整旋涂参数。</li>
	<li>将硅片置于加热板上，先在 65 °C 下烘烤 2 分钟，再在 95 °C 下烘烤 5 分钟。</li>
	<li>待硅片冷却后，将其安装至直写式光学光刻机的打印腔内（参见材料表），并将 OLA 设计文件（图 2A，补充编码文件 1）导入软件。 
	注意：OLA 设计主要包含两个 OA&#160;通道、两个 LO&#160;通道和一个 IA&#160;通道，这些通道汇合形成一个六通接头，延续为后处理通道，并最终通向实验孔（EW）。</li>
	<li>使用紫外激光（参见材料表）在涂覆好的硅片上打印 OLA 设计，曝光剂量为 300 mJ/cm2。</li>
	<li>设计打印完成后，在 65 °C 下烘烤 1 分钟，随后在 95 °C 下烘烤 3 分钟。</li>
	<li>此时应确认打印器件的轮廓已出现在硅片表面，并且肉眼可见。为洗去未固化的光刻胶，将硅片浸入盛有显影液的玻璃烧杯中（参见材料表），直至未固化的光刻胶完全去除。 
	注意：过度显影处理可能影响设计分辨率。</li>
	<li>依次用丙酮、异丙醇和去离子（DI）水清洗硅片，最后使用吹气枪以加压空气/N2 吹干。</li>
	<li>在 150 °C 下对硅片进行坚膜烘烤 30 分钟，以确保打印图案牢固附着于硅片表面，在后续加工过程中不会脱落。至此，母版硅片已准备就绪，可供进一步使用（图 2B）。</li>
</ol>
2. 准备微流控装置
<ol>
	<li>将母版晶圆放置在一块方形铝箔上，用铝箔包裹晶圆，形成一个类似井状的结构（图2C）。</li>
	<li>在50 mL离心管中称取40 g聚二甲基硅氧烷（PDMS）和4 g固化剂（10:1，质量比，参见材料表），使用刮刀或移液器吸头剧烈搅拌2-3分钟。</li>
	<li>剧烈混合PDMS与固化剂会导致混合物中混入气泡。将离心管以100 × g离心2-3分钟，以去除大部分较大的气泡。</li>
	<li>将步骤2.3中配制的混合物约15-20 g倾倒至母版晶圆上，并使用真空干燥器脱气。剩余的混合物保留备用，用于制备PDMS包被的玻片（步骤3）。</li>
	<li>将组装好的样品置于70 °C烘箱中孵育至少2小时。</li>
	<li>从烘箱中取出母版晶圆并使其冷却。为取下固化的PDMS块，先移除铝箔，然后小心地从晶圆边缘剥离PDMS块。 
	注意：晶圆较为脆弱，可能破裂，因此此操作需格外小心。</li>
	<li>PDMS块脱模后，保持其图案面朝上，使用锋利刀片或解剖刀切割出单个PDMS块，每个块包含一个独立的微流控装置。</li>
	<li>将PDMS块放置于深色表面上，调整光源方向（台灯在此步骤中非常实用），使刻蚀的通道呈现光泽从而清晰可见。使用直径为0.5 mm和3 mm的活检打孔器分别在入口和出口通道处打孔（参见材料表）。 
	注意：应使用锋利的活检打孔器，以避免PDMS产生裂纹，否则可能导致后续泄漏。轻轻将打孔器穿过PDMS块，并确保其完全穿透。取出打孔器时，应边缓慢回撤边交替旋转方向。至此，带有刻蚀OLA结构的PDMS块已准备好与PDMS包被的玻片进行键合。</li>
</ol>
3. 制备PDMS包被的玻片
<ol>
	<li>取一片透明玻璃盖玻片，将约 0.5 mL 的 PDMS（在步骤 2.4 中已过量制备）倒入载玻片中心，然后轻轻倾斜载玻片，使 PDMS 均匀铺展至整个盖玻片表面，确保载玻片完全被 PDMS 覆盖。</li>
	<li>将载玻片安装在旋涂仪上，确保其居中放置（使载玻片中心与压力轴中心重合），先以 100 rpm/s 的加速度升至 500 rpm 并旋转 15 秒，随后以 500 rpm/s 的加速度升至 1,000 rpm 并旋转 30 秒。</li>
	<li>将涂有 PDMS 的载玻片（涂层面向上）放置于培养皿内一个抬高的平台（如一块 1 cm × 1 cm 的 PDMS 块）上，盖上培养皿盖，于 70 °C 下烘烤 2 小时。</li>
</ol>
4. 微流控装置的键合
<ol>
	<li>用市售透明胶带（见材料表）对PDMS块（步骤2中制备）粘贴并撕除两次以进行清洁。确保清洁面朝上放置，直至使用。</li>
	<li>使用吹尘枪以加压空气/N2&#160;清洁涂有PDMS的载玻片，并保持清洁面朝上。</li>
	<li>将PDMS块（微通道面朝上）和涂有PDMS的载玻片（涂层面朝上）放入等离子清洗机的真空腔室中（见材料表）。</li>
	<li>开启真空，以12 MHz射频（RF模式调至高）进行15秒的空气等离子体处理，以活化表面。氧等离子体呈现淡粉色辉光。</li>
	<li>等离子处理后立即取出，将涂有PDMS的载玻片置于洁净表面上，PDMS面朝上。轻柔地将PDMS块的微流控图案面朝下贴合至PDMS涂层载玻片上，使其键合（图2D）。 
	注意：必须排除器件中夹带的空气，以确保完全键合。</li>
	<li>将键合好的器件在70 °C下烘烤2小时。</li>
</ol>
5. 微流控装置的表面功能化
注意：在进行表面功能化之前，必须根据制造商的方案（参见材料表）校准压力泵，并组装管路以将其连接至微流控装置。
<ol>
	<li>将微流控装置连接至压力泵
	<ol>
		<li>将压力驱动流控器连接至外部气压源（最高可达 6 bar）。至少需要四个独立的空气压力通道：三个 0–2 bar 的独立模块，以及一个 −0.9–4 bar 的模块。</li>
		<li>根据制造商的协议校准压力泵（参见 材料表）。</li>
		<li>将管路（外径 1/16 英寸，内径 0.02 英寸）切成四段等长的部分，每段长约 20 cm。</li>
		<li>在每段管路的一端插入 23 G 不锈钢 90° 弯接头（参见 材料表）。该端随后插入微流控装置的三个入口（OA、LO 和 IA），第四个接头用于去除多余溶液（步骤 5.2.5）。</li>
		<li>将管路的另一端插入微流控储液槽支架，并使用微流控接头密封，确保管路足够长以触及储液槽底部（1.5 mL 管，参见 材料表）。这可防止在 PVA 处理/脂质体生成过程中有不希望的气泡进入微流控装置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PVA 对出口通道的处理 
	注意：在生成脂质体之前，必须使装置在生成结点下游的部分区域具有一定的亲水性。这可通过使用 5% (w/v) 聚乙烯醇（PVA）溶液处理这些通道来实现。PVA 溶液的制备方法是将 PVA 粉末（参见 材料表）在 80 °C 下溶于水中，持续磁力搅拌 3 小时。使用前需过滤该溶液。装置键合后，由于等离子体诱导的表面活化作用，微流控通道初始呈亲水性，但会逐渐恢复疏水性。建议在烘烤（步骤 4.6）后等待 2 小时再开始 PVA 处理。
	<ol>
		<li>取 200 µL 的 5% w/v PVA 溶液加入 1.5 mL 离心管中，并将其连接至微流控储液槽支架。插入管路（即步骤 5.1.3 中提到的管路），使一端浸入 PVA 溶液中，另一端连接至微流控装置 OA 通道的入口。 
		注意：PVA 浓度过低可能导致表面功能化效果不佳。</li>
		<li>重复上述步骤，但不使用 PVA 溶液（使用空的 1.5 mL 管），并将其连接至 LO 和 IA 通道。</li>
		<li>将 OA 相的压力提高至 100 mbar，使 PVA 溶液在 OA 通道中流动。将 IA 和 LO 相的压力提高至 120 mbar，以防止 PVA 溶液倒流进入这些通道（图 2E）。 
		注意：如有需要，可调节各通道的压力，以保持生成结点处弯月面稳定。</li>
		<li>以这种方式使 PVA 溶液流动约 5 分钟，确保出口通道完全功能化。</li>
		<li>为去除 PVA 溶液，先将管路从 OA 入口断开，立即提高 LO 和 IA 通道的压力至 2 bar。同时，使用连接至负压通道（−900 mbar）的管路，先从出口通道、再从 OA 入口去除多余的 PVA 溶液（图 2F）。</li>
		<li>将装置在 120 °C 下烘烤 15 分钟，冷却后即可使用。该装置可在常温环境下储存至少 1 个月。 
		注意：建议在进行 OLA 操作前于室温下静置 1 天，以确保未经处理的 PDMS 在等离子体处理后恢复其疏水性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6.&#160;辛醇辅助脂质体组装（OLA）
<ol>
	<li>准备脂质储备液 
	注意：此处以1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)（Liss Rhod PE）脂质混合物为例（参见材料表）；用户应以类似方式配制所需组成的脂质。
	<ol>
		<li>使用不同的玻璃注射器，将76 µL DOPC（25 mg/mL）和16.6 µL Liss Rhod PE（1 mg/mL）加入圆底烧瓶中。</li>
		<li>保持圆底烧瓶直立，使用压缩N2&#160;吹扫枪向瓶内通入温和的氮气流，以蒸发氯仿并在瓶底形成干燥的脂质膜。</li>
		<li>将烧瓶置于真空干燥器中，在持续真空条件下至少放置2小时，以去除残留的氯仿。</li>
		<li>向圆底烧瓶中加入100 µL乙醇，随后轻轻吹打或振荡，确保脂质完全溶解，形成10%（w/v）的脂质储备液。 
		注意：若某种特定脂质组成在乙醇中不能完全溶解，可使用乙醇/氯仿混合溶剂，但应尽可能减少氯仿的体积。</li>
		<li>将溶液转移至避光玻璃小瓶中。使用吹扫枪向瓶内通入氮气，置换空气以形成惰性气氛。用石蜡膜密封瓶盖，并在−20 °C下保存。 
		注意：该储备液可使用数月。每次打开小瓶时，应轻柔地用氮气置换空气，并重新用石蜡膜密封瓶盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备OLA溶液
	<ol>
		<li>配制必需组分的储备液：20 mM葡聚糖（分子量6,000）；60%（v/v）甘油；以及任选缓冲液。本实验中配制了5倍浓度的磷酸盐缓冲液（0.68 M NaCl，13.5 mM KCl，50 mM Na2HPO4，9 mM KH2PO4；pH 7.4）（参见材料表）。 
		注意：由于纯甘油黏度较高，建议将移液枪头末端斜向剪去一小段，以便有效移取。</li>
		<li>分别准备100 µL的内相（IA）、脂质-油相（LO）和出口溶液（ES，即用于填充收集腔的所需溶液）。为便于观察，本实验在IA溶液中添加了黄色荧光蛋白（YFP）。通过计算包封组分的渗透压，并在必要时向OA中加入适量糖或盐，检查IA与OA之间的渗透平衡。此步骤旨在防止脂质体在制备过程中破裂或收缩。 
		注意：三相的最终组成为： 
		IA：15%甘油，5 mM葡聚糖（分子量6,000），5.4 µM YFP，1倍PBS 
		OA：15%甘油，5% F68表面活性剂，1倍PBS 
		&#8203;ES：15%甘油，1倍PBS 
		F68表面活性剂浓度过低会负面影响双乳液的生成。</li>
		<li>通过将4 µL脂质储备液加入76 µL 1-辛醇中（参见材料表），用移液枪配制80 µL的LO相。DOPC的终浓度为5 mg/mL。</li>
		<li>在进行微流控实验前，将样品以700 x g离心60秒，以去除任何大尺寸聚集体。此举可防止明显的堵塞物进入微流控芯片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂质体制备
	<ol>
		<li>将溶液（IA、LO、OA）分别加入三个1.5 mL离心管中，按步骤5.1所述组装，并连接至经PVA处理的微流控芯片（步骤5.2.6）。</li>
		<li>对三个通道施加正压：IA和LO通道约为100 mbar，OA通道约为200 mbar。 
		注意：由于OA压力高于其他两相，OA溶液将最先到达收集腔（EW）；此顺序强烈推荐。</li>
		<li>当OA溶液到达EW后，将OA压力降至100 mbar，同时将LO压力升至200 mbar。&#160; LO溶液到达生成结点时，可能因LO通道中的空气被排出而产生气泡。待气泡排入EW后，将LO压力调节至100 mbar。最后，将IA压力升至200 mbar，并等待IA通道中的所有空气被完全排出。因此，三相到达结点的理想顺序为OA、LO、IA。</li>
		<li>在三通道空气完全排出后，将所有通道压力调整为50 mbar，并向出口腔中加入10 µL ES。加样后，在出口孔上覆盖盖玻片以防止蒸发。若LO发生回流，可逐步以1 mbar为增量缓慢提高LO压力，直至其重新流向结点。</li>
		<li>当三相在结点处开始共流时，确认双乳液生成已启动，并根据其质量进行调节（图3A-C）。应逐步调节压力（每次0.1–1 mbar），避免突变，除非需要改变压力以清除通道中的异常堵塞。 
		注意：需调节的通道取决于结点处的具体情况。例如，若乳滴过大，则需降低IA压力；若双乳液形成但未断裂而是破裂，则需提高OA压力；若辛醇液滴过大，则需降低LO压力。</li>
		<li>检查双乳液液滴是否顺利向下游流动至EW。随着流动，辛醇区域逐渐明显，最终断裂形成脂质体（图3D-F）。确保产后期通道足够长，且双乳液迁移速度足够慢，以完成去润湿过程。 
		注意：在稳定生成开始数分钟后，脂质体和辛醇液滴将离开产后期通道并进入EW。由于辛醇密度低于水，辛醇液滴将上浮至ES表面。而由于IA中添加了葡聚糖，脂质体密度高于周围环境，将沉降至腔室底部，便于后续观察和操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

细胞的复杂性使得在整体水平上研究活细胞时极难理解其行为。通过在体外重建关键组分，降低细胞的冗余性和相互关联性，对于深入理解生物系统以及为生物技术应用构建人工细胞模拟物至关重要22,23,24。脂质体是研究细胞现象的优良简约体系。这些现象包括但不限于：细胞骨架动力学及其引发的膜形变25,26、生物分子凝聚体的时空调控27,28&#160;及其与膜的相互作用29、多种生物分子的包封，包括无细胞转录-翻译系统30、无细胞脂质合成31以及蛋白质的进化32,33,34。脂质体还被广泛用作药物递送载体，并已获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准用于临床11。脂质体和基于脂质的纳米颗粒被用作药物递送载体，包括近期新冠疫苗中的mRNA疫苗35。
本研究详细描述了一种结合光刻、微流控组装和表面功能化的协议，用于在芯片上执行OLA技术以生成脂质体图1 和 图3）。使用OLA制备的脂质体呈单一分散性（变异系数：平均值的4%–11%），粒径处于生物细胞尺寸范围（通常直径为5–50 µm），并通过调节内相和外相水相通道的适当流速实现调控36例如，所观察到的脂质体群体在 图1&#160;粒径分布为 23.3 µm ± 1.8 µm（n = 50）。在10-30 Hz的典型生成频率下，所形成的脂质体为单层结构，此前通过插入单个仅特异性结合双层膜的跨膜蛋白——α-溶血素，已证实了这一点。36，进入膜中，以及使用连二亚硫酸盐漂白实验37OLA 还兼容多种脂质组成，为用户选择脂质提供了灵活性。重要的是，初始使用的脂质组成会直接反映在最终的脂质体组成中38.
作为一种相对较新的技术，OLA 仍有进一步改进的空间。例如，使用聚乙烯醇（PVA）进行表面功能化至关重要，但操作繁琐。若能采用更简便的方法对器件表面进行功能化处理，将显著缩短芯片制备时间，并降低芯片间的差异性。Pluronic F68 表面活性剂是外水相中的重要组分，用于初步稳定双乳液；然而，其应用在某些情况下可能受到限制。用生物相容性更高的表面活性剂替代 Pluronic F68，或完全去除表面活性剂，可能提升系统的通用性。在生成的双乳液经出口通道迁移过程中，可能因剪切力而破裂。因此，优化 OLA 设计以增强双乳液的稳定性并改善辛醇液滴的分离效果，有望提高通量。尽管如此，OLA 仍具有多项优势，主要包括高效的包封能力、单一分散且为单层脂质体的生成，以及可控的芯片上实验操作。
OLA 已被应用于并适应于多种研究，包括脂质体的生长与分裂39、液-液相分离过程27&#160;及其与膜相互作用的研究21，以及理解脂质体中细菌生长与生物产物的形成40。基于 OLA 的高通量检测也被用于研究离子跨膜运输41&#160;和药物在脂质双分子层中的渗透性37，作为治疗用途的药物递送系统42，研究抗菌剂对膜的影响43，以及作为封装液晶的工具44。除了 OLA 技术广泛的应用范围外，针对特定用途的 OLA 改进版本也正在被开发45,46,47,48,49,50。总体而言，在综合考虑其优缺点后，我们坚信 OLA 是一个适用于合成生物学的多功能平台。

所有细胞都以质膜作为其物理边界，这种膜本质上是由两亲性脂质分子自组装形成的脂双层结构。脂质体是生物细胞的最小合成对应物，其内部含有被磷脂包围的水相腔室，磷脂排列成脂双层结构，亲水头部朝向水相，疏水尾部则向内埋藏。脂质体的稳定性由疏水效应、极性基团间的亲水作用、疏水碳链之间的范德华力以及水分子与亲水头部之间的氢键共同决定1,2。根据脂双层的数量，脂质体可分为两大类：单层囊泡（由单个双层构成）和多层囊泡（由多个双层构成）。单层囊泡还可根据其尺寸进一步分类。它们通常呈球形，可制备成多种尺寸，包括小单层囊泡（SUV，直径30–100 nm）、大单层囊泡（LUV，直径100–1,000 nm），以及巨单层囊泡（GUV，&#62;1,000 nm直径）3,4。目前已开发出多种制备脂质体的技术， broadly可分为整体法5&#160;和微流控技术6。常用的整体制备方法包括脂质膜再水化、电形成法、反相乳液转移法和挤出法7,8,9,10。这些方法相对简单且有效，因此在合成生物学领域被广泛使用。然而，它们同时也存在显著缺陷，如粒径分布不均、层状结构难以控制以及包封效率较低7,11。连续液滴界面交叉包封技术（cDICE）12&#160;和液滴喷射与尺寸过滤技术（DSSF）13&#160;在一定程度上克服了这些局限性。
在过去十年中，微流控技术逐渐受到重视。微流控技术利用层流和以扩散为主的质量传递特性，可在用户定义的微通道内对流体流动提供可控的环境。由此开发出的芯片实验室装置，能够以显著减少的样品体积和多重检测能力，实现对分子的时空精确控制14。目前已开发出多种用于制备脂质体的微流控方法，包括脉冲喷射15、双重乳液模板法16、瞬时膜喷射17、液滴乳液转移18和流体动力聚焦19。这些技术可高效、高通量地生成单分散、单层、细胞尺寸的脂质体，并具有高包封效率。
本文详细介绍了基于芯片的微流控八醇辅助脂质体组装（OLA）方法的操作流程，该方法依赖于流体动力学 pinch-off 效应及随后的溶剂去润湿机制20&#160;（图1）。OLA 的工作原理可类比于吹泡泡的过程。六通交汇结构将内水相（IA）、两股携带脂质的有机相（LO）以及两股含表面活性剂的外水相（OA）聚焦于一点，形成水-（脂质+八醇）-水的双重乳液液滴。当这些液滴向下游流动时，界面能最小化、外部剪切流以及与通道壁的相互作用促使溶剂区域脱离，在界面处形成脂质双分子层，从而生成单层脂质体。去润湿过程所需时间取决于八醇区域的大小，通常为数十秒至数分钟。在出口通道末端，密度较低的八醇液滴上浮至表面，而因包封溶液密度较高而更重的脂质体则沉降至观察室底部，便于后续实验操作。作为代表性实验，本文展示了在脂质体内进行液-液相分离（LLPS）的过程：在酸性 pH 条件下将所需组分包封于脂质体内，该条件可抑制 LLPS 的发生；通过外部触发 pH 变化，进而引发跨膜质子通量，最终在脂质体内形成相分离的凝聚液滴。该结果凸显了 OLA 系统在有效包封与操控方面的优异能力。

<table><tbody><tr><td>1-辛醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. 297887</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>10451043</td><td>Eppendorf 3810X 聚丙烯微量离心管</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. A2383</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>Darwin 微流控公司</td><td>PT-T983-05</td><td>直径 0.5 mm 和 3 mm</td></tr><tr><td>柠檬酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. 71405</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. 31388</td><td>分子量 ~6,000</td></tr><tr><td>直写式光刻机</td><td>Durham Magneto Optics Ltd</td><td>MicroWriter ML3 Baby</td><td>设备及软件</td></tr><tr><td>DOPC 脂质</td><td>Avanti</td><td>SKU:850375C</td><td></td></tr><tr><td>F68</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. 24040032</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Corning</td><td>#1, 24 × 40 mm</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. G2025</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Thermo Scientific Acros</td><td>No. 124630010</td><td></td></tr><tr><td>Liss Rhod PE 脂质</td><td>Avanti</td><td>SKU:810150C</td><td></td></tr><tr><td>封口膜（Parafilm）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. P7793</td><td></td></tr><tr><td>光刻胶</td><td>Micro resist technology GmbH</td><td>EpoCore 10</td><td></td></tr><tr><td>光刻胶显影液</td><td>micro resist technology GmbH</td><td>mr-Dev 600</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷</td><td>Dow</td><td>Sylgard 184</td><td>PDMS 及固化剂</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. P7890</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸&amp;ndash;FITC 标记</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. P3543</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>no. P8136</td><td>分子量 30,000&amp;ndash;70,000，87%&amp;ndash;90% 水解</td></tr><tr><td>压力控制器</td><td>Elveflow&amp;nbsp;</td><td>OBK1 Mk3+</td><td>流量控制器</td></tr><tr><td>透明胶带</td><td>Magic Tape Invisible Matt Tape</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>Silicon Materials</td><td>0620R16002</td><td></td></tr><tr><td>匀胶机&amp;nbsp;</td><td>Laurell Technologies Corporation</td><td>Model WS-650MZ-23NPP</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢 90&amp;deg; 弯曲 PDMS 连接器</td><td>Darwin 微流控公司</td><td>PN-BEN-23G</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>No. 252859</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管</td><td>Darwin 微流控公司</td><td>1/16&quot; 外径 × 0.02&quot; 内径</td><td></td></tr><tr><td>紫外激光器&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>波长 365 nm</td></tr></tbody></table>

芯片上辛醇辅助脂质体组装用于生物工程

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

微流控技术是一种广泛使用的工具，可用于以可控且高通量的方式生成各种类型的液滴和囊泡。脂质体是由脂质双层包裹水性内核组成的简单细胞模拟物，在设计合成细胞以及理解生物细胞基本特性方面具有重要价值。 体外 时尚，并且在治疗应用的货物递送等应用科学领域具有重要意义。本文描述了一种片上微流控技术——辛醇辅助脂质体组装（OLA）的详细操作方案，用于制备单一分散、微米尺寸、生物相容的脂质体。OLA 的工作原理类似于吹泡泡：内水相（IA）与周围携带脂质的1-辛醇相被含有表面活性剂的外相流体剪切，从而形成双乳液液滴，并带有突出的辛醇小袋。当脂质双层在液滴界面自组装时，辛醇小袋会自发脱离，形成单层脂质体，可直接用于后续操作与实验。OLA 具有多项优势，例如稳定的脂质体生成（&#62;10 Hz）、生物材料的高效包封、单一分散的脂质体群体，并且仅需极小的样品体积（约 50 µL），这在处理珍贵生物材料时尤为关键。本研究详细介绍了在实验室中建立 OLA 技术所需的微加工、软光刻和表面钝化技术。此外，还通过在脂质体内诱导生物分子凝聚体的形成，展示了该技术在合成生物学中的一项原理验证应用。 通过 跨膜质子流。预计本随附的视频方案将有助于读者在其实验室中建立并优化寡霉素敏感性ATP酶（OLA）实验。

本研究展示了无膜凝聚体的形成 通过 以脂质体中液-液相分离（LLPS）的过程作为代表性实验。
样品制备 
IA、OA、ES 和进料溶液（FS）的制备方法如下：
IA：12% 甘油、5 mM 葡聚糖、150 mM KCl、5 mg/mL 多聚-L-赖氨酸（PLL）、0.05 mg/mL FITC 标记的多聚-L-赖氨酸（PLL-FITC）、8 mM 三磷酸腺苷（ATP）、15 mM 柠檬酸-HCl（pH 4）
OA：12% v/v 甘油，5% w/v F68，150 mM KCl，15 mM 柠檬酸-HCl（pH 4）
ES：12% 甘油，150 mM KCl，15 mM 柠檬酸-HCl（pH 4）
FS：12% 甘油，150 mM KCl，75 mM Tris-HCl（pH 9）
脂质体内部凝聚相的形成 
一种简单的pH敏感性复相共凝聚实验被用于演示脂质体中液-液相分离（LLPS）现象，该实验基于带正电的聚-L-赖氨酸（PLL）与带负电的多价三磷酸腺苷（ATP）之间的相互作用。为防止PLL与ATP在包封过程中发生相分离，溶液pH维持在4，在此条件下ATP呈电中性。通过加入FS（pH为9的缓冲液）提高外部溶液（ES）的pH，质子跨膜流动导致脂质体内部pH逐渐上升，使ATP带负电，进而触发其与带正电的PLL发生相分离。21 (图4A）。在生成脂质体约2小时后，关闭IA和LO的压力。保持OA通道压力为100 mbar，以缓慢将残留的脂质体流入观察室。当通道内所有脂质体均被回收至EW后，关闭压力以停止流动并防止脂质体继续移动。在较低pH条件下生成的脂质体在其腔内显示出均匀的荧光（来自包封的荧光标记PLL-FITC）图 4B,D用移液管小心吸除漂浮在表面的辛醇液滴 5 µL 从上清液中吸取溶液，以防止影响后续的移液步骤。随后， 10 µL 向EW中加入FS缓冲液，诱导了包封的PLL和ATP发生相分离。每个脂质体中原本均匀的FITC荧光逐渐转变为明显的荧光凝聚液滴。最终，各个小液滴融合成一个更大的凝聚液滴，并在脂质体内自由扩散（图4C,E-G).
<img alt="双乳液制备装置示意图；微流控系统中脂质体及口袋结构的形成。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65032/65032fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：OLA装置组装与工作原理示意图。 压力控制器连接至分别盛有外水相、含脂质的辛醇溶液和内水相溶液的储液池。插入储液池中的管路分别连接至OLA装置对应的进样口。通过调节三个通道中的适当流速，可形成水-（含脂质辛醇）-水的双乳液结构。生成的双乳液向出口孔迁移，在此过程中辛醇相分离并形成脂质体。最终形成的脂质体聚集于孔底部，可用于观察及后续实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/65032fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微加工工艺：光刻、器件制备、表面处理的示意图序列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65032/65032fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：OLA 芯片的制备（光刻、微加工、表面处理）。（A）数字设计图，展示 OLA 设计的关键结构特征，包括三个进样口、一个出样口以及一个六通反应交汇区。（B）掩模母版晶圆的示意图，显示通过紫外光刻技术同时制备多个 OLA 设计结构。（C）将 PDMS 弹性体浇注在母版晶圆上，置于铝箔制成的模具中，并在 70 °C 下烘烤 2 小时以完成固化。（D）通过氧等离子体处理将微流控器件键合，其中含有 OLA 结构的 PDMS 块被固定在涂有 PDMS 的玻璃载玻片上。（E）对制备完成的芯片进行表面功能化处理，使其部分区域具有亲水性。该过程通过从外侧水相通道向出口通道流动 5% w/v 的聚乙烯醇（PVA）溶液持续 5 分钟实现。其他通道施加正向气压，防止 PVA 溶液进入这些通道。（F）通过在出口通道施加真空去除 PVA。器件在 120 °C 下烘烤 15 分钟后即可使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/65032fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微流控脂质包封；明场与荧光显微镜；脂质体形成。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65032/65032fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：OLA高效生成单分散双乳液并最终形成具有优异包封率的脂质体的演示。（A）明场图像显示双乳液液滴的快速生成。（B）荧光脂质通道显示由于部分去润湿而形成的辛醇小室。脂质-辛醇相包含DOPC（5 mg/mL）和Lis Rhod PE，比例为1,000:1。（C）内层水相通道显示黄色荧光蛋白（YFP）的包封。（A-C）中的插图展示了各图板的代表性放大视图（比例尺 = 10 µm）。（D-F）出口通道中辛醇小室的去润湿过程，最终形成脂质体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/65032fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多聚赖氨酸/ATP 共沉淀，pH 触发；显微镜图像，强度与距离的关系图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65032/65032fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：脂质体中 pLL/ATP 的 pH 触发液-液相分离。 （A）脂质体内包封的 pLL 与 ATP 均相溶液（左）转变为相分离的 pLL/ATP 共沉淀（右）的 pH 依赖性过程示意图。脂质体内的初始酸性环境使 ATP 分子电荷呈中性，从而抑制共沉淀的发生；当脂质体内部 pH 随外部 pH 升高而达到平衡时，ATP 获得负电荷，从而触发共沉淀。 （B-C）线图（分别对应于图 [D] 和 [G] 中的虚线），显示 pLL（绿色通道）和膜（红色通道）的空间分布。 （D-G）时间序列图像，展示脂质体中 pLL/ATP 共沉淀的形成过程。外部加入碱性缓冲液后，脂质体内部 pH 在数分钟内逐渐升高，并启动共沉淀过程。t = 0 min 表示首次共沉淀事件发生前的时刻。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/65032fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充代码文件 1：OLA 设计的 CAD 文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65032/OLA%20device%20design.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了辛醇辅助脂质体组装（OLA）技术，这是一种用于生成生物相容性脂质体的微流控方法。OLA 可制备出单一分散、微米尺寸的脂质体，并实现高效的包封，支持在芯片上立即开展实验。该方案预计特别适用于合成生物学与合成细胞研究。

微流控技术是一种广泛使用的工具，可实现对多种类型液滴和囊泡的可控且高通量的生成。脂质体是……

OLA 是一种多功能的微流控平台，对合成生物学领域，特别是人工细胞的生物工程构建具有重要价值。基于 OLA 制备的脂质体有助于我们理解生物学中的自组织原理，并构建模拟细胞的组装体系。OLA 能够以高通量的方式制备单一分散、单层、细胞大小的脂质体，并具有优异的包封效率。该方法仅需极小的样品体积，约为 50 微升，且所形成的脂质体可立即用于后续芯片上的实验。OLA 适用于研究微限域内的生物反应、囊泡动力学以及生物分子凝聚体及其与膜的相互作用。OLA 还被用作高通量药物筛选平台，例如用于测试抗菌剂的渗透性和膜活性。表面功能化（即 PV 处理）是该方案中的关键步骤，需谨慎操作，以防止 PV 溶液进入内部含水相以及携带脂质的有机相通道。此外，生产后的通道长度应恰好足以实现辛醇液滴的分离，从而形成脂质体。来自我实验室的博士生 Ketan Ganar 将协助张昌演示该实验步骤。首先，取一个直径为四英寸的洁净硅片，并使用加压空气进一步清洁，以去除任何灰尘颗粒。将硅片固定在匀胶机上，然后轻轻在硅片中心滴加约五毫升负性光刻胶。为获得厚度为10微米的光刻胶层，首先将旋涂参数设置为500 RPM，持续30秒，加速度为100 RPM/秒，用于初始铺展；随后以500 RPM/秒的加速度加速至3,000 RPM，继续旋涂60秒。然后对晶圆进行旋涂。将晶圆置于加热板上，在65°C下烘烤2分钟，随后在95°C下烘烤5分钟。待晶圆冷却后，将其安装至直写式光学光刻机的打印腔室中，并将辛醇辅助脂质体组装（OLA）设计导入软件。设计打印完成后，先在65摄氏度下烘烤晶圆1分钟，随后在95摄氏度下烘烤3分钟。为洗去未固化的光刻胶，将晶圆浸入盛有显影液的玻璃烧杯中，直至未固化光刻胶完全去除。在 150 摄氏度下对晶圆进行 30 分钟的硬烘烤，以确保打印的图案牢固地附着在晶圆表面，并且在后续的加工过程中不会脱落。为制备微流控装置，将主晶圆放置在一块方形铝片上，并用铝箔包裹晶圆，形成类似井状的结构。轻轻将 PDMS 混合物倒入主晶圆上。将组装件置于70摄氏度的烘箱中孵育至少两小时。将主晶圆从烘箱中取出并使其冷却。为去除固化的聚二甲基硅氧烷（即PDMS块），先移去铝箔，然后从晶圆边缘小心地剥离PDMS块。取一片透明玻璃盖玻片，将约 0.5 毫升的 PDMS 倒在玻片中央，通过轻轻倾斜玻片使 PDMS 均匀铺展至整个盖玻片表面，确保 PDMS 完全覆盖玻片。将玻片安装到旋涂仪上，确保其位于中心位置，使玻片中心与压力轴中心重合。然后以每秒100转的增速将玻片以500转/分钟的速度旋转15秒，再以每秒500转的增速升至1,000转/分钟并旋转30秒。将PDM涂层玻片涂层面朝上放置在覆盖的培养皿内一个抬高的平台（如一块PDMS）上。在70摄氏度下烘烤两小时。将带有刻蚀通道的PDMS块和PDMs包被的玻片（包被面朝上）放入等离子清洗仪的真空腔中。开启真空泵，以12兆赫的射频对腔内物质进行15秒的空气等离子体处理，以活化表面。氧气等离子体呈现粉红色光晕。等离子处理后，立即将PDMS涂层的玻片放置在洁净表面上，PDMS面朝上。轻轻将带有微流控图案的PDMS块置于其上，使微流控图案面朝向PDMS涂层的玻片，使其自然键合。将键合好的器件在70摄氏度下烘烤两小时。取200微升5%聚乙烯醇（PVA）或OVA溶液，加入1.5毫升离心管中，并将其连接至微流控储液池支架。插入导管，使一端浸入PVA溶液中，另一端连接至微流控装置外水相通道的入口。将外水相压力升至100毫巴，使PVA溶液流入外水相通道。将内层水相和载脂有机相的压力增加至120毫巴，以防止PVA溶液倒流进入这些通道。以这种方式使PVA溶液流动约五分钟，确保出口通道完全功能化。将载脂有机相和内层水相通道的压力升至2巴，以清除PVA溶液，并立即从外层水相入口处拆下管路。同时，使用连接至负压通道的管路从出口通道中移除多余的PVA。将装置在120摄氏度下烘烤15分钟，然后冷却至室温后再使用。该装置可在常温条件下保存至少一个月。将溶液分装至三个1.5毫升离心管中并组装好。将其连接至经PVA处理的微流控芯片，并对三个通道施加正压，内层水相和携带脂质的有机相通道压力约为100毫巴，外层水相通道压力约为200毫巴。当三个相在交汇处开始共流后，确保双乳液生成开始，并根据其质量调节压力。当双重乳液液滴流动时，辛醇全囊泡变得越来越明显，最终被掐断，形成脂质体。此处展示了快速生成双重乳液液滴的明场图像。荧光脂质通道显示了由于部分去润湿而形成的辛醇全囊泡。内部水相通道显示了黄色荧光蛋白的包封。该图展示了出口通道中辛醇小室去润湿并形成脂质体的过程。该图像表示脂质体内包封的聚赖氨酸与ATP均相溶液在pH依赖性条件下转变为相分离的聚赖氨酸-ATP凝聚体的示意图。脂质体内部初始的酸性环境使ATP分子呈电中性，从而抑制了共凝聚现象。当脂质体内部pH值随着外部pH升高而达到平衡时，ATP获得负电荷，进而触发共凝聚。本图展示了多聚赖氨酸与膜的空间分布，以及脂质体内多聚赖氨酸-ATP共凝聚体形成的延时图像。通过外部添加基础缓冲液，可在数分钟内提高脂质体内部的pH值，从而启动凝聚作用。时间零点（T等于零分钟）指的是首次发生凝聚现象之前的时刻。在演示操作过程中，必须耐心调节通道压力，以确保生成稳定的双重乳液。OLA 及其各种变体已被应用于多种研究中，例如脂质体的生长与分裂、生物大分子凝聚体动力学的研究、无细胞蛋白质表达以及细菌的包封。因此，综上所述，我们认为 OLA 是一个适用于合成生物学的多功能平台。

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科研

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Bioengineering

生物工程

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