Name: 使用荧光激活细胞核分选的脂肪细胞特异性ATAC-Seq与脂肪组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学习使用荧光激活细胞核分选技术对脂肪细胞进行ATAC-Seq分析的方法。该方法利用转基因报告小鼠的脂肪组织，有效减少线粒体DNA污染，生成高质量染色质可及性数据，适用于研究基因调控机制。

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本研究由印第安纳大学医学院Showalter研究信托基金（资助编号：H.C.R.）、印第安纳大学医学院糖尿病与代谢疾病研究中心试点与可行性研究资助（资助编号：H.C.R.）、美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（资助编号：R01DK129289，授予H.C.R.）以及美国糖尿病协会青年教员奖（资助编号：7-21-JDF-056，授予H.C.R.）提供支持。

动物饲养和实验操作均按照印第安纳大学医学院机构动物护理和使用委员会批准的程序进行。
1. 实验开始前的准备工作
<ol>
	<li>组织准备
	<ol>
		<li>为了标记脂肪细胞的细胞核，将 NuTRAP 小鼠与脂肪细胞特异性的脂联素-Cre 小鼠品系（Adipoq-Cre）杂交，以生成 Adipoq-NuTRAP 小鼠，该小鼠对 Adipoq-Cre 和 NuTRAP 均呈半合子状态。</li>
		<li>按照先前描述的方法，从 Adipoq-NuTRAP 小鼠中解离出目标脂肪组织14。</li>
		<li>将组织在液氮中迅速冷冻，并于 −80 °C 保存至使用。
		 
		注意：每个脂肪垫可整体保存，冷冻组织可在使用前于干冰上切割成较小片段（约 50 mg）用于实验。或者，也可在切割后分装至离心管中冷冻保存（每管约 50 mg）。冷冻样品在使用前严禁解冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>缓冲液配制
	 
	注意：实验过程中所有缓冲液均需保持在冰上。
	<ol>
		<li>配制细胞核提取缓冲液（NPB）：250 mM 蔗糖、10 mM HEPES（pH 7.5）、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2 和 0.1% NP40。每份样品准备 7 mL NPB。使用前新鲜加入 100x 蛋白酶抑制剂混合物（终浓度 1x）、DTT（终浓度 1 mM）和 Hoechst（终浓度 1 µg/mL）。
		 
		注意：建议现配现用 NPB，但也可在 4 °C 保存最多 1 个月。</li>
		<li>配制含 0.1% NP-40 的 1x 磷酸盐缓冲盐水（PBS-N）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞核分离
<ol>
	<li>将玻璃Dounce匀浆器（每个样品使用一个）置于冰上预冷，然后向每个玻璃Dounce中加入7 mL NPB混合液。 
	注意：建议每次实验最多处理八个样品。若处理超过八个样品，所有步骤将显著延迟，尤其可能在分选过程中降低细胞核的质量。</li>
	<li>将冷冻的脂肪组织（50–100 mg）放入玻璃Dounce中，立即用长柄剪刀剪成若干小块。所有样品先用松配合研杵上下研磨10次，再用紧配合研杵研磨10次。 
	注意：脂肪组织较软，剪成数个小块即可。对于稀有样品，可使用更小的组织块（10–20 mg），但所获得的脂肪细胞核数量可能有所差异。</li>
	<li>通过100 µm滤网过滤至新的50 mL离心管中。将滤过的匀浆液倾倒入新的15 mL离心管中。在摆桶离心机中，4 °C、200 × g 离心10分钟，尽可能去除上清液。 
	注意：先用真空抽吸去除大部分上清，再用移液器移除残留液体。</li>
	<li>通过轻柔而充分的手指轻弹，将沉淀重悬于500 µL PBS-N中。 
	注意：避免使用移液器吹打，以免损伤细胞核。</li>
	<li>用移液器轻柔地将悬液通过40 µm滤网过滤至新的50 mL离心管中。用250 µL PBS-N冲洗滤网。使用移液器将过滤后的细胞核重悬液转移至流式细胞分选（FACS）管中。 
	&#8203;注意：如有条件，可使用适用于较小体积的离心管和细胞滤网，以尽量减少样品损失。</li>
</ol>
3. 细胞核分选
<ol>
	<li>收集管的准备
	<ol>
		<li>向新的 1.5 mL 离心管中加入 500 µL PBS-N，轻轻颠倒数次，使缓冲液润湿管内所有表面。</li>
		<li>短暂离心以使液体沉降至管底，随后将管子置于冰上预冷，待用于分选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FACS（图 2）
	<ol>
		<li>使用 FSC-A/FSC-H 设门排除多重体，并使用 FSC-A/SSC-A 设门去除小或大的碎片。</li>
		<li>圈选 mCherry/GFP 阳性的脂肪细胞核群体。</li>
		<li>将 10,000 个细胞核收集至步骤 3.1 中准备好的每个收集管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分选后细胞核的处理
	<ol>
		<li>向每个收集管中加入 500 µL PBS-N，轻轻颠倒数次以混匀。</li>
		<li>将收集管在 4 °C 条件下，以 200 × g 离心 10 分钟（使用摆桶式离心机），彻底去除上清液。 
		注意：先用真空装置去除气泡，倾倒上清液，再用纸巾彻底吸除残留液体。此时沉淀不可见。在离心过程中，按以下说明配制 Tn5 主混合液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Tn5 转座片段化（表 1）
<ol>
	<li>配制25 µL Tn5预混液：混合12.5 µL 2x tagmentation DNA缓冲液（TD缓冲液）、1.25 µL Tn5转座酶（TDE I酶）和11.25 µL无核酸酶水。</li>
	<li>将25 µL Tn5预混液加入每个细胞核沉淀中，轻轻吹打重悬。使用恒温混匀仪在37 °C、600 rpm条件下孵育30分钟。</li>
</ol>
5. DNA 纯化
注意：以下步骤使用的是 材料表 中提到的 PCR 纯化试剂盒。也可使用其他类似的 DNA 纯化方法。
<ol>
	<li>在步骤4.2获得的25 µL Tn5核重悬液中加入25 µL无核酸酶水。每份样品最终体积为50 µL。</li>
	<li>加入250 µL PB缓冲液。</li>
	<li>加入5 µL 3 M乙酸钠（NaOAc）（pH 5.2）。</li>
	<li>将混合物转移至离心柱（随所引用试剂盒提供），在室温（RT）下以17,900 × g 离心1分钟。</li>
	<li>弃去穿流液，将离心柱放回同一收集管中。加入750 µL含无水乙醇（EtOH）的PE缓冲液，在室温（RT）下以17,900 × g 离心1分钟。</li>
	<li>弃去穿流液，将离心柱重新放回同一收集管中，在室温（RT）下以17,900 × g 离心1分钟，随后丢弃收集管及穿流液。</li>
	<li>为洗脱DNA片段，将离心柱装入新的1.5 mL离心管，加入10 µL EB缓冲液，室温静置3分钟，然后在室温（RT）下以17,900 × g离心1分钟。 
	&#8203;注意：样品可在4 °C保存数天，或在−20 °C保存数周。</li>
</ol>
6. PCR 扩增（表 2）
注意：本研究中使用的引物列于表3中。
<ol>
	<li>为了扩增转座后的DNA片段，配制PCR主混合液，但暂不加入特异性的Ad2.n条形码引物（引物#2）。每份样本使用38 µL PCR主混合液：11 µL无核酸酶水、2 µL 25 µM Ad1_noMX引物（引物#1）和25 µL 2x PCR主混合液。</li>
	<li>将38 µL PCR主混合液加入0.2 mL PCR管中。</li>
	<li>加入10 µL步骤5.7中洗脱的DNA片段。</li>
	<li>加入2 µL 25 µM引物#2，该引物需针对每个样本特异。</li>
	<li>按照表2中指定的循环条件运行PCR。</li>
</ol>
7. 实时定量 PCR（qPCR）检测（表4）
注意：此步骤旨在确定扩增 DNA 所需的额外循环次数。该步骤为可选，但强烈建议执行，特别是对于新实验。
<ol>
	<li>配制qPCR主混合液，暂不加入引物#2。每份样品使用9.975 µL qPCR主混合液：包含4.41 µL无核酸酶水、0.25 µL 25 µM引物#1、5 µL 2x PCR主混合液和0.09 µL 100x SYBR Green I。 
	注意：配制100x SYBR Green I时，需用无核酸酶水将10,000x储存液稀释。由于qPCR主混合液中使用的100x SYBR Green I体积极小，建议额外单独配制稀释后的100x SYBR Green I主混合液（例如，适用于8–10个样品）。</li>
	<li>将9.975 µL qPCR主混合液加入qPCR板的每个孔中。</li>
	<li>向每个孔中加入0.25 µL 25 µM引物#2。 
	注意：务必加入与第6.4步中各特定样品所加引物#2相匹配的同一种引物#2。</li>
	<li>加入第6.5步PCR扩增后获得的5 µL PCR反应产物，通过移液混匀。 
	注意：剩余的45 µL PCR反应产物将用于第二次PCR扩增。</li>
	<li>按照表5中指定的循环条件运行qPCR。</li>
	<li>检查扩增曲线，并通过估算达到最大值约35%时所对应的循环数，确定所需的额外PCR循环次数（图3A）。 
	注意：通常情况下，10,000个细胞核需要额外进行5至8个PCR循环。</li>
</ol>
8. 附加的 PCR 扩增
<ol>
	<li>根据步骤 7.6 的计算结果（表 6），使用 PCR 反应中剩余的全部 45 µL 进行 PCR 扩增。 
	&#8203;注意：每个样本可能需要不同数量的扩增循环。</li>
</ol>
9. 使用PCR纯化试剂盒进行第二次DNA纯化
<ol>
	<li>采用与第5节相同的步骤，但使用20 µL缓冲液EB洗脱扩增的DNA片段。</li>
</ol>
10. DNA 片段大小筛选
注意：使用固相可逆固定化磁珠，具体方法如下所述。也可根据制造商说明书使用其他类似的DNA纯化磁珠。SPRI磁珠悬浮液在使用前应于室温下旋转充分重悬并平衡。
<ol>
	<li>将洗脱的DNA转移至新的PCR管中，加入80 µL洗脱缓冲液EB，使终体积为100 µL。</li>
	<li>加入55 µL SPRI磁珠（0.55倍样本体积），用移液器吹打混匀。室温孵育5分钟，然后将PCR 8联管置于小型磁力架上静置5分钟以分离磁珠。</li>
	<li>将150 µL上清液转移至新的PCR管中。加入95 µL SPRI磁珠，用移液器吹打混匀。 
	注意：上清液中含有约500 bp或更小片段的DNA。</li>
	<li>室温孵育5分钟，然后再次置于小型磁力架上静置5分钟。小心弃去上清液。</li>
	<li>用200 µL 70%乙醇洗涤磁珠1分钟，重复洗涤两次，共洗涤三次。 
	注意：洗涤过程中请勿将PCR管从磁力架上移开。</li>
	<li>最后一次洗涤后，在1,000 × g离心1分钟，用移液器吸除残留的乙醇。将管盖打开，在PCR仪中37 °C干燥2分钟。 
	注意：磁珠沉淀干燥后应仅出现少量细微裂纹，避免过度干燥。</li>
	<li>用20 µL洗脱缓冲液EB重悬沉淀，吹打混匀后室温孵育5分钟。置于小型磁力架上静置5分钟，然后将含有最终文库的18 µL上清液转移至新的1.5 mL离心管中。 
	&#8203;注意 文库可在进行质量检测时于−20 °C保存。</li>
</ol>
11. 使用荧光计进行DNA定量
<ol>
	<li>配制主混合液时，将200倍浓度的高灵敏度（HS）dsDNA试剂用dsDNA HS缓冲液稀释，得到终浓度为1倍的主混合液。</li>
	<li>对于标准品，向荧光计管中加入190 µL的1倍主混合液以及10 µL的标准品1或标准品2。 
	注意：在开始定量前，将标准品置于室温避光条件下平衡。</li>
	<li>对于文库样品，向各自的荧光计管中加入198 µL的1倍主混合液和2 µL的每个样品。 
	注意：若样品量有限，可将样品体积减少至1 µL，同时将1倍主混合液体积增加至199 µL。</li>
	<li>涡旋或振荡荧光计管，室温避光静置5分钟，然后使用荧光计的dsDNA HS检测法测定DNA浓度。</li>
</ol>
12. 采用高灵敏度电泳系统进行文库质量检测
<ol>
	<li>取ATAC-seq文库，用无核酸酶水稀释至终浓度为1–5 ng/µL。</li>
	<li>按照制造商的说明书，使用高灵敏度的自动化电泳系统分析ATAC-seq文库的片段大小分布。</li>
</ol>
13. 使用靶向qPCR对ATAC-seq文库进行质量检测
<ol>
	<li>取 5–10 ng ATAC-seq 文库，用 50 µL 无核酸酶水稀释。</li>
	<li>使用针对脂肪细胞中已知具有活性的启动子和增强子的引物，按照 表 7 中指定的扩增条件进行 qPCR。</li>
	<li>使用靶向封闭/沉默基因组区域的阴性对照引物（表 7）。</li>
	<li>计算启动子/增强子相对于阴性对照的富集倍数（表 8）。 
	&#8203;注意：成功样本的富集倍数通常应达到 ≥10–20 倍。</li>
</ol>
14. 测序
<ol>
	<li>提交ATAC-seq文库进行测序。使用双端测序（2 × 34 bp、2 × 50 bp或更长），每个样本平均测序读段数为1000万至3000万条。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明，他们对本文所述研究不存在任何相关或重大的经济利益。

本文中，我们介绍了一种优化的ATAC-seq实验方案，用于评估脂肪细胞特异性的染色质可及性 体内该使用Adipoq-NuTRAP小鼠的ATAC-seq方案成功获得了脂肪细胞特异性的染色质可及性图谱。成功且可重复的ATAC-seq实验最关键的因素是细胞核质量。分离的脂肪组织必须立即在液氮中速冻，并在使用前安全保存于−80 °C，避免反复冻融。在细胞核分离与分选过程中，防止脂肪细胞核损伤也至关重要。样品操作过程中必须轻柔处理 通过 在细胞核分离的整个过程中，采用低速离心并尽量减少移液操作。 
在细胞核分选过程中仔细设门对于选择性分离mCherry/GFP标记的脂肪细胞核至关重要（图1）。必须确保mCherry/GFP阳性与阴性群体之间有清晰的分离。同样，轻柔操作和快速分选对于保持细胞核内染色质的天然状态十分必要。如果荧光信号较弱、分选时间过长，和/或脂肪细胞组分偏离预期范围，则提示样本可能存在异常，或细胞核分离过程出现问题。本方案可根据具体实验条件进行调整。首先，ATAC-seq所需的细胞核...

脂肪组织是一种特化用于以脂质分子形式储存多余能量的关键器官，在代谢调控中发挥重要作用。严格调控脂肪细胞的形成与维持，对脂肪组织功能及全身能量稳态至关重要1许多转录调控因子在脂肪细胞分化、可塑性和功能调控中发挥关键作用；其中一些调控因子与人类代谢紊乱相关2,3高通量测序技术在基因表达和表观基因组分析方面的最新进展，进一步推动了脂肪细胞生物学分子调控因子的发现4利用脂肪组织进行分子谱型研究由于该组织的异质性而面临挑战。脂肪组织主要由负责脂肪储存的脂肪细胞构成，但也包含多种其他细胞类型，如成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。5此外，脂肪组织的细胞组成会因温度和营养状态等病理生理变化而发生显著改变6为解决这些问题，我们先前开发了一种名为核标记与翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）的转基因报告小鼠，该小鼠可在Cre重组酶依赖的方式下表达GFP标记的核糖体和mCherry标记的生物素化细胞核7双标记系统能够实现对组织中特定细胞类型的转录组和表观基因组分析。通过将NuTRAP小鼠与脂肪细胞特异性的脂联素-Cre品系（Adipoq-NuTRAP）杂交，我们先前已对纯化的脂肪细胞群体的基因表达谱和染色质状态进行了表征。 体内 并确定它们在肥胖过程中如何发生变化7,8此前，通过将 NuTRAP 小鼠与褐色和米色脂肪细胞特异性的 Ucp1-Cre 小鼠品系杂交（Ucp1-NuTRAP），我们得以表征稀有的产热型脂肪细胞群体——米色脂肪细胞——在温度变化下的表观基因组重塑过程9.
ATAC-seq 是一种广泛使用的分析方法，用于评估全基因组范围内的染色质可及性。ATAC-seq 中使用的高活性 Tn5 转座酶可通过在细胞核染色质可及区域插入测序接头，从而识别开放的染色质区域10。ATAC-seq 方法操作简便，但结果稳健，即使在低起始量样本中也具有很高的效率。因此，它已成为最受欢迎的表观基因组分析方法之一，有助于在多种生物学背景下理解基因表达的调控机制。自最初的 ATAC-seq 方案建立以来，已衍生出多种 ATAC-seq 相关技术，以针对不同类型的样本对原始方案进行修改和优化。例如，Fast-ATAC 专为分析血液细胞样本而设计11，Omni-ATAC 是针对冷冻组织样本优化的方案12，而 MiniATAC-seq 则适用于早期胚胎分析13。然而，将 ATAC-seq 方法应用于脂肪细胞，尤其是组织来源的脂肪细胞，仍然具有挑战性。除了脂肪组织本身的异质性外，其高脂含量即使在细胞核分离后，也可能干扰 Tn5 转座酶的有效重组反应。此外，脂肪细胞（特别是棕色和米色脂肪细胞）中线粒体含量较高，会导致严重的线粒体 DNA 污染，浪费大量测序数据。本文介绍了一种利用 Adipoq-NuTRAP 小鼠进行脂肪细胞特异性 ATAC-seq 的实验方案（图 1）。该方案利用荧光标记的细胞核分选技术，能够从其他干扰性细胞类型中分离出高纯度的脂肪细胞核，并有效去除脂质、线粒体和组织碎片。因此，该方案可在减少起始样本量和试剂用量的前提下，获得细胞类型特异性的高质量数据，并显著降低线粒体序列读数造成的资源浪费。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;动物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adiponectin-Cre 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>NuTRAP 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>29899</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂 &amp;和材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA-LoBind 管</td><td>Eppendorf</td><td>86-923</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m细胞滤筛</td><td>Falcon</td><td>352-360</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>525-1071</td><td></td></tr><tr><td>2x TD缓冲液</td><td>Illumina</td><td>15027866</td><td></td></tr><tr><td>384孔PCR板</td><td>应用生物系统公司</td><td>4483285</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m细胞滤筛</td><td>Falcon</td><td>352-340</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>525-1077</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 试剂（SPRI 磁珠）</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 试剂盒</td><td>安捷伦科技</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>透明粘性薄膜</td><td>应用生物系统</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>无DNase/RNase的蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 组织研磨器</td><td>DWK生命科学</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 侧边裙板磁铁</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>28719128</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Boston BioProducts</td><td>BBH-75</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>2134015</td><td></td></tr><tr><td>KCl（2 M）</td><td>Boston BioProducts</td><td>MT-252</td><td></td></tr><tr><td>用于PCR 8联管条的磁力分离架</td><td>EpiCypher</td><td>10-0008</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;(1 M)</td><td>Boston BioProducts</td><td>MT-200</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext 高保真 2x PCR 预混液</td><td>BioLabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8孔排管</td><td>美国科学</td><td>1402-4708</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物（100倍浓缩液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>78439</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I（10,000×）</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>TDE I 酶</td><td>Illumina</td><td>15027865</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td>FACSAria Fusion</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 荧光仪</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>QuantStudio?5</td><td></td></tr></tbody></table>

使用荧光激活细胞核分选技术对脂肪组织进行脂肪细胞特异性atac-seq

Adipocyte-Specific ATAC-Seq with Adipose Tissues Using Fluorescence-Activated Nucleus Sorting

利用高通量测序检测转座酶可及性染色质（ATAC-seq）是一种强大的技术，可实现全基因组范围的染色质可及性分析。该技术在理解多种生物过程中基因表达调控机制方面具有重要价值。尽管ATAC-seq已针对多种样本类型进行了优化，但目前尚无针对脂肪组织的有效ATAC-seq方法改良方案。脂肪组织面临的挑战包括复杂的细胞异质性、高脂含量以及严重的线粒体污染。为克服这些问题，我们开发了一种通过荧光激活细胞核分选技术，结合转基因报告小鼠——核标记与翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）模型中的脂肪组织，实现脂肪细胞特异性ATAC-seq的实验方案。该方案能够在减少细胞核投入量和试剂用量的同时，获得高质量数据，并显著降低测序读段的浪费。本文提供了经验证的、适用于从小鼠脂肪组织中分离的脂肪细胞核进行ATAC-seq的详细分步操作指南。该方案将有助于研究多种生物学刺激下脂肪细胞中染色质动态变化，从而推动新的生物学发现。

为了使用本ATAC-seq方案分析脂肪组织，我们构建了饲喂普通饲料的Adipoq-NuTRAP小鼠，并通过流式细胞术从附睾白色脂肪组织（eWAT）、腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和棕色脂肪组织（BAT）中分离出脂肪细胞核。分离得到的细胞核用于进行标签化（tagmentation），随后进行DNA纯化、PCR扩增、质量检测、测序及数据分析，具体步骤如上所述。本代表性实验的目的是对从不同脂肪储存部位分离出的纯脂肪细胞群体的染色质可及性进行分析。
我们观察到，通过流式细胞术分析Adipoq-NuTRAP小鼠脂肪组织中分离出的细胞，mCherry标记和GFP标记的脂肪细胞核能够与其他细胞类型的细胞核明显区分开来（图2A-C）。不同脂肪储存部位的脂肪细胞比例存在差异：eWAT中约为50%，iWAT中约为30%，BAT中约为65%（图2D）7。每个样本可在2-1...

我们介绍一种针对脂肪细胞的高通量测序转座酶可及染色质分析（ATAC-seq）方案，该方法专门利用携带核荧光标记的转基因报告小鼠分离的脂肪组织，通过细胞核分选实现。

使用荧光激活细胞核分选技术对脂肪组织进行脂肪细胞特异性ATAC-Seq

高通量测序转座酶可及性染色质检测（ATAC-seq）是一种强大的技术，可实现全基因组范围内的染色质可及性分析……

ATAC-seq 是一种用于理解基因表达调控机制的强大技术。然而，由于脂肪组织含有大量脂质、线粒体污染程度高以及细胞异质性强，难以应用该技术。在本方案中，通过使用荧光激活细胞核分选技术进行脂肪细胞特异性的 ATAC-测序，获得了高质量数据，并将线粒体 DNA 污染降至最低。该方法也可用于其他组织，只要存在细胞类型特异性的 Cre 小鼠品系，并且具有核标记的转基因报告基因小鼠品系。开始细胞核分离时，将玻璃 Dounce 匀浆器置于冰上预冷，每个样品使用一个玻璃 Dounce 匀浆器。然后，向每个玻璃 Dounce 匀浆器中加入 7 毫升 NPB 混合液。然后，取50至100毫克冷冻的脂肪组织放入玻璃Dounce匀浆器中，用一把长柄剪刀将其剪成若干小块。所有样品均先用松散研杵研磨10次，再用紧密研杵研磨10次。将匀浆液通过100微米滤网过滤至新的50毫升离心管中，随后将过滤后的匀浆液转移至15毫升离心管中进行离心。去除上清液后，用500微升PBS-N通过轻轻但彻底地用手指敲击重悬沉淀。接着，将悬液通过40微米滤网过滤至50毫升离心管中，并用250微升PBS-N冲洗滤网。使用微量移液器将过滤后的细胞核悬液转移至荧光激活细胞分选（FACS）管中。在新的1.5毫升离心管中加入500微升PBS-N，以制备收集管，并反复倒置数次，使缓冲液润湿管内所有表面。短暂离心以使液体沉降至管底，随后将离心管置于冰上，待分选时使用。进行FACS分析时，使用FSC-A/FSC-H设门排除双联体，并使用FSC-A/SSC-A排除小或大颗粒碎片。圈选mCherry/GFP阳性脂肪细胞核群体，并将每个预先准备的收集管中各收集10,000个细胞核。分选后细胞核制备时，向每个收集管中加入500 µL PBS-N，轻轻倒置管子数次以混匀，随后在4 °C条件下以200 ×g离心10分钟。彻底去除上清液。配制25微升Tn5预混液：将12.5微升2x标签化DNA缓冲液（TD缓冲液）、1.25微升Tn5转座酶（TDE I酶）和11.25微升无核酸酶水混合均匀。随后，向每个细胞核沉淀中加入25微升Tn5预混液，通过轻柔吹打重悬沉淀。使用恒温混匀仪，在37摄氏度、600 RPM条件下孵育30分钟。向25微升Tn5转座复合物重悬液中加入25微升无核酸酶水，使终体积为50微升。然后加入250微升PB缓冲液和5微升pH 5.2的3 M醋酸钠溶液。将混合物转移至随试剂盒提供的离心柱中，在室温下于17,900 G离心1分钟。弃去穿流液后，将离心柱重新放回原来的收集管中。向管中加入750微升含有无水乙醇的PE缓冲液。离心柱子，弃去穿流液，并将离心柱重新放回同一收集管中。离心管子，弃去含有流穿液的收集管。为了扩增经转座的DNA片段，配制PCR主混合液，但不要加入独特的Ad2.n条形码引物。进行PCR反应。进行定量PCR（qPCR）。检查扩增曲线，并通过估算达到最大值约35%所需的循环数，确定需要增加的PCR循环次数。根据计算结果，对剩余的45微升PCR反应体系进行PCR扩增。按照前述步骤，用20微升洗脱缓冲液（EB缓冲液）洗脱扩增后的DNA片段。将洗脱得到的DNA转移至新的PCR管中，并加入80微升EB缓冲液，使总体积调整至100微升。随后加入55微升SPRI磁珠，通过移液器吹打混匀。室温孵育5分钟后，将反应管置于小型磁力架上分离磁珠，持续5分钟。完成后，将150微升上清液转移至新的PCR管中，加入95微升SPRI磁珠，并用移液器吹打混匀。反应孵育5分钟后，将磁珠置于小型磁力架上进行分离。小心弃去上清液，用200微升70%乙醇洗涤磁珠1分钟。再重复洗涤两次。最后一次洗涤后，在1000 G下离心试管1分钟。用移液器吸出残留的乙醇，并在PCR仪上打开盖子于37摄氏度干燥沉淀2分钟。干燥后，用移液器将沉淀重悬于20 µL洗脱缓冲液EB中，在室温下孵育5分钟。将反应管置于微型磁力架上分离磁珠5分钟，然后将含有最终文库的上清液18 µL转移至新的1.5 mL离心管中。在Adipoq-NuTRAP小鼠的脂肪组织分离的细胞核中，mCherry标记和GFP标记的脂肪细胞核可与其他细胞类型的细胞核区分开来。根据脂肪库类型的不同，eWAT 中的脂肪细胞组分差异约为 50%，iWAT 中为 30%，BAT 中为 65%。需要超过 15 个 PCR 循环的样本表明其质量较低。ATAC-seq 文库的大小分布分析显示出多个峰，分别对应无核小体区域（NFR）以及单核小体、双核小体和多核小体，其平均大小约为 500 至 800 个碱基对。质量较差的样品通常主要显示核小体游离区（NFR），且无或仅有少量核小体峰。通过qRT-PCR分析进行的质量检测结果显示，在脂肪细胞标志基因（如Adipoq、Fabp4、Plin1和Pnpla2）附近的阳性基因组元件富集程度达到10至20倍，而阴性对照则未显示富集。在棕色脂肪组织（BAT）中特异性观察到产热基因Ucp1的富集。线粒体读段占比低于2%，峰下区域的比值约为18%至44%。在所有脂肪组织库中，靠近脂肪细胞标志基因（如Adipoq、Fabp4和Plin1）的位置均显示出多个信号噪声比较高的强峰。在BAT样本中，棕色脂肪细胞标志基因Ucp1位点处观察到明显的ATAC-seq峰。本实验方案最关键的要素是细胞核的质量。使用高质量的组织样本并在整个实验过程中轻柔处理细胞核非常重要，尤其是在离心和分选后的重悬步骤中。需要注意的是，本方案依赖于带有细胞核标记的转基因报告小鼠。此处使用了 NuTRAP 小鼠，但任何类似的系统均可使用。利用我们的流式细胞术数据，可以进行计算多重分析，以发现调控生物环境中基因表达的关键转录组因子。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用荧光激活细胞核分选的脂肪细胞特异性ATAC-Seq与脂肪组织

本视频展示了一种从小鼠主动脉弓周围脂肪组织中分离和培养荧光标记的神经嵴来源脂肪干细胞（ADSCs）的技术。分离后，通过荧光激活细胞分选技术检测并分选NCADSCs，随后将其接种于培养板中进行培养，以促进细胞增殖。...

从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离脂肪来源的干细胞

脂肪组织（AT）是免疫细胞活化和相互作用的重要场所。几乎所有类型的免疫系统细胞都存在于脂肪组织中，且其比例会因肥胖而发生改变。对脂肪组织中免疫细胞群体进行准确的分离、定量和表征，对于理解其在免疫代谢性疾病中的作用至关重要。...

脂肪组织免疫细胞的分离

我们介绍了从鼠类腹股沟（皮下）和性腺周围（内脏）脂肪组织库中分离基质血管组分（SVF）的技术，以评估其基因表达和胶原酶活性。该方法包括利用免疫磁珠细胞分离技术富集Sca1high脂肪来源干细胞（ASCs）。...

脂肪库特异性Sca1high 脂肪源性干细胞（ASCs）的免疫磁珠分离

本文报道了一种利用磁性激活细胞分选（MCS）从血管周围脂肪组织（PVAT）中分离脂肪细胞前体细胞（APC）群体的方法。与荧光激活细胞分选（FACS）相比，该方法可显著提高每克脂肪组织中APC的分离效率。...

通过磁性激活细胞分选法分离的血管周围脂肪组织中脂肪细胞前体的扩增与脂肪生成诱导

由于脂肪组织含有高含量的脂质，使用传统组织学方法对其进行可视化一直存在挑战。Adipo-Clear...

Adipo-Clear：一种用于脂肪组织三维成像的组织透明化方法

本文介绍了一种从成熟脂肪细胞中分离细胞核、通过荧光激活分选进行纯化以及在单细胞水平上进行转录组学分析的实验方案。...

用于单细胞基因组学应用的脂肪组织细胞核分离

本实验方案描述了通过荧光激活细胞分选或免疫磁珠分离技术，从小鼠腹腔内白色脂肪组织（WAT）储存部位中分离脂肪生成性及纤维炎症性基质细胞亚群的技术方法。...

从小鼠腹腔内脂肪组织库中分离脂肪生成性与纤维-炎症性基质细胞亚群

本文介绍一种简单、经济且快速的透明化方法，结合多种标记物，通过荧光成像技术解析小鼠和人类白色脂肪组织的三维结构，可同时可视化血管、细胞核、免疫细胞、神经元以及脂滴包被蛋白。...

通过水杨酸甲酯透明化与三维成像探究脂肪组织结构

我们介绍一种简单的方法，利用荧光激活细胞分选技术从小鼠附睾脂肪垫中分离出高活力的脂肪前体细胞。...

从小鼠附睾脂肪组织中分离脂肪前体细胞

本文介绍了一种从人皮下脂肪组织中分离、培养和表型鉴定微血管内皮细胞（hSATMVECs）的实验方案。此外，还描述了一种hSATMVECs与脂肪细胞相互作用的实验模型。...

研究人类皮下脂肪组织中脂肪内皮细胞与脂肪细胞的相互作用

由于人体组织获取受限，肌间脂肪组织（IMAT）的生物学特性在很大程度上尚未被探索。本文介绍了一种从冷冻的人类IMAT样本中分离细胞核并构建文库的详细方案，用于单细胞核RNA测序，以鉴定这一独特脂肪储存库的细胞组成。...

从人间质脂肪组织中分离细胞核及后续单细胞核RNA测序

学习使用荧光激活细胞核分选技术对脂肪细胞进行ATAC-Seq分析的方法。该方法利用转基因报告小鼠的脂肪组织，有效减少线粒体DNA污染，生成高质量染色质可及性数据，适用于研究基因调控机制。

使用荧光激活细胞核分选技术对脂肪组织进行脂肪细胞特异性ATAC-Seq

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