使用荧光激活细胞核分选的脂肪细胞特异性ATAC-Seq与脂肪组织
2023年3月17日
我们提出了一种用于转座酶可访问染色质的高通量测序（ATAC-seq）测定的方案，专门针对脂肪细胞，使用细胞核分选，从具有核荧光标记的转基因报告小鼠中分离的脂肪组织。
ATAC-seq是了解基因表达调控机制的强大技术。然而，脂肪组织很难使用这种技术，因为它的脂质含量大，线粒体污染高，细胞异质性强。在该协议中，使用荧光激活的细胞核分选进行脂肪细胞特异性ATAC测序，该分选以最小的线粒体DNA污染生成高质量的数据。
该方法也可用于其他组织，其中细胞类型特异性Cre小鼠系具有核标记转基因报告系。通过冷却玻璃 Dounce 均质器在冰上开始细胞核分离，每个样品使用一杯 Dounce。然后，向每杯 Dounce 中加入 7 毫升 NPB 混合物。
然后，将 50 到 100 毫克的冷冻脂肪组织放入玻璃杯 Dounce 中，并用一把长剪刀将其切成几小块。用松散的杵对所有样品进行10次描边，然后用紧杵描10次。通过100微米过滤器将内容物过滤到新的50毫升管中，然后将过滤后的匀浆转移到15毫升管中进行离心。
除去上清液后，通过轻柔但彻底的手指敲击将沉淀重悬于500微升PBS-N中。接下来，通过 40 微米过滤器将悬浮液过滤到 50 毫升管中，并用 250 微升 PBS-N 冲洗过滤器。使用微量移液器将过滤后的核悬浮液转移到荧光激活细胞分选或FACS管中。
通过将 500 微升 PBS-N 添加到新的 1.5 毫升管中来准备收集管，并将其倒置几次以用缓冲液润湿所有内表面。短暂旋转试管以降低所有液体，然后将它们放在冰上直到分类。对于FACS，使用FSC-A/FSC-H门控清除单线，使用FSC-A/SSC-A清除小碎片或大碎片。
门用于mCherry/GFP阳性脂肪细胞核群，并在先前准备的每个收集管中收集10， 000个细胞核。对于分选后细胞核制备，向每个收集管中加入 500 微升 PBS-N，并通过倒置管几次进行混合，然后在 200 G 下在 4 摄氏度下离心收集管 10 分钟。完全除去上清液。
要制备 25 μL Tn5 主混合物，请混合 12.5 μL 2x 标记 DNA 缓冲液或 TD 缓冲液、1.25 μL Tn5 转座酶或 TDE I 酶和 11.25 μL 无核酸酶水。接下来，向每个细胞核沉淀中加入 25 微升 Tn5 主混合物，并通过轻柔移液将其重悬。使用热混合器在 600 rpm 下在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。
将25微升无核酸酶的水加入25微升Tn5核重悬液的混合物中，使最终体积为50微升。然后，加入250微升缓冲液PB和5微升pH 5.2的3M乙酸钠。将混合物转移到参考试剂盒提供的色谱柱中后，在室温下以17， 900 G离心1分钟。
丢弃流通后，将离心柱放回同一收集管中。向管中加入750微升含有无水乙醇的缓冲PE。离心柱，丢弃流出物，然后将离心柱放回同一收集管中。
离心管，并丢弃带有流出物的收集管。为了扩增转置的DNA片段，在不添加独特的Ad2的情况下制备PCR主混合物。n 条形码入门。
运行 PCR。运行定量 PCR 或 qPCR。检查扩增曲线，并通过估计达到最大值约35%的循环次数来确定所需的额外PCR循环次数。
使用计算对剩余的 45 微升 PCR 反应运行 PCR。使用早期程序，用20微升缓冲液EB洗脱扩增的DNA片段。将洗脱的DNA转移到新的PCR管中，并通过加入80微升缓冲液EB将体积调节至100微升。接下来，加入 55 微升 SPRI 珠并通过移液混合。在室温下孵育5分钟后，将其在迷你磁性支架上分离5分钟。
完成后，将150微升上清液转移到新的PCR管中，加入95微升SPRI珠，并通过移液混合。将反应孵育5分钟，然后在迷你磁性支架上分离珠子。小心丢弃上清液，并使用200微升70%乙醇洗涤珠子1分钟。
再重复两次洗涤。最后一次洗涤后，将试管以1000 G离心1分钟。移出剩余的乙醇，并在打开盖子的PCR机上在37摄氏度下干燥沉淀2分钟。
干燥后，通过移液将沉淀重悬于20微升缓冲液EB中，并在室温下孵育管5分钟。在迷你磁性支架上分离珠子5分钟，然后将含有最终文库的18微升上清液转移到新的1.5毫升管中。mCherry标记和GFP标记的脂肪细胞核可与从Adipoq-NuTRAP小鼠的脂肪组织中分离的其他细胞类型细胞核区分开来。
根据脂肪库的类型，在脂肪细胞组分中观察到eWAT的差异约为50%，iWAT的差异约为30%，BAT的差异约为65%。需要超过15个PCR循环的样品表明样品质量低下。ATAC-seq文库的大小分布分析显示，多个峰对应于无核小体区（NFR），以及单核、二核和多核小体，平均大小约为500至800个碱基对。
质量差的样品通常主要显示NFR，没有或很少有核小体峰。qRT-PCR分析的质量检查测试显示，脂肪细胞标记基因（如Adipoq，Fabp4，Plin1和Pnpla2）附近的阳性基因组元素富集了10至20倍，而阴性对照组未显示富集。产热基因Ucp1的富集在BAT中特异性地观察到。
线粒体读数小于2%，峰下分数约为18%至44%在所有脂肪库的脂肪细胞标记基因（如Adipoq，Fabp4和Plin1）附近发现了多个具有高信噪比的强峰。在BAT样品中的棕色脂肪细胞标记Ucp1位点观察到强烈的ATAC-seq峰。该协议的最关键因素是细胞核质量。
重要的是使用高质量的组织样品并在整个实验过程中轻柔地处理细胞核，尤其是在离心和分选后的重悬期间。重要的是要记住，该协议依赖于具有核标记的转基因报告小鼠。这里使用了NuTRAP小鼠，但可以使用任何类似的系统。
利用我们的FACS数据，人们可以进行计算多重分析，以找到在生物学环境中调节基因表达的关键转录组因子。
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概述
本文介绍了一种专门用于脂肪细胞的ATAC-seq协议，使用核分选。该方法利用来自转基因报告小鼠的脂肪组织，具有核荧光标记，以生成高质量的数据。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因组学
- 细胞生物学
背景
- ATAC-seq是一种用于研究基因表达调控机制的技术。
- 由于脂肪含量和细胞异质性，脂肪组织对ATAC-seq提出了挑战。
- 荧光激活核分选有助于最小化线粒体DNA污染。
- 该方法可以针对具有特定Cre小鼠系的其他组织进行调整。
研究目的
- 开发一个可靠的脂肪细胞ATAC-seq协议。
- 通过减少污染来提高数据质量。
- 提供一种适用于各种组织的方法。
使用的方法
- 从转基因报告小鼠中分离脂肪组织。
- 在冰上冷却玻璃Dounce研捣器以进行样品制备。
- 使用特定的NPB混合物进行核分离。
- 通过荧光激活核分选获得高质量的核。
主要结果
- 成功分离出脂肪细胞核，污染最小。
- 从脂肪组织中生成高质量的ATAC-seq数据。
- 该协议可以适用于具有核标记的其他细胞类型。
- 证明了该方法在研究脂肪细胞基因调控方面的有效性。
结论
- 开发的协议允许在脂肪细胞中有效进行ATAC-seq。
- 最小化线粒体污染对于数据完整性至关重要。
- 该方法可以扩展到其他组织，增强其在研究中的实用性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific ATAC-seq in adipose tissue addresses a critical bottleneck in chromatin accessibility profiling for metabolic disease research and target validation. By enabling high-fidelity isolation of adipocyte nuclei, this protocol reduces confounding signals from cellular heterogeneity and mitochondrial contamination, supporting more predictive and actionable genomic insights. The approach enhances confidence in regulatory element mapping, directly impacting early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of chromatin accessibility in adipocytes, clarifying regulatory mechanisms underlying metabolic pathways.
- Reduces biological ambiguity by isolating pure adipocyte nuclei, supporting robust functional target validation.
- Improves predictive confidence in linking regulatory elements to gene expression changes relevant to disease models.
Screening & Assay Development
- Provides validated, cell-type-specific chromatin profiles for downstream assay development and screening workflows.
- Facilitates reproducible and quantitative assessment of chromatin states, supporting assay standardization.
- Minimizes wasted sequencing reads and reagent use, increasing operational efficiency for high-throughput studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin accessibility data with disease-relevant adipocyte biomarkers, supporting translational biomarker discovery.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by providing high-quality, cell-type-resolved epigenomic data.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying mechanistic links between chromatin state and gene regulation in metabolic tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling cell-type-specific chromatin profiling in adipose tissues, supporting both early target validation and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating regulatory elements active in adipocytes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative chromatin accessibility data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides high signal-to-noise readouts and quantitative enrichment at marker loci, enabling robust statistical comparisons.
- Translational Research: Connects chromatin state changes to disease-relevant gene expression, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other tissues with nuclear labeling, extending utility across diverse preclinical models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in regulatory genomics.
- Operational Value: Standardizes cell-type-specific ATAC-seq workflows, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in metabolic disease portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic and obesity-related targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nuclear isolation, FACS, and ATAC-seq library preparation.
- Demands access to transgenic reporter mouse lines with nuclear labeling capability.
- Relies on high-quality tissue samples and gentle handling to preserve nucleus integrity.
- Needs robust analytical infrastructure for sequencing and downstream bioinformatics.
- Adaptation to other cell types depends on availability of suitable nuclear labeling systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:51
Nucleus Isolation
2:15
Nucleus Sorting and Tn5 Tagmentation
4:08
DNA Purification and PCR Amplification
5:32
Real-Time Quantitative PCR (qPCR) Test, Additional PCR Amplification, and Second DNA Purification
6:14
DNA Fragment Size Selection
8:01
Results: Assay for Transposase-Accessible Chromatin with High-Throughput Sequencing
10:19
Conclusion
