Name: 小鼠和人泪腺类器官的建立、维持、分化、遗传操作和移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学习建立小鼠和人泪腺类器官的方法，包括组织消化、细胞解离、电穿孔遗传操作及移植技术。该方案为研究泪腺稳态调控机制和再生医学应用提供了可靠的体外模型系统。

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感谢 Yorick Post 对本实验方案的初步开发工作。本研究部分得到了英国癌症研究基金会大挑战奖（C6307/A29058）以及马克癌症研究基金会向 SPECIFICANCER 团队提供的资助支持。

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Hans Clevers 是位于巴塞尔的罗氏制药研究与早期开发部门负责人，并拥有多项与类器官技术相关的专利。

本方案描述了用于功能检测、突变建模和移植的泪腺类器官的建立与使用。在建立小鼠和人源泪腺类器官时，组织解离至关重要。如果组织消化不充分，类器官的产量将很低；如果组织过度消化，细胞会死亡，无法形成类器官。每种组织都应使用特定酶在特定时间内进行消化，以确保类器官的最佳出球生长14,17,18。泪腺是一种较为柔软的组织，使用胶原酶消化5–10分钟并结合移液吹打进行机械解离，即可分离出小块组织。若需要获得单个细胞用于单细胞RNA测序等应用，可延长解离时间直至达到单细胞阶段，但一旦获得单细胞即应停止解离，以尽量减少细胞活力的下降。由于组织解离极为关键，过度消化是导致泪腺类器官建立失败的最可能原因。
泪腺类器官的适当维持对其应用至关重要。与诱导性多能干细胞来源的类器官相比，长期维持是成体干细胞来源泪腺类器官的一个显著特征。7,17为实现长期维持，应定期进行类器官传代和培养基更换。若不进行上述操作，类器官将开始分化，并出现干细胞潜能下降，从而影响其长期维持7在此步骤中，过度消化同样可能杀死干细胞并影响类器官的维持。对于常规维持培养，无需将类器官解离为单细胞。然而，若要建立克隆性基因敲除类器官品系，则必须从单细胞开始。否则，所形成的类器官将由具有不同遗传背景的细胞嵌合而成，从而无法分析单一明确突变的作用。此处，我们描述了使用一种C &#62; T碱基编辑器用于生成终止密码子。该基因组编辑工具依赖于在NGG PAM序列上游12-18个碱基范围内存在精氨酸、谷氨酰胺或色氨酸密码子。当设计gRNA时若不满足这些条件，则需使用传统的Cas9或C &#62;具有不同PAM序列的T碱基编辑器可用于7,18然而，传统的Cas9会引入双链断裂，修复时会产生插入或缺失突变（indels）11由于两个等位基因可能携带不同的插入缺失突变，克隆基因分型需格外谨慎。应解析所引入的修饰，以确认两个等位基因均含有移码型插入缺失突变，从而确保类器官克隆中目标基因被完全敲除。19. C的优势 &#62; T碱基编辑器的优势在于其可用于构建不一定导致终止密码子的点突变模型。例如，它们可用于模拟特定的 Pax6 研究无虹膜症患者中发现的突变对其泪腺生理功能的影响20.
泪腺分泌泪膜的水性成分1。在生长因子撤除和NOTCH信号通路抑制介导的分化条件下，人类类器官可重现泪液分泌功能。在此条件下，类器官经历终末分化，无法进一步维持培养。然而，已分化的泪腺类器官可用于干眼症背景下促流泪药物的研发，有望应用于高通量筛选。本实验方案中介绍的流泪检测方法是目前能在短时间内引起类器官尺寸最大变化的方法，因此在药物筛选背景下更易于进行定量分析7,9,17。
干细胞治疗在干眼症的泪腺再生中具有广阔前景21。成体干细胞来源的泪腺类器官可作为此类应用的材料来源。本文所述方案可实现人泪腺类器官在体内移植，但多数形成囊状结构。类器官移植率低可能源于注射部位错误。通过使用染料预先训练注射操作，可追踪注射位置，从而提高注射准确性。 Alternatively，可切开小鼠表皮以直接暴露泪腺，此前在大鼠中已采用该方法22。该方法耗时较长，但可能更为准确。然而，采用本方案时，类器官未能在小鼠泪腺中实现功能性整合。iPSC来源的泪腺类器官移植也观察到了类似结果22。通过预先损伤泪腺、使用干眼小鼠模型，和/或以单细胞或小细胞团形式注射类器官，有望进一步优化移植方法。尽管如此，成体干细胞来源的泪腺类器官及相关技术工具仍可为未来泪腺研究与再生医学应用奠定基础。

泪腺是负责产生泪膜大部分水样层的腺上皮组织1。泪膜的水样层不仅含有用于润滑眼表的水分，还包含多种抗菌成分，可保护眼表免受感染2。当泪腺受损或发生炎症时，便会引发干眼症，导致患者不适，并可能最终造成视力丧失3。多年来，用于研究泪腺（尤其是人类泪腺）的模型系统十分有限4,5,6，这导致人们对泪腺在生理和病理条件下的功能仍存在知识空白。
最近， 体外 已开发出在培养皿中研究泪腺的模型7,8,9这些泪腺类器官来源于成体干细胞，在添加了多种生长因子混合物的细胞外基质中培养形成三维结构，以维持其再生能力 体外7成体干细胞（ASC）来源类器官的优势在于能够长期维持并重现健康组织的特征。这类类器官仅由上皮细胞组成，而诱导性多能干细胞（iPSC）来源类器官则可能还包含间质细胞等其他成分。与多能干细胞（PSC）来源类器官不同，ASC类器官直接来源于成体组织，无需任何遗传修饰即可扩增。ASC类器官表达成体特征10.
本方案提供了一套从鼠源和人源原代组织中获取泪腺类器官的工具。该方案描述了如何通过简单地撤除生长因子来进一步增强类器官的功能，以及如何通过进行肿胀实验诱导类器官分泌泪液。此外，本方案还包括一种基于电穿孔的转染方法，利用CRISPR衍生的碱基编辑器对鼠源类器官进行基因工程改造。与传统的Cas9不同，碱基编辑器可在不产生双链断裂的情况下实现基因组中单个碱基的修饰11,12。最后，方案还描述了将人源泪腺类器官原位移植到免疫缺陷小鼠体内，并对移植物进行后续组织学评估的方法。该泪腺类器官工具包可用于泪腺再生与功能研究，以及&#160;遗传性和炎症性疾病建模。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 安全锁离心管</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物（DAB）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td>CAS: 868272-85-9 ，注意：6 g/L 溶液可分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>5x 绿色 GoTaq Flexi 缓冲液</td><td>Promega</td><td>M891A</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，储存液浓度为 30 mM，10000 倍</td></tr><tr><td>高级 DMEM/F12 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>于 4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>含氨苄青霉素的琼脂平板</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>VAPOUR-Line lite 型高压灭菌器</td><td>VWR chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，50 倍浓缩液</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine 胰岛素针头 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>台式显微镜 DMI1</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>MP biomedicals</td><td>160069</td><td>于 4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>BTXpress</td><td>BTX</td><td>MDS450805</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>包埋盒</td><td>Klinipath</td><td>410-02S</td><td></td></tr><tr><td>CellBanker 1</td><td>amsbio</td><td>11910</td><td>冻存培养基，遵循说明书操作</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸一水合物</td><td>J.T. Baker</td><td>0088</td><td>CAS: 5949-29-1</td></tr><tr><td>胶原酶 I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9407</td><td>分装为 20 mg/mL，20 倍浓缩液，于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>15 mL 锥形离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>Corning</td><td>CLS430828-500EA</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24 mm x 50 mm</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;zer</td><td>BB024050S1</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 基底膜提取物（BME），生长因子减少型，2 型 — 细胞外基质</td><td>R&amp;amp;D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，可于 4 &amp;deg;C 保存最多 1 个月</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，储存液浓度为 10 mM，1000 倍</td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>VWR chemicals</td><td>28026.292</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td>CAS:10028-24-7</td></tr><tr><td>中性蛋白酶（Dispase）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17105-041</td><td>分装为 50 U/mL，使用前于 -20 &amp;deg;C 保存，400 倍浓缩液</td></tr><tr><td>一次性无菌手术刀片 N&amp;deg; 10</td><td>Swann Morton</td><td>3033838</td><td></td></tr><tr><td>DM4000 显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs 25 mM</td><td>Promega</td><td>U1420</td><td>将四种核苷酸混合，于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>1 倍</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 孔径一次性滤器</td><td>Greiner</td><td>542170</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>Nepagene</td><td>EC002S</td><td></td></tr><tr><td>EnVision+/HRP 小鼠二抗</td><td>Agilent</td><td>K400111-2</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 100%</td><td>BOOM</td><td>84045206;5000</td><td>注意：用于配制其他浓度乙醇溶液</td></tr><tr><td>乙醇 70%</td><td>BOOM</td><td>84010059.5000</td><td>注意</td></tr><tr><td>乙醇 96%</td><td>BOOM</td><td>84050065.5000</td><td>注意</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 细胞成像系统</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>活细胞成像明场显微镜</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，储存液浓度为 100 mg/mL，100 倍浓缩液</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH, Fiji 开发者</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496</td><td>CAS: 50-00-0，注意</td></tr><tr><td>佛司可林（Forskolin）</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，储存液浓度为 10 mM，10000 倍</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 倍浓缩液</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>VWR chemicals</td><td>10047105</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>于 4 &amp;deg;C 保存，100 倍浓缩液</td></tr><tr><td>Leica Histocore H 和 C 组织包埋机</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Meidax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人核仁抗原抗体</td><td>Abcam</td><td>ab-190710</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 5 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10605882</td><td>CAS: 7647-01-0，注意</td></tr><tr><td>过氧化氢 30%</td><td>Chem-lab</td><td>CL00.2308.1000</td><td>CAS: 7722-84-1，注意</td></tr><tr><td>Hygromycin B-gold</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg</td><td>储存液浓度为 100 mg/&amp;micro;L，1000 倍浓缩液</td></tr><tr><td>含潮霉素抗性盒的质粒</td><td></td><td></td><td>Andersson-Rolf 等，Nature Methods，2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>IsoFlo 100%</td><td>Mecan</td><td>5960501</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 25 mM</td><td>Promega</td><td>A351H</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>RM2235 型切片机</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中量质粒 DNA 提取试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210005</td><td></td></tr><tr><td>小量质粒 DNA 提取试剂盒</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>K210003</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，储存液浓度为 500 mM，400 倍浓缩液</td></tr><tr><td>NEPA21 电穿孔仪</td><td>Nepagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，储存液浓度为 1 M，100 倍浓缩液</td></tr><tr><td>NOD Scid Gamma（NSG）小鼠</td><td>Hubrecht Institute 种群</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Noggin 条件培养基</td><td>U-Protein Express</td><td>定制订购</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>去甲肾上腺素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7257</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，储存液浓度为 100 mM</td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Memmert</td><td></td><td>设定温度为 58 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>P20、P200 和 P1000 移液器</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>VWR chemicals</td><td>10048502</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管，带玻璃棉</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1150-6973</td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C&gt;T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C&gt;T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td><td>Addgene</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Pertex</td><td>Klinipath</td><td>AM-08010</td><td></td></tr><tr><td>pFYF1320&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>47511</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1000 倍浓缩液，于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>前列腺素 E2（PGE2）</td><td>Tocris</td><td>2296</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，储存液浓度为 10 mM，10000 倍</td></tr><tr><td>培养皿，10 cm</td><td>Greiner</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>Q5 缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA 提取液</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td>分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>R-spondin 3 条件培养基</td><td>U-Protein Express</td><td>定制订购</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>sgRNA 反向引物：TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>StarFrost</td><td>MBB-0302-55A</td><td>带粘附层，磨砂面</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Merck</td><td>8.22335.1000</td><td>CAS: 26628-22-8，注意</td></tr><tr><td>柠檬酸钠二水合物</td><td>J.T. Baker</td><td>0280</td><td>CAS: 6132-04-3</td></tr><tr><td>标准正向引物：&amp;ldquo;/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG&lt;br/&gt; TTAAAATAAGGC</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高效克隆感受态细胞 DH5alpha</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>悬浮细胞培养板（24 孔）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662102</td><td>24 孔</td></tr><tr><td>悬浮细胞培养板（12 孔）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665102</td><td>12 孔</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TAE 缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B49</td><td>储存液为 50 倍，使用时用超纯水稀释至 1 倍</td></tr><tr><td>含转座酶的质粒</td><td></td><td></td><td>Andersson-Rolf 等，Nature Methods，2017. doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td>于 4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>U6 正向引物：GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 琼脂糖 1000</td><td>Invitrogen</td><td>16550</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Tulabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Klinipath</td><td>4055-9005</td><td>CAS: 1330-20-7，注意</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，储存液浓度为 10 mM，1000 倍</td></tr></tbody></table>

小鼠与人泪腺类器官的建立、维持、分化、遗传操作及移植

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

泪腺是维持眼表稳态的重要器官。通过产生泪膜的水性成分，它保护眼睛免受干燥应激和外界损伤。由于缺乏合适的 体外 模型。类器官技术已被证实是多种器官的有用实验平台。本文分享了一种从小鼠和人泪腺活检组织建立和维持泪腺类器官的方案。通过优化培养条件，我们增强了泪腺类器官的功能性。类器官功能可通过“哭泣”实验进行检测，即通过给予特定神经递质刺激，诱导类器官腔内泪液释放。我们详细说明了如何对这一现象进行成像和定量分析。为研究特定基因在泪腺稳态中的作用，可对类器官进行遗传学修饰。我们系统阐述了使用碱基编辑器对泪腺类器官进行基因编辑的全过程——从向导RNA设计到类器官克隆的基因型鉴定。最后，我们展示了通过原位移植至小鼠体内，评估人泪腺类器官再生潜能的方法。综上，这一整套技术体系为利用小鼠和人泪腺类器官研究泪腺（病理）生理学提供了有力工具。

在分离小鼠泪腺后（图2A），通过酶解和机械消化产生小的组织碎片，其中可区分出腺泡和导管结构（图2B）。残留的大块组织会破坏细胞外基质（ECM）的稳定性，从而抑制类器官的初始出芽生长。当培养约7天后观察到直径约为500 µm的囊状类器官时，表明小鼠泪腺类器官培养成功，此时类器官已可进行传代（图2C）。即使整体类器官培养成功，部分类器官也可能在开始生长后停止发育。人泪腺类器官在组织分离后3-4天内即开始形成囊状结构，并在10-14天内达到成熟大小（图2D）。对于小鼠和人类样本，类器官培养有时会失败，表现为无或仅有少量类器官生长；这通常由组织消化过度所致。小鼠泪腺类器官可传代至少40次，人类泪腺类器官可传代至少20次。传代频率平均为每7-10天一次，具体间隔取决于类器官的生长速度。
<img alt="用于研究分析的小鼠泪腺提取、细胞分离和类器官培养示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠和人类泪腺类器官的建立。（A）小鼠泪腺解剖不同阶段的照片。箭头指向其保护膜下的泪腺。（B）组织消化后立即拍摄的小鼠泪腺细胞明场图像，插图显示一个腺泡和一条导管。（C）成功与失败的小鼠泪腺类器官生成的明场图像。（D）人类类器官在14天内的生长过程明场图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在扩增培养基中培养时，泪腺类器官含有大量干细胞。为了提高其分化水平，我们分别建立了生长因子含量降低的小鼠和人源分化培养基。小鼠和人源泪腺类器官在分化培养基中分别培养5天和7天后，结构变得更加致密（图3A-B）。这种形态学变化与功能特性的增强相关。加入环磷酸腺苷激活剂佛司可林或神经递质去甲肾上腺素后，类器官在不到3小时内出现肿胀（即顶膜水分泌）（图3C）。若肿胀过程超过3-4小时，则提示类器官分化程度不足和/或未表达功能性标志物（如神经递质受体）。
<img alt="泪腺分化与肿胀、类器官随时间生长、显微镜结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠和人泪腺类器官的分化及人源类器官的功能性肿胀实验。（A）小鼠泪腺类器官在扩增培养基中培养7天，随后在扩增培养基中培养2天后转入分化培养基中培养5天的明场图像。（B）人泪腺类器官在扩增培养基中培养11天，随后在扩增培养基中培养2天后转入分化培养基中培养9天的明场图像。（C）已分化的人泪腺类器官分别暴露于新鲜分化培养基（对照）、1 µM forskolin 和 100 µM 去甲肾上腺素后3小时内拍摄的明场图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了在小鼠泪腺类器官中敲除Pax6，通过PCR和连接反应构建了含有靶向Pax6的gRNA的质粒（图4A）。将该含gRNA的质粒与PiggyBac质粒（含潮霉素抗性转座子的质粒和含转座酶的质粒）以及C > T碱基编辑器Cas9共同电转染至已解离为单细胞的小鼠泪腺类器官中。3天后，当类器官恢复生长时，用潮霉素处理以筛选成功整合潮霉素抗性盒的克隆。在成功的电转染实验中，获得潮霉素抗性的类器官得以生长（图4B）。挑选直径大于约300 µm的生长中类器官克隆，理想情况下应在其开始自发分化之前进行（图4C）。从部分类器官中提取DNA，同时将剩余部分继续培养。对gRNA靶向的Pax6位点进行PCR扩增，结果显示所挑选的每个克隆均产生一条367 bp的条带（图4D）。对扩增产物测序后，保留纯合C > T编辑的克隆（n = 1），而未编辑的克隆（n = 4）、杂合编辑或错误编辑的克隆（n = 1）则被弃用（图4E）。总体而言，使用该靶向Pax6的gRNA，在测序的六个克隆中获得了一个纯合敲除的小鼠泪腺类器官克隆。部分克隆生长良好，但部分类器官克隆在挑取后丢失或开始分化（图4F）。在挑选的10个类器官克隆中，有7个成功生长。 
<img alt="基因编辑CRISPR过程；测序、潮霉素筛选、凝胶电泳、克隆分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：通过碱基编辑介导的小鼠泪腺类器官中Pax6基因的敲除。(A) 靶向Pax6位点的gRNA正确整合后，pFYF1320的Sanger测序结果图谱。(B) 小鼠泪腺类器官在电穿孔后暴露于潮霉素5天后的明场图像。类器官培养于小鼠扩增培养基中。左侧为电穿孔失败的示例，未见对潮霉素具有抗性的克隆生长；右侧为电穿孔成功的示例，可见多个具有潮霉素抗性的类器官克隆存活。(C) 应挑选和不应挑选的克隆的明场图像。(D) 琼脂糖凝胶电泳图，显示使用gRNA靶向扩增的Pax6位点。绿色标注的是预期大小为367 bp的条带。(E) 三个对潮霉素具有抗性的类器官克隆的Sanger测序结果图谱。顶部克隆未发生编辑；中间克隆为纯合的C &gt; T编辑，因此为纯合敲除；底部克隆存在两个杂合点突变，可能为杂合敲除或混合克隆，属于错误编辑。(F) 被挑选出的类器官克隆的明场图像，显示出不同程度的外向生长。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
最后，为了在小鼠中进行人泪腺类器官原位移植，需提前3天将类器官进行分割（&lt; 100 µm 直径）被使用。通过检测人源特异性标志物——人核仁抗原，对类器官注射至小鼠泪腺后1个月的移植情况进行染色确认。图5小鼠泪腺所有切片中均未见点状染色，表明无人类类器官移植成功。
<img alt="人核仁抗原，显微镜结果；人细胞移植与无移植的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：将人泪腺类器官移植至小鼠泪腺。 移植后1个月，对移植的小鼠泪腺进行人核仁标记物染色，以监测移植情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表1：培养基与缓冲液的组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本方案描述了如何建立、维持、基因改造、分化、功能表征以及移植源自小鼠和人类原代组织的泪腺类器官。

泪腺是维持眼表稳态的重要器官。通过产生泪膜的水性成分，它保护眼睛免受……

利用泪腺类器官，可以研究特定基因如何调控泪腺的稳态。此外，类器官还可用于再生医学。成体干细胞来源的泪腺类器官技术的主要优势在于，能够培养和研究健康且未发生转化的泪腺上皮细胞。这些类器官最终可用于治疗干眼症患者。首先准备实验所需的培养基和材料，然后在实验前将消化培养基的所有组分混合均匀。用该培养基预先润湿手术刀片，以防止组织碎片粘附其上。从培养基中取出小鼠泪腺组织，放入培养皿中，用预先润湿的手术刀将其切碎。当组织块小于0.5立方毫米时，用手术刀将其从培养皿上刮下，并转移至含有消化液的15毫升离心管中。对于非常小的人类活检样本，可直接将其放入消化液中，无需切碎。将含有组织块的15毫升离心管置于37摄氏度水浴中孵育最多15分钟。在此期间，用火焰将巴斯德吸管尖端拉细，并用基础培养基预润湿。为促进解离过程，每隔5分钟使用预润湿并拉细的巴斯德吸管将剪碎的组织上下吹打一次。当在显微镜下观察到大量单细胞和少量小细胞团时，加入 10 毫升基础培养基以终止消化。在 400×g 离心 5 分钟后，弃去上清液，并将沉淀物重悬于 10 毫升基础培养基中，重复洗涤并再次离心收集细胞。通过 70 微米细胞筛过滤剪碎的混合物，以去除未消化的大块组织和残留的胶原纤维。将洗脱液在400g下离心5分钟。去除上清液后，将细胞沉淀重悬于100微升冷的细胞外基质（ECM）中，用于单个小鼠泪腺；或重悬于50微升冷的ECM中，用于人活检组织，操作过程中避免产生气泡。使用P200移液器将每孔最多100微升细胞悬液接种至12孔悬浮培养板中，每孔形成约20微升的液滴。将培养板倒置放入37摄氏度的加湿培养箱中，孵育20至30分钟，以使ECM凝固。待ECM完全凝固后，在12孔板的每个孔中加入约1毫升室温小鼠扩增培养基。新鲜配制1毫升含诱导泪腺类器官分泌的各组分的人类分化培养基。在自动明场延时显微镜上，设置好培养板中需要成像的位置，时间间隔为五分钟，持续时间为四小时。确保每个位置均能完整看到整个细胞外基质（ECM）液滴。开始成像前，将待成像孔中的培养基移除，操作时不要将培养板从显微镜上移开，并立即替换为新配制的、充分重悬的人类分化培养基，其中包含佛司可林（forskolin）和去甲肾上腺素（noradrenaline）等化合物。作为阴性对照，设置一个含有新鲜分化培养基的孔。点击显微镜上的运行按钮，并在四小时后分析结果。按照文中所述方法解离类器官后，弃去上清液。将细胞重悬于80 µL电穿孔缓冲液中。在1.5 mL离心管中，制备实验所需的质粒。将质粒加入细胞中，通过上下吹打充分混匀。根据打孔脉冲和转移脉冲的参数设置电穿孔仪。将含有质粒的细胞加入电穿孔比色皿中。立即测量电阻，电阻值应在 0.3 安培至 0.55 安培之间，并立即进行电穿孔。完成后，将细胞转移至1.5毫升离心管中，并加入400微升含有Rho激酶抑制剂的电穿孔缓冲液。室温下孵育30分钟使细胞恢复。接着，在500×g离心5分钟以收集细胞沉淀。弃去上清液后，将细胞接种于 200 µL ECM 中。待凝固后，加入小鼠扩增培养基。进行类器官制备时，需在移植前约三天对人泪腺类器官进行传代。 为了从细胞外基质（ECM）中分离类器官，将dispase加入培养基中，使其终浓度达到每毫升0.125单位，并使用P1000移液器充分重悬ECM液滴以将其打散。将培养板放回37摄氏度培养箱中孵育30分钟。用10毫升基础培养基重悬类器官，以洗去酶。在400×g离心5分钟后收集细胞，将其重悬于50 µL含有5% ECM的冷的人类扩增培养基中。将类器官悬液置于冰上，并立即进行移植。对于小鼠原位移植，用胰岛素针头吸取类器官悬液。当小鼠处于睡眠状态时，迅速将其侧放，使主泪腺暴露以便操作。将五微升类器官悬液直接通过皮肤注射至泪腺内。让小鼠恢复，并每日评估是否存在与移植相关的不适症状，尤其是眼部情况。在分离小鼠泪腺后，通过酶消化和机械消化获得包括腺泡和导管在内的小块组织。在成功建立小鼠泪腺类器官的过程中，约500微米直径的囊状类器官在7天后出现。人泪腺类器官在组织分离后3至4天内形成囊状结构，并在10至14天内达到成熟大小。分别在分化培养基中培养五天和七天后，小鼠和人类泪腺类器官变得更为致密。加入环磷酸腺苷激活剂佛司可林或神经递质去甲肾上腺素后，类器官在不到三小时内出现肿胀。在成功的电穿孔实验中，能够耐受潮霉素的类器官得以生长。 在分化前挑选出直径大于300微米的类器官克隆。针对向导RNA靶向的Pax6位点进行PCR扩增，所有选中的克隆均产生一条367个碱基对的条带。使用靶向Pax6的向导RNA，从测序的六个克隆中获得了一个纯合敲除小鼠泪腺克隆。一些克隆生长良好，但部分类器官克隆在挑取后丢失或开始发生分化。在挑取的10个类器官克隆中，有7个生长良好。通过染色人源特异性标志物——人核仁抗原，证实了在将类器官注射到小鼠泪腺一个月后，类器官成功移植。 需要注意的是，避免对组织或类器官过度消化，否则可能导致细胞死亡，从而降低类器官的建立效率。泪腺类器官可通过组织学方法进行分析。通过这种方法，可以深入了解它们的细胞组成。

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