自动化多模态刺激与同步记录多种小型生物的神经元活动

神经反应能够揭示大脑活动，但在不同实验和个体之间可能存在差异。本方案通过自动化刺激的记录与分析，并简化不同类型和模式刺激的编程，有助于解决这一问题。该自动化技术能够在相同的微流控体系中，平行地对多个神经元和生物体进行记录。

这提高了记录的可重复性，并允许探究神经元在不同群体中的变异性。需要采用不同的刺激模式来揭示神经适应和感觉整合等神经现象。该方法可推广应用于从细胞和类器官到生物体及植物的其他动态信号研究。

首先，打开显微镜，使用引流水注射器填充储液管并排出其中的气泡，然后用缓冲液填充流出管。从真空干燥器中取出微流控装置，将其放置在显微镜载物台上，并迅速插入出口管。

轻轻推动出口端注射器，将液体注入装置，直至某一入口处出现液滴。在该出现液滴的入口处，采用液滴对接液滴的方式连接相应的流体入口管路，确保入口管路末端和装置的入口孔均存在液滴，以避免引入气泡。随后将下一个入口管路连接至下一个液滴处。

如有需要，从出口注入更多液体，并重复操作直至所有入口均被填满。在未使用的入口及蠕虫加样口插入实心阻塞针。在屏幕上检查流体流动方向，确保其朝向符合预期。

翻转阀门控制器上的阀门一，观察刺激物流入微流控区域。如果流速不平衡，请调整储液器的高度。使用金属丝挑取器将年轻成虫动物转移到未接种的线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上，然后加入约五毫升的1倍XS基础缓冲液，使动物能够游动。

用连接好的预装有1至3毫升XS基础缓冲液的导管，将线虫吸入加样注射器中。在体视显微镜下，用一只手将导管插入液面以下，对准每一个目标动物，同时用另一只手操作注射器将线虫吸入导管中。关闭出口管路，取下线虫加样针，通过液滴对液滴的连接方式将线虫加样注射器连接至装置上。

然后轻柔地将动物移入实验区域。建立缓冲液流，并给予最多一小时时间使四甲基唑啉实现固定作用。使用文本编辑器创建一个名为 userdefinedacquisitionsettings 的刺激定义文本文件。

包含自动图像采集刺激设置的文本文件。该文件定义了显微镜采集参数，如曝光和激发时间、实验持续时间、时间间隔以及保存目录。同时，它还定义了实验类型和刺激时序设置。

对于单刺激实验，使用仅包含一个重复刺激命令的格式。对于多模式实验，通过包含代表刺激模式顺序的数字序列，使用具有多个刺激命令的格式。每种模式需在单独的一行中输入一个刺激命令。

接下来，运行显微镜控制软件。确认所有流体入口均已打开，流动区域内的流体流动符合预期，并且在实时窗口中目标神经元已聚焦清晰。然后关闭实时窗口，运行脚本 multipatternrunscript。

在软件中运行 bsh。要分析数据，请依次点击插件、跟踪，然后选择 NeuroTracker。选择包含待跟踪 tiff 视频文件的文件夹，并选择要处理的文件范围。

接下来，使用图像和调整菜单，打开亮度对比度和阈值控制窗口。在阈值窗口中勾选“暗背景”并取消勾选“重置范围”，将阈值方法设置为默认，可视化方式设置为红色。然后在亮度对比度窗口中点击“自动”，以增强神经元的可见性。

在亮度对比度窗口中，调节最小值和最大值滑块，直到神经元清晰可辨。然后调节阈值水平，使所有神经元均显示为与其他物体分离的小红点。调节帧滑块以观察神经元的运动和强度变化，并记录需要排除在追踪之外的个体，例如因与其他个体重叠而无法准确追踪的情况。

确定需要追踪的神经元后，根据需要为每个动物调整阈值水平，使神经元上方的红色阈值区域在每一帧中均可见。单击神经元以记录其位置和阈值水平。当所有神经元均被选中后，按下空格键开始追踪。

监测每只动物的追踪过程，并进行必要的校正。如果 NeuroTracker 暂停，则表示其丢失了神经元。根据需要调整阈值水平，然后重新点击该神经元。

如果整合框跳转到附近其他动物或非神经元结构，请按空格键暂停。将滑块移回第一个出错的帧，然后重新点击正确的神经元位置。运行 neurotrackersummarypdf。

在 MATLAB 中打开 m 文件，并选择包含 NeuroTracker 数据文本文件的文件夹。等待生成摘要 PDF 文件，以验证跟踪过程。可通过编号识别动物，并查看每只动物每次试验的神经反应，以评估群体变异性。

使用函数 databrowse.m 按试验编号、动物编号、刺激模式或其他类别来浏览按组分类的神经数据。通过双脉冲实验测试了时间抑制现象，该实验产生了八种模式，每种模式由两个相隔0至20秒不等时间间隔的一秒气味脉冲组成。

第一次持续一秒的气味脉冲在检测二乙酰的AWA神经元中引发的反应幅度相等，而第二次脉冲的反应则随刺激间间隔的不同而变化。通过捕获试验评估去抑制效应，结果显示对二乙酰刺激产生了适应，但新引入的2-甲基吡嗪刺激并未引发显著的去抑制效应。所测试的多模态刺激表明，单独的化学刺激会引起适应，而单独的光刺激则不会。

然而，联合多模态刺激模式表明，光遗传学反应易受化学诱导的适应性影响。通过修改微流控设计以包含两个区域，我们可同时将基因或其他扰动与匹配的对照进行比较。系统建立后，可在多个方面进行修改。

例如，我们已自动测量了化学剂量反应以及神经活动的状态依赖性变化，例如在睡眠与清醒状态之间的变化。