Name: 来自多个小生物体的自动多模态刺激和同时神经元记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 了解利用微流控技术对秀丽隐杆线虫进行自动化多模态刺激与神经元记录的方法。该技术可同时记录多个生物体的神经活动，提高实验可重复性，并揭示神经适应与时间抑制等关键现象。

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感谢 Fox Avery 对这些方案的测试和对稿件的审阅，感谢 Eric Hall 提供编程协助。本文所述方法的部分经费由美国国家科学基金会 1724026（D.R.A.）提供。

1. 神经成像设备
注：参见 Lawler 和 Albrecht15 有关构建成像与刺激系统的详细说明，该系统可控制显微镜照明时序、图像采集以及刺激递送（图1）。一个低成本的 Arduino Nano 刺激控制器通过数字信号向阀门控制器驱动流体阀，并通过模拟电压信号向 LED 控制器调控光遗传学照明。其他刺激方式（如振动电机和热加热器）可通过数字或模拟信号进行控制。该刺激控制器实现刺激与图像记录的同步 通过 相机信号，由开源的 Micro-Manager 显微镜控制软件指定（&#181;经理16。参见 材料清单 有关本方案中使用的所有材料、试剂、设备和生物体的详细信息。
<ol>
	<li>设置神经成像设备，包括配备GFP光学元件的落射荧光显微镜、具有数字曝光输出信号的sCMOS相机以及刺激控制器15.</li>
	<li>将刺激控制器连接到目标系统 通过 数字或模拟信号。以下示例中使用的系统如下：
	<ol>
		<li>使用阀门控制器进行化学刺激。将阀门控制器连接至流体电磁阀或夹管阀（图1)15.</li>
		<li>使用安装在显微镜载物台上方的615 nm红色LED及其控制器进行光遗传学刺激。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用显微镜控制软件设置计算机，创建包含设备参数的配置预设，&#160;并确保刺激控制的正常运行15.</li>
</ol>
2. 微流控装置的制备
注意：有关获取或制作母模以及微流控装置的生产、使用和清洗的详细信息，请参见 Lagoy 等人17。这些步骤在下方进行了简要总结。
<ol>
	<li>使用提供的微流控设计文件（albrechtlab.github.io/microfluidics）17 获取或制作母模。对于成年早期的 C. elegans，确保通道高度为 55–70 µm。</li>
	<li>按 10:1 的质量比混合 PDMS 基底与固化剂，并用移液管充分混合。</li>
	<li>在真空干燥器中脱气 30–60 分钟，直至气泡完全消失。</li>
	<li>将母模放入一个大（直径 150 mm）培养皿中，倒入脱气后的 PDMS 至 4–5 mm 深度（约 100 g）。用移液管检查并清除任何灰尘或气泡。</li>
	<li>在水平烘箱中以 65 °C 烘烤 3 小时至过夜。</li>
	<li>固化后，使用解剖刀将 PDMS 从模具上切下，并用直刃剃刀片分离各个装置。</li>
	<li>使用 1 mm 皮肤打孔器打出入液口和出液口，并依次用 dH2O、乙醇和 dH2O 清洗孔道。用气流吹干装置（见 图 2A）。</li>
	<li>用胶带清洁 PDMS 装置的两面，去除任何灰尘或碎屑。</li>
	<li>按文献所述17 准备玻璃载片以完成微流控装置。使用金刚石钻头在顶片上钻出入口孔，并通过 TFOCS 蒸气处理或疏水性玻璃涂层使底片具有疏水性（图 2B）。</li>
	<li>将玻璃-PDMS 装置夹心结构装入夹具中（图 2C）。</li>
</ol>
3. 动物准备
<ol>
	<li>获取或构建在目标神经元中表达遗传编码钙指示剂的动物。 
	注：例如，品系 NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::dsRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) 在 AWA 感觉神经元对中表达 GCaMP 以及对红光敏感的阳离子通道 Chrimson6。这两个转基因均整合至基因组中，可在每只动物中实现稳定表达。</li>
	<li>实验前一天，将每组至少 20 只 L4 幼虫期的 C. elegans 转移至接种了 OP50 E. coli 菌苔的线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上。在 20 °C 条件下培养，可使野生型动物于次日同步化至年轻成虫阶段。 
	注：对于转基因阵列，应使用荧光体视显微镜挑选动物，以确保所选个体中存在转基因表达。</li>
</ol>
4. 溶液配制
<ol>
	<li>从10x储存液配制1x S基础缓冲液（100 mM NaCl 和 0.05 M KPO4，pH 6.0）。</li>
	<li>通过将1 M储存液稀释至1x S基础缓冲液中，配制1 mM四甲唑缓冲液。使用该麻痹缓冲液配制所有刺激溶液。一次实验通常使用约150 mL。</li>
	<li>向“对照”缓冲液储液槽中加入0.1–1 µg/mL荧光素，以可视化液体流动。</li>
	<li>通过连续稀释法配制所需终浓度的刺激溶液。例如，可通过先配制10−3的储存液，再进一步稀释获得10−7的二乙酰刺激物溶液。 
	注意：&#160;可在刺激液或缓冲液中添加少量荧光素（0.1–1 µg/mL）以验证刺激时序，但浓度应尽可能低，以避免对神经荧光信号造成干扰。</li>
</ol>
5. 微流控装置的制备
注意：有关储液池制备、装置设置及动物装载的视频方案，请参见 Reilly 等人9。另请参见 Lagoy 等人17 提供的书面方案，其中包含许多实用建议。
<ol>
	<li>准备三个或更多液体储液罐。每个储液罐连接一个30 mL或60 mL的储液注射器、一个3 mL的预充注射器和一根针头短管至一个三通鲁尔阀（图2D）。将针头连接至末端带金属管的微孔管路。标记各储液罐，将其安装在固定于铁架台的支架上，并注入相应的缓冲液或刺激液（图2E）。</li>
	<li>将组装好的微流控装置置于真空干燥器中脱气约1小时。</li>
	<li>使用预充注射器填充储液罐管路并排除其中的气泡。用缓冲液填充出口管路。</li>
	<li>将微流控装置从真空环境中取出，迅速插入出口管路，并通过装置注入液体，直至某一入口处出现液滴。</li>
	<li>在该入口处，采用“液滴对液滴”连接方式17插入对应的流体入口管（图2F）。确保入口管和装置端口孔上均有液滴存在，以避免引入气泡。</li>
	<li>从出口继续注入液体，连接下一个入口管，并重复此过程直至所有入口均被填充。在任何未使用的入口及线虫加样口插入实心阻塞针。</li>
	<li>打开入口和出口的鲁尔阀以启动流体流动。使用显微镜实时成像软件检查装置入口和玻璃基底是否存在泄漏，以及流道或入口中是否存在气泡。 
	&#8203;注意：若存在气泡，请等待其被PDMS材料吸收。</li>
</ol>
6. 动物装载
注意：参见 Lagoy 等人17。
<ol>
	<li>使用金属丝尖的“挑针”将年轻成虫转移到未接种的 NGM 琼脂平板上。</li>
	<li>向平板中加入约 5 mL 的 1× S 基础缓冲液，使线虫处于游动状态。</li>
	<li>将线虫吸入加样注射器（1 mL 或 3 mL 注射器，连接一段预先充满 1× S 基础缓冲液的软管）中。
	<ol>
		<li>在体视显微镜下，用一只手将软管末端移至液面以下，对准目标线虫，另一只手操作注射器将线虫吸入软管中。</li>
		<li>仅将线虫吸入软管内，不要吸入注射器本体。 
		注意：软管通常仅能容纳约 100 µL。可将线虫排出至局部区域，再用少量液体重新吸入软管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭出口管路，取下线虫加样针，通过液滴对液滴连接方式将线虫加样注射器连接至装置。</li>
	<li>轻柔地将线虫流入记录区域，建立缓冲液流动，并给予最多 1 小时的四甲咪唑处理以实现固定。 
	&#8203;注意：在固定期间，确保仅有缓冲液进入记录区域。此期间可关闭刺激液和对照液储液器，但在开始刺激实验前需打开并确认流动正常。</li>
</ol>
7. 自动化刺激与神经元记录
<ol>
	<li>创建一个名为刺激定义的文本文件 &#34;用户自定义采集设置.txt&#34; 使用文本编辑器（例如记事本）打开包含自动图像采集刺激参数设置的文件（参见示例于 图3）。设置分为两个部分：
	<ol>
		<li>显微镜采集参数设置： 定义实验类型（单刺激或多重模式）、曝光与激发时间、试验持续时间及间隔，并设置保存目录。</li>
		<li>刺激设置： 定义刺激控制参数。A &#34;刺激指令&#34; 指定在特定视频帧上发生的操作，其语法为 &#60;字母代码&#62;&#60;帧数&#62;，其中字母代码对应关系为：A = 阀门1，B = 阀门2，C = 阀门3，L = LED 光源；此外，大写字母表示开启，小写字母表示关闭。LED 光源强度通过字母代码设定 &#34;i&#34; 0（关闭）到255（最大亮度）的数值。 
		注意：LED 强度值从 0 到 255 可设置输出模拟电压从 0 V 到 5 V。此处使用的电流控制器具有线性强度缩放，其他控制器应使用光功率计进行校准。
		<ol>
			<li>对于仅包含一次重复刺激指令的单刺激实验，使用以下格式 图3A.</li>
			<li>对于包含多个刺激指令的多模式实验，请使用以下格式 图3B。包括一个 &#34;模式序列&#34; 代表刺激模式顺序的数字序列。每种模式需在单独一行输入一个刺激指令。 
			注意：伪随机序列或m序列可用于研究刺激历史依赖性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行显微镜控制软件。确认所有流体入口均已打开，且竞技场内的流速符合预期（参见 图2H），且在实时窗口中目标神经元处于聚焦状态。</li>
	<li>关闭实时窗口并运行脚本 &#34;MultiPattern_RunScript.bsh&#34; 在软件内。 
	注意：在不使用动物的情况下运行一次测试实验有助于验证流动和刺激是否正常。为每种刺激液替换不同浓度的荧光素可帮助观察和记录新的刺激模式。</li>
	<li>实验结束后，拆卸微流控装置，并用水冲洗所有表面、管路和储液池。 
	&#8203;注意：所有组件若保持清洁，可重复使用数十次。确保储液器、管路和微流控装置保持湿润，或用气流彻底干燥，以避免盐结晶，盐结晶可能导致堵塞且难以清除。装置可用乙醇保存以达到灭菌目的，但重复使用前应彻底干燥。&#62;65 ℃下 1 小时 &#176;C)17.</li>
</ol>
8. 使用 NeuroTracker 进行数据分析
注意：NeuroTracker4,18,19 是一个用于 ImageJ/FIJI20 的软件插件，可用于追踪多个神经元和动物在实验过程中运动时的荧光强度。该插件将数据保存为文本文件，其中包含每个神经元的位置及经背景校正后的荧光强度（F）。荧光数据将归一化至基线荧光强度（F0），例如刺激前数秒的平均值，表示为 ΔF/F0 = (F -F0)/F0，该值可在群体水平上进行平均。
<ol>
	<li>按照说明安装 NeuroTracker 脚本（github.com/albrechtLab/Neurotracker）。</li>
	<li>通过点击 Plugins | Tracking | NeuroTracker 运行 NeuroTracker。</li>
	<li>选择包含待追踪 .TIF 视频文件的文件夹，并选择所需的设置。 
	注意：如果仅需追踪部分视频文件，请在提示时选择要分析的文件的数值范围。默认追踪设置适用于分辨率为 250 pix/mm 的非运动性动物。对于其他分辨率，请按比例调整参数。更多设置信息请参见用户指南19。</li>
	<li>设置强度阈值，使神经元可见以便选择（图 4）。</li>
	<li>使用 Image | Adjust 菜单打开 亮度/对比度 (B/C) 和 阈值 控制窗口。</li>
	<li>在 B/C 窗口中，调节 最小值 和 最大值 滑块，直到神经元清晰可辨（图 4A）。</li>
	<li>在 阈值 窗口中，勾选 暗背景 和 不要重置范围。</li>
	<li>滑动帧滑块以观察神经元的运动和强度变化，注意记录需要排除追踪的个体，例如因与其他个体重叠而无法分辨的情况。</li>
	<li>确定用于追踪的神经元。</li>
	<li>对每个个体，调节阈值水平，确保在刺激前、刺激中和刺激后每一帧中，神经元上方的红色阈值区域均可见。</li>
	<li>点击神经元以记录其位置和阈值水平。</li>
	<li>对每个需要追踪的个体和神经元重复进行阈值调节和选择。良好的阈值水平示例见 图 4C，过高和过低阈值的示例分别见 图 4D、E。先前已选中的神经元将以一个小方框标示。</li>
	<li>当所有神经元均被选中后，按下 空格键 开始追踪。 
	注意：更多 NeuroTracker 使用示例请参见先前文献4,19。</li>
	<li>监控每个个体的追踪过程，并进行必要的修正。</li>
	<li>如果 NeuroTracker 暂停，说明已丢失神经元。请重新点击该神经元，并根据需要调整阈值水平。</li>
	<li>如果积分框跳转到附近另一个个体或非神经元结构上，请按下 空格键 暂停，将 滑块 回退至第一个出错的帧，然后重新点击正确的神经元位置。</li>
</ol>
9. 数据探索与可视化
注意：MATLAB 分析脚本用于数据处理与可视化，并为每次分析生成摘要 PDF 文件。
<ol>
	<li>在 MATLAB 中运行“NeuroTrackerSummary_pdf.m”文件，并选择包含 NeuroTracker 数据文本文件的文件夹。</li>
	<li>等待生成摘要 PDF 文件，以验证追踪过程（图 5）。每只动物以编号标识（图 5A），可查看每只动物每次实验的神经反应，以评估群体间的变异性（图 5B）。</li>
	<li>使用“databrowse.m”函数浏览神经数据，例如按实验编号（图 5C）、按动物编号（图 5D）、按刺激模式或其他类别进行分组。</li>
</ol>

<ol><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1, 025008(2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).</li>
<li>Larsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circuit+for+gradient+climbing+in+C.+elegans+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis.</a> Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).</li>
<li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fluid+delivery+from+multiwell+plates+to+microfluidic+devices+for+high-throughput+experiments+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 6217(2018).</li>
<li>Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>Lawler, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+analysis+in+adult+C.+elegans+reveals+state-dependent+alteration+of+neural+and+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).</li>
<li>Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+adapted+microfluidic+olfactory+chip+for+the+imaging+of+neuronal+activity+in+response+to+pheromones+in+male+C.+elegans+head+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56026(2017).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymer+index-matched+to+water+enables+diverse+applications+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy.</a> Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).</li>
<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).</li>
<li>Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+behavioral+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+in+precise+spatiotemporal+chemical+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments.</a> Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Cohen, R. A. Temporal Inhibition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+RA+%22Encyclopedia+of+Clinical+Neuropsychology%22">Encyclopedia of Clinical Neuropsychology</a>. Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. , Springer. New York, NY. 2480-2481 (2011).</li>
<li>Lawler, D. E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+neural+activity+during+sleep%2Fwake+events+in+adult+C.+elegans+by+automated+sleep+detection+and+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101532(2022).</li>
<li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+of+microscope+control+using+%C2%B5Manager+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> Journal of Biological Methods. 1 (2), 10(2014).</li>
<li>Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+behavioral+analysis%2C+microscopy%2C+and+neuronal+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).</li>
<li>NeuroTracker. GitHub. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022).</li>
<li>NeuroTracker User Guide. GitHub. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/albrechtLab/Neurotracker">https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</a> (2022).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Galotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+triggers+calcium-mediated+immune+response+in+the+plant+model+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).</li>
<li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids%3A+Advances%2C+applications+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), 166074(2019).</li>
<li>Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+synaptic+signaling%2C+regulation%2C+and+plasticity+distinguish+two+classes+of+C.+elegans+glutamatergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons.</a> eLife. 6, 31234(2017).</li>
<li>Boulin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们描述了一种开放获取的显微成像系统，该系统通过精确控制不同刺激模式的时间序列，用于评估神经活动现象。该微流控平台能够在保持数十个样本始终处于显微镜视野内的同时，重复递送可重现的刺激。目前市面上的商业显微镜软件中，仅有少数支持便捷地编程设置多种刺激时间模式，而具备此功能的软件通常需要手动输入每个刺激模式或依赖专有文件格式。相比之下，本系统通过文本文件定义实验流程，这些文件既可由计算机自动生成，也可被数据分析软件直接读取。本文展示了利用可变刺激模式评估神经元现象（如时间抑制、适应性以及多模态刺激下的信号串扰）的有效性。数据分析流程可将庞大的显微成像视频文件转化为神经活动数据，进而用于可视化和分析群体间的变异性（图5B）、随时间变化的趋势（图7C 和 图8C、D），以及扰动后的变化情况（图7C）。
自动化的一个关键优势在于能够...

钙成像技术使得利用荧光显微镜和在靶细胞中表达的基因编码钙指示剂，能够以非侵入方式实时记录体内神经活动动态1,2,3。这些传感器通常采用绿色荧光蛋白（GFP），例如GFP-钙调蛋白-M13肽（GCaMP）家族，在神经元激活及细胞内钙离子浓度升高时增强荧光强度。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，钙成像技术尤其强大，可用于研究神经元和神经回路在活体、行为状态下的动物中的功能4,5,6,7,8,9,10，因其身体透明，无需手术即可实现光学观测，且可通过细胞特异性基因启动子将表达靶向至目标细胞。这些技术常结合微流控装置使用，后者可在微小物理尺度上提供精确控制的环境，用于研究生物学、化学和物理现象11,12。目前已有大量用于测量神经活动的微流控装置设计，且新设计不断涌现，研究实验室可方便地自行制备。然而，许多设计一次仅能固定单个动物，限制了实验通量7,9,13。由于个体先前经历、应激或饥饿等内部状态差异，或基因表达水平等随机因素，神经反应在不同动物间常表现出显著变异。这些差异促使人们需要发展能够同时刺激并观察多个动物，并从个体中提取信息的方法4。
此外，某些神经调节现象仅在特定刺激条件下才会显现，例如时间抑制14，即当刺激快速连续发生时，神经反应会出现短暂的抑制。为此，电生理系统能够在广泛的刺激参数空间内驱动神经活动，调节例如电脉冲的电流、电压、频率、波形、占空比以及周期性刺激序列的时间特性。通过自然检测到的刺激或光遗传学系统进行的间接刺激，也将受益于类似范围的控制机制。目前，许多自然刺激通常采用简单的&#34;开关&#34;方式呈现，例如气味的施加与移除，而现有的商用系统在增加灵活性方面进展缓慢。然而，如今低成本的微控制器已能够以可定制化的方式自动递送多种类型的刺激。结合微流控技术，这些系统实现了提高实验通量和灵活性的目标，使得可在多个动物中同时测量其对多种精确刺激的神经反应4,6。多模态刺激还可用于进一步探究神经环路，例如在药物暴露等正交干扰前后及期间持续施加刺激，以监测神经兴奋性的变化4。低成本、开放式的显微系统在推动科学研究方面的优势显而易见，但在实际应用中，元件采购、系统搭建和性能验证的需求可能阻碍这些技术的广泛应用。
本方案旨在缓解其中一些技术难题。以往的方案主要关注微流控装置的使用和基本刺激9,15,17我们在此描述一种用于神经成像研究的灵活、自动化、多模态刺激递送系统的构建与使用方法 秀丽隐杆线虫 或利用先前描述的微流控装置的其他小型生物体4. 该开源系统已进行编程 通过 使用简单的文本文件定义实验，NeuroTracker 数据分析程序可从显微镜视频中半自动提取神经活动数据。我们以化学感受神经元 AWA 为例，展示该系统的应用，用于评估时间抑制、去抑制以及刺激串扰；AWA 神经元在响应不同食物气味时会发生去极化，或在表达光遗传学光敏离子通道时响应光照而发生去极化。5,6.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细菌菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.&amp;nbsp;coli&lt;/em&gt; (OP50)</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis &lt;/em&gt;遗传中心 (CGC)</td><td>Cat# OP50</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验模型：生物体/菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C.&amp;nbsp;elegans&lt;/em&gt; 菌株，在目标神经元中表达 GCaMP（可选地，同时表达 Chrimson）</td><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis &lt;/em&gt;遗传中心 (CGC) 或已发表文献的通讯作者</td><td>例如 NZ1091</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学品、处理试剂及线虫制备耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3-丁二酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B85307</td><td>二乙酰，示例化学刺激物</td></tr><tr><td>氯化钙，CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C3881</td><td></td></tr><tr><td>荧光素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# F6377</td><td></td></tr><tr><td>玻璃防水涂层剂</td><td>Rain-X</td><td>Cat #800002250</td><td>玻璃疏水处理（一次性使用）</td></tr><tr><td>氯化镁，MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# M2393</td><td></td></tr><tr><td>线虫生长培养基（NGM）琼脂</td><td>Genesee</td><td>Cat #: 20-273NGM</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（60&amp;nbsp;mm）</td><td>Tritech</td><td>Cat #T3305</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）：Sylgard 184</td><td>Dow Chemical</td><td>Cat# 1673921</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P5655</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P8281</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠，NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S7653</td><td></td></tr><tr><td>(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷（TFOCS）</td><td>Gelest</td><td>CAS# 78560-45-9</td><td>玻璃疏水处理（耐用型）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件与算法&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino IDE</td><td>Arduino</td><td>https://www.arduino.cc/en/software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td></td></tr><tr><td>Micro-manager</td><td>Micro-manager</td><td>https://micro-manager.org/</td><td></td></tr><tr><td>显微镜控制软件</td><td>Albrecht 实验室</td><td>https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl</td><td></td></tr><tr><td>Neurotracker 数据分析软件</td><td>Albrecht 实验室</td><td>https://github.com/albrechtLab/Neurotracker</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;自动化显微镜与刺激系统&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.A1 倒置显微镜，配置落射荧光系统（GFP 滤光片组，5&amp;times; 物镜或类似规格）</td><td>Zeiss</td><td>Cat #491237-0012-000</td><td></td></tr><tr><td>Excelitas X-cite XYLIS LED 照明器</td><td>Excelitas</td><td>Cat #XYLIS</td><td></td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 数字 sCMOS 相机</td><td>Hamamatsu</td><td>Cat #C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Arduino nano</td><td>Arduino</td><td>Cat #A000005</td><td></td></tr><tr><td>三通微型隔膜隔离阀（LQX12）</td><td>Parker</td><td>Cat #LQX12-3W24FF48-000</td><td>阀门 1：控制</td></tr><tr><td>二通常闭（NC）夹管阀</td><td>Bio-Chem Valve Inc</td><td>Cat #075P2-S432</td><td>阀门 2：流出</td></tr><tr><td>三通夹管阀</td><td>NResearch</td><td>Cat #161P091</td><td>阀门 3：刺激选择</td></tr><tr><td>光遗传学刺激 LED 及控制器（615 nm）</td><td>Mightex</td><td>Cat #PLS-0625-030-S 和 #SLA-1200-2</td><td></td></tr><tr><td>ValveLink 8.2 数字/手动阀门控制器</td><td>AutoMate Scientific</td><td>Cat #01-18</td><td></td></tr><tr><td>导线与连接器</td><td>多种来源</td><td>参见 Cell STARS 方案中的图 2（Lawler, 2021）</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;微流控装置制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dremel 可调速旋转切割器 4000&amp;nbsp;</td><td>Dremel</td><td>Cat #F0134000AB</td><td>切割玻璃时设定转速为 5,000 RPM</td></tr><tr><td>Dremel 钻台旋转工具工作站</td><td>Dremel</td><td>Cat #220-01</td><td></td></tr><tr><td>金刚石钻头</td><td>Dremel</td><td>Cat #7134</td><td></td></tr><tr><td>载玻片，厚度 1&amp;nbsp;mm</td><td>VWR</td><td>Cat #75799-268</td><td></td></tr><tr><td>玻璃刻划笔（金刚石刻划器）</td><td>Ted Pella</td><td>Cat #54468</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔三通旋塞阀</td><td>Cole-Parmer</td><td>Cat #EW-30600-07</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔 23G 钝头针</td><td>VWR</td><td>Cat #89134-100</td><td></td></tr><tr><td>微流控装置</td><td>通讯作者提供，或根据本文附带的 CAD 文件自行制备</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>微流控装置夹具</td><td>Warner Instruments（或机械加工车间）</td><td>P-2</td><td></td></tr><tr><td>微流控管路，内径 0.02&amp;Prime;</td><td>Cole-Parmer</td><td>Cat #EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>管路 19G，0.5&amp;Prime;</td><td>New England Small Tube</td><td>Cat #NE-1027-12</td><td></td></tr></tbody></table>

自动化多模态刺激与同步记录多种小型生物的神经元活动

Automated Multimodal Stimulation and Simultaneous Neuronal Recording from Multiple Small Organisms

荧光遗传编码钙指示剂极大地促进了我们对从单个神经元到整个脑环路水平神经动态的理解。然而，神经反应可能因先前经验、内部状态或随机因素而有所不同，因此需要能够同时评估大量个体神经功能的方法。尽管大多数记录技术一次仅检测单个动物，本文介绍了利用宽场显微镜技术，同时对数十个秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）或其他亚毫米尺度生物体进行神经元活动记录的方法。开源硬件与软件使得编程完全自动化的实验具有高度灵活性，可精确控制化学、光学、机械、热和电磁等多种刺激的强度与时间。特别是微流控流动装置，能够以亚秒级时间分辨率对化学感受刺激实现精确、可重复且定量的控制。随后，NeuroTracker半自动化数据分析流程可提取个体及群体范围的神经反应，揭示神经兴奋性与动态功能的变化。本文展示了测量神经元适应性、时间抑制以及刺激串扰的应用实例。这些技术提高了刺激的精确性与可重复性，支持对群体变异性的研究，并可推广应用于从小型生物系统（包括细胞、类器官、完整生物体乃至植物）中的其他动态荧光信号检测。

我们展示了多种刺激模式示例，用于评估不同的神经现象，包括时间抑制、适应和去抑制。 时序性抑制 是指对紧随初始呈现之后出现的第二次刺激呈现所产生的神经反应的瞬时抑制。14为验证这一现象，在配对脉冲实验中，我们呈现了八种刺激模式，每种模式由两个持续1秒的气味脉冲组成，脉冲间隔时间范围为0秒至20秒。图 6B；参见 图 3B （对应刺激控制文件）。实验区域设置单一刺激液（1.1 &#181;M 二乙酰)、缓冲液和对照流路管，未使用的入口端口用实心销钉封堵。图 6A）。通过开启阀门1，控制液进入 ctrl1 入口，切换流体流路，使刺激物进入实验区；当阀门1关闭时，对照流体进入。 ctrl2 入口，缓冲液流经实验区（参见 图 2G,H)。尽管首个持续1秒的二乙酰...

我们介绍一种灵活的化学和多模式刺激方法，可同时对多条秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）进行神经活动的刺激与记录。该方法结合微流控技术、开源硬件与软件，以及有监督的自动化数据分析，能够测量神经元现象，如适应性、时间抑制和刺激串扰。

荧光遗传编码钙指示剂极大地促进了我们对从单个神经元水平到神经回路动态活动的理解。

神经反应能够揭示大脑活动，但在不同实验和个体之间可能存在差异。本方案通过自动化刺激的记录与分析，并简化不同类型和模式刺激的编程，有助于解决这一问题。该自动化技术能够在相同的微流控格式中，平行地对多个神经元和生物体进行记录。这提高了记录的可重复性，并允许探究神经元在不同群体中的变异性。需要采用不同的刺激模式来揭示神经适应和感觉整合等神经现象。该方法可推广应用于从细胞、类器官到生物体及植物的其他动态信号研究。首先，打开显微镜，使用引流水注射器填充储液管并排出其中的气泡，然后用缓冲液填充流出管。从真空干燥器中取出微流控装置，将其放置在显微镜载物台上，并迅速插入出口管。轻轻推动出口端注射器，将液体注入装置，直至某一入口处出现液滴。在该出现液滴的入口处，采用液滴对接液滴的方式连接相应的流体入口管，确保入口管端和装置入口孔处均存在液滴，以避免引入气泡。随后将下一个入口管连接至下一个液滴处。如有需要，从出口注入更多液体，并重复操作直至所有入口均被填满。在未使用的入口及蠕虫加样口插入实心阻塞针。在屏幕上检查流体流动方向，确保其朝向符合预期。翻转阀门控制器上的阀门一，观察刺激物流入微流控区域。如果流速不平衡，请调整储液器的高度。使用金属丝挑取器将年轻成虫动物转移到未接种的线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上，然后加入约五毫升的1倍XS基础缓冲液，使动物能够游动。用连接好的预装有1倍XS基础缓冲液的管路，将线虫吸入一个1至3毫升的上样注射器中。在体视显微镜下，一手持管路将其末端移至液面下方，对准每一个目标动物，另一手持注射器将线虫吸入管路中。关闭出口通道，取下线虫上样针，通过液滴对液滴连接方式将线虫上样注射器与装置连接。 然后轻柔地将动物移入实验区域。建立缓冲液流，并给予最多一小时时间使四甲基唑啉实现固定作用。使用文本编辑器创建一个名为 userdefinedacquisitionsettings 的刺激定义文本文件。包含自动图像采集刺激设置的文本文件。该文件定义了显微镜采集参数，如曝光和激发时间、实验持续时间、时间间隔以及保存目录。同时，它还定义了实验类型和刺激时序设置。对于单次刺激实验，使用仅包含一条重复刺激指令的格式。对于多模式实验，通过添加代表刺激模式顺序的数字序列，使用包含多条刺激指令的格式。每种模式需在单独的一行中输入一条刺激指令。接下来，运行显微镜控制软件。确认所有流体入口均已打开，流动腔内液体流动符合预期，并且在实时成像窗口中目标神经元已聚焦清晰。然后关闭实时成像窗口，运行脚本 multipatternrunscript。在软件中运行 bsh。为分析数据，依次点击插件、跟踪，然后选择 NeuroTracker。选择包含待跟踪 tiff 视频文件的文件夹，并选择要处理的文件范围。接下来，使用图像和调整菜单，打开亮度对比度和阈值控制窗口。在阈值窗口中勾选“暗背景”并取消勾选“重置范围”，将阈值方法设置为默认，可视化方式设置为红色。然后在亮度对比度窗口中点击“自动”，以增强神经元的可见性。在亮度对比度窗口中，调节最小值和最大值滑块，直至神经元清晰可辨。然后调节阈值水平，使所有神经元均显示为与其他物体分离的小红点。调节帧滑块以观察神经元的运动和强度变化，并记录需要排除在追踪之外的个体，例如因与其他个体重叠而无法准确追踪的情况。确定需要追踪的神经元后，根据需要为每个动物调整阈值水平，使神经元上方的红色阈值区域在每一帧中均可见。单击神经元以记录其位置和阈值水平。当所有神经元均被选中后，按下空格键开始追踪。监测每只动物的追踪过程，并进行必要的校正。如果 NeuroTracker 停止，说明其丢失了神经元。根据需要调整阈值水平，然后重新点击该神经元。如果整合框跳转到附近其他动物或非神经元结构，请按空格键暂停。将滑块移回第一个出错的帧，然后重新点击正确的神经元位置。运行 neurotrackersummarypdf。在 MATLAB 中打开 m 文件，并选择包含 NeuroTracker 数据文本文件的文件夹。等待生成摘要 PDF 文件，以验证跟踪过程。可通过编号识别动物，并查看每只动物每次试验的神经反应，以评估群体变异性。使用函数 databrowse.m 按试验编号、动物编号、刺激模式或其它类别来浏览按组分类的神经数据。通过双脉冲实验测试了时间抑制现象，该实验产生了八种模式，每种模式由两个相隔0至20秒不等时间间隔的一秒气味脉冲组成。第一次持续一秒的气味脉冲在检测二乙酰的AWA神经元中引发的反应幅度相等，而第二次脉冲的反应则随刺激间间隔的不同而变化。通过捕获试验评估去抑制效应，观察到对二乙酰刺激产生适应，但呈现新的2-甲基吡嗪刺激并未引发显著的去抑制效应。所测试的多模态刺激显示，单独的化学刺激会引起适应，而单独的光刺激则不会。然而，联合多模态刺激模式表明，光遗传学反应易受化学诱导的适应性影响。通过修改微流控设计以包含两个区域，我们能够同时比较基因或其他扰动与匹配对照的结果。系统建立后，可在多个方面进行修改。例如，我们已自动测量了化学剂量反应以及神经活动的状态依赖性变化，例如在睡眠与清醒状态之间的变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

来自多个小生物体的自动多模态刺激和同时神经元记录

本文描述了一种在加州海兔（Aplysia...

电极制备及在完整自由活动动物中用于多通道神经和肌肉记录的加州海兔（Aplysia californica）体内植入

将介绍在麻醉大鼠中使用硅探针进行神经元活动的细胞外记录技术。该技术能够同时从超过100个神经元中获取多个脑区的信息，以单细胞分辨率提供关于多个局部神经回路中神经元集群动态的信息。...

使用硅探针在麻醉大鼠中记录大规模神经元集群活动

我们介绍了利用硅探针在活动中的啮齿类动物体内进行大规模多单细胞单位和局部场电位记录的方法。文中详细展示了驱动器的制作、探针与驱动器的连接以及探针植入过程，以便于轻松重复操作。...

通过可移动硅探针在行为啮齿类动物中进行大规模神经元记录

本视频介绍了一种同时对含有神经元特异性荧光蛋白的转基因脑片进行成像和记录电活动的方法。该方法包括将脑片置于灌流室中，并用充氧的人工脑脊液维持；使用光源激发荧光标记的细胞；并通过多通道探针和膜片钳技术记录电信号。...

脑切片中神经元细胞的同步光学与电生理监测

该视频展示了利用集成式微型驱动阵列在大鼠体内对多个脑区进行同步电生理记录。记录电极置于嗅球，参考电极置于额叶皮层，微型驱动阵列电极则植入海马体。大鼠可自由觅食，所有植入电极的同步记录信号均通过该阵列采集。...

一种用于多脑区电生理记录的微型驱动阵列方法

植入有序排列的微丝阵列用于单细胞电生理记录面临诸多技术挑战。 本文描述了实施该技术的方法及所需设备。 此外，还讨论了利用有序微丝阵列以高空间选择性记录不同神经亚区活动的优势。...

一种用于在清醒行为动物中植入有序排列的微丝电极阵列以进行单细胞记录的操作流程

在蜜蜂中建立了同时对两个不同脑神经簇或两个不同解剖通路进行的细胞外长期记录。这些记录使得能够在活体动物中，在单个神经元水平以及神经元集群水平上，研究不同脑区之间神经活动处理的时间特性。...

在行为蜜蜂中同时进行两个神经处理阶段的长期记录

介绍了一种用于自由活动大鼠的多通道神经记录与刺激的无线双向系统。该系统轻便紧凑，对动物的行为模式影响极小。此外，这种双向系统为评估脑激活模式与行为之间的因果关系提供了先进的工具。...

一种无线双向接口 体内 在自由活动大鼠中记录与刺激神经活动

本研究介绍了一种同步记录自由活动大鼠脑部局部场电位、心电图、肌电图和呼吸信号的方法。该技术可降低实验成本并简化数据分析，有助于深入理解大脑与外周器官之间的相互作用。...

自由活动大鼠皮层局部场电位、心电图、肌电图与呼吸节律的同步记录

在此，我们采用高密度微电极阵列（HD-MEA）深入研究大规模神经元群集的计算动力学，特别是在海马体、嗅球环路以及人类神经元网络中的应用。通过捕捉时空电活动并结合计算工具，可深入了解神经元群集的复杂性。该方法有助于增进对脑功能的理解，并有望为神经系统疾病发现生物标志物和治疗方法。...

在CMOS集成高密度微电极阵列上记录与分析多模态大规模神经元集群动态

我们开发了一种简化且经济高效的电极制备方法，并在自由活动的小鼠中实现了多个脑区信号的记录。结合光遗传学、多脑区电生理记录和钙信号记录，揭示了癫痫点燃模型中跨脑区的神经元活动特征。...

一种用于多区域体内记录的灵活便捷电生理光导电极的集成制备方法

了解利用微流控技术对秀丽隐杆线虫进行自动化多模态刺激与神经元记录的方法。该技术可同时记录多个生物体的神经活动，提高实验可重复性，并揭示神经适应与时间抑制等关键现象。

自动化多模态刺激与同步记录多种小型生物的神经元活动

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