Name: 慢性肝纤维化小鼠模型用于研究胆道闭锁 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学习建立慢性肝纤维化小鼠模型用于研究胆道闭锁病理机制。该模型通过抗Ly6G抗体治疗和轮状病毒注射模拟急性与慢性症状，为探索潜在治疗方法提供可靠平台。

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本工作获得了国家自然科学基金（81974056）对R.Z.的资助，以及国家自然科学青年基金（82101808）和广州市科技计划项目（No. 202102020196）对Z.L.的资助。

本研究经广州永诺生物医药动物中心机构动物护理和使用委员会批准（IACUC-AEWC-F2208020），所有动物实验均在此机构进行。
1. 慢性纤维化胆道闭锁小鼠模型的建立
注意：所有动物均在同一房间内的无特定病原体（SPF）环境中饲养，实验在普通环境中进行。选择妊娠第12.5天的BALB/c小鼠（年龄：10–12周；体重：35–40 g），在25°C、12小时明暗循环条件下、无特定病原体的房间内饲养，并可自由摄取经高压灭菌的食物和水。出生后24小时内（平均体重：1.5–1.6 g）的新生小鼠被选用于小鼠胆道闭锁模型。
<ol>
	<li>按照先前报道的方法制备RRV16。 
	注意：由于模型小鼠存活状况较差，需在21日龄时将其分笼饲养，以避免被同笼其他小鼠咬伤甚至咬死。</li>
	<li>将新生小鼠分为三组：对照组、RRV组和RRV + 抗-Ly6G组。出生后24小时内，向新生小鼠腹腔注射20 µL RRV（滴度：1.5 × 106 PFU/mL）（RRV组）或生理盐水（对照组）。为耗竭Gr-1+细胞，在RRV注射前4小时，每只小鼠预先腹腔注射5 µg抗-Ly6G抗体。 
	注意：抗-Ly6G抗体溶液应保存在2–8 °C，不可冷冻。使用前取出，室温放置30分钟使其回温。</li>
	<li>从RRV注射当天起，每隔3天向小鼠腹腔注射10 µg抗-Ly6G抗体，直至第12天（图1A）。</li>
	<li>每日观察并记录所有小鼠的外观、体重及存活情况。</li>
</ol>
2. 小鼠腹腔注射
<ol>
	<li>将新生小鼠从笼中取出。使用1 mL胰岛素注射器注射20 µL RRV溶液或50 µL抗Ly6G抗体溶液。用一只手的食指和拇指捏住幼鼠颈部皮肤，并用无名指和小指轻轻固定其后肢，以暴露腹部。</li>
	<li>将针头向上倾斜抬起。以15°角将针头插入小鼠右后肢大腿中部的皮下，沿皮下路径推进，直至针尖到达小鼠右侧肋缘处，随后将针头转向下方进入腹腔，将液体注射至小鼠肝脏下方。 
	注意：新生小鼠的胃和脾脏位于左腹部。若从左侧进针，容易刺破胃部或&#160;导致脾脏出血。</li>
	<li>注射完成后立即拔出针头，观察注射部位是否有出血或渗漏。如有，用灭菌棉球擦拭，并将小鼠放回母鼠笼中。 
	&#8203;注意：为减少注射过程中液体渗漏对实验结果的影响，操作时应轻柔，缓慢拔出针头，并用棉签按压注射部位30秒。</li>
</ol>
3. 样本组织的采集
<ol>
	<li>第12天，通过吸入4%异氟烷对小鼠进行麻醉，并在显微镜下进行解剖。将1 mL胰岛素注射器插入小鼠心脏的左心室以采集血液。采血后，通过吸入4%异氟烷持续10分钟实施安乐死。在室温下以400 × g 离心5分钟，分离血清用于肝功能检测。 
	注意：血液采集必须在小鼠存活状态下进行。若小鼠死亡，血液将滞留在血管中而无法采集。</li>
	<li>拍摄肝脏和胆管的整体外观照片。随后使用剪刀和镊子将小鼠肝脏和脾脏从周围组织中分离出来。 
	&#8203;注意：肝脏及其他组织采集后，应保存于−80°C用于RNA和蛋白质提取，或浸入10%福尔马林中用于制备组织学标本。</li>
</ol>
4. 肝外胆管的荧光素血管造影
<ol>
	<li>处死小鼠后，使用剪刀和棉签完全暴露肝脏、胆囊和肝外胆管。</li>
	<li>在体视显微镜下观察，用1 mL胰岛素注射器向胆囊内注射5–10 µL荧光染料罗丹明123（20 mg/mL），并拍照。该操作步骤与先前报道的方法相同16。 
	注意：同一组中的不同小鼠分别用于组织样本采集和荧光血管造影。</li>
</ol>
5. H&amp;E 染色
<ol>
	<li>将新鲜的小鼠肝脏组织浸入10%福尔马林中固定24小时。</li>
	<li>将组织包埋于石蜡中后，使用石蜡切片机将石蜡块切成4 µm厚的切片，并将两张连续切片置于同一张载玻片上。操作需由有经验的人员完成，以标准化操作流程并避免割伤手指17。</li>
	<li>将切片放入切片架中，依次用二甲苯脱蜡，再经无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和蒸馏水逐级水化，每步浸泡5分钟。</li>
	<li>用苏木精溶液染色5分钟，再用1%盐酸乙醇（75%酒精）分化5秒，自来水冲洗后，用伊红溶液复染1分钟。</li>
</ol>
6. CK19 和 F4/80 免疫组织化学染色
<ol>
	<li>前三个步骤与H&amp;#38;E染色部分的组织包埋、切片和脱蜡步骤相同。</li>
	<li>使用Tris-EDTA缓冲液（10 mmol/L Tris碱，1 mmol/L EDTA溶液，pH 9.0）进行抗原修复，将切片置于微波炉中95°C加热10分钟，然后取出并自然冷却至室温。</li>
	<li>将组织切片放入3%过氧化氢溶液中孵育10分钟，以去除内源性过氧化物酶。</li>
	<li>用5%山羊血清处理切片，以封闭非特异性结合位点。</li>
	<li>向切片中加入大鼠抗小鼠细胞角蛋白19（cytokeratin 19）或大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体，4 °C孵育过夜。</li>
	<li>在室温下用适当的二抗孵育切片30分钟。</li>
	<li>以3,3'-二氨基联苯胺（DAB）作为显色剂，在显微镜下观察显色反应。</li>
	<li>在40倍显微镜下观察切片并拍照，根据需要进行分析。</li>
</ol>
7. Sirius Red 染色
<ol>
	<li>按照苏木精-伊红（H&E）染色部分所述，完成组织包埋、切片和脱蜡的前三个步骤。</li>
	<li>组织切片经苏木精复染后，在室温下每张切片加50 µL Sirius Red染液，染色1小时。</li>
	<li>将载玻片在室温下自然干燥4小时，每张切片滴加一滴中性树胶，盖上盖玻片，缓慢覆盖组织以避免产生气泡。将切片在室温下放置24小时，使中性树胶完全固化。</li>
	<li>使用偏振光显微镜观察胶原沉积的细节；选择清晰且合适的视野，调节显微镜视野的亮度和白平衡。获取图像，并根据需要在40倍镜下进行分析。</li>
</ol>

<ol><li>Lakshminarayanan, B., Davenport, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia: A comprehensive review.</a> Journal of Autoimmunity. 73, 1-9 (2016).</li>
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<li>Zhang, R., Huang, J., Shan, J., Chen, Y., Xia, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+CD177%28%2B%29+cells+as+an+early+diagnostic+marker+for+biliary+atresia%3A+A+prospective+multicentre+study+in+pediatric+patients+with+cholestasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood CD177(+) cells as an early diagnostic marker for biliary atresia: A prospective multicentre study in pediatric patients with cholestasis.</a> Journal of Hepatology. 77 (6), 1714-1716 (2022).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在本研究中，我们采用抗 Ly6G 抗体清除或减少感染 RRV 的胆道闭锁小鼠模型中的 Gr-1+ 细胞，以改善急性胆道闭锁综合征、延长存活率，并促使胆道闭锁小鼠进入慢性阶段。降低抗体剂量可导致出现伴有肝纤维化的慢性胆道闭锁，这表明 Gr-1+ 细胞的数量变化影响胆道闭锁在急性和慢性阶段的疾病结局。在我们之前的研究中，给予抗 Ly6G 抗体后，Gr-1+ 细胞数量减少，胆道闭锁小鼠的整体生存状况得到改善15。同时，已有报道指出，Gr-1+ 巨噬细胞19、Gr-1+ 中性粒细胞20、Gr-1+ 髓系细胞21 以及 Gr-1+ 粒细胞在某些动物模型中可促进纤维化22。然而，在本研究中，使用低剂量抗 Ly6G 抗体部分耗竭了小鼠体内的 Gr-1+ 细胞，但胶原沉积仍然存在。因此，可能需要更长时间才能更彻底地控制疾病进展。
应用抗Ly6G抗体可减轻炎症，部分保留胆管，并防止小鼠因胆道闭锁（BA）引起的急性死亡。然而，仅有20%至30%的小鼠进入BA的慢性阶段；这可能与抗Ly6G抗体注射的时间点和注射次数有关。我们需要进一步探索这一关键点，以提高实验成功率。此外，我们认为不仅Gr-1+细胞，其他免疫细胞如自然杀伤细胞（NK细胞）、T细胞、B细胞和巨噬细胞也可能发挥重要作用。
关于实验方案，需要注意一些细节。（i）为避免注射药物外漏，我们使用带有直径为0.33 mm针头的1 mL胰岛素注射器，因为针头直径较小，针头在组织上形成的孔洞也较小，有利于降低药物泄漏的可能性。（ii）注射前应固定小鼠，防止其移动，以避免药物泄漏，从而进一步保证实验效果。（iii）在注射药物时，应尽可能将药物注射至小鼠肝脏表面或下缘位置，使药物进入腹腔并充分接触肝脏以发挥效应。（iv）通常从小鼠右上腹部进行注射，因为新生小鼠的胃和脾脏位于左腹部，且胃内充满乳汁。若从左侧进针，容易刺破胃部导致乳汁流入腹腔，或刺破脾脏引起出血。
CD177 是 Ly6G 的同源物，已有研究探讨了 CD177 在胆道闭锁（BA）患者中的表达。CD177 可作为儿童 BA 早期诊断的标志物，表明 CD177+ 细胞在 BA 病程中发挥重要作用23。通过分析 RNA 测序数据，我们团队发现 CD177 细胞是 Gr-1+ 细胞中的优势群体；同时，用 RRV 疫苗接种的 Cd177−/− BALB/c 小鼠表现出 BA 发病延迟，且发病率和死亡率降低18。因此，我们的慢性 BA 小鼠模型在研究 BA 的发病机制和疾病进展方面具有明显优势；同时也为探索 BA 潜在治疗方法提供了合适的动物模型。

胆道闭锁（biliary atresia, BA）是一种常见于婴幼儿的严重肝胆系统疾病，其特征为闭塞性胆管病，临床表现为新生儿黄疸和白陶土样大便1。该病的临床特点为肝内和肝外胆管的炎症性破坏以及进行性纤维化，最终发展为肝功能衰竭2。据统计，亚洲国家胆道闭锁的发病率高于欧美国家，亚洲地区的发病率为1/8,000。胆道闭锁的病因包括病毒感染、胆管发育异常、免疫紊乱以及遗传变异3。Kasai手术是目前改善胆道闭锁患儿胆汁淤积最常用的方法，但该手术最终无法阻止纤维化的进展4。目前胆道闭锁的治疗主要依赖肝移植，但受限于供肝来源的缺乏。深入研究胆道闭锁的发病机制是解决该疾病挑战的最直接途径。然而，目前对胆道闭锁发病机制的研究主要依赖于动物模型，因此选择合适的动物模型至关重要。
大多数胆道闭锁（BA）的组织病理学研究显示，胆管增生（BDP）、胆栓形成和门静脉纤维化是BA最重要的病理特征，同时存在不同程度的其他病理表现，如门管区炎性细胞浸润和肝细胞肿胀5,6。目前已有多种模拟BA的小鼠模型，例如长期喂食3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢吡啶（DDC）的小鼠模型，其表现为节段性胆管阻塞及累及肝外胆管的胆管周围炎7；以及通过腹腔注射四氯化碳建立的肝纤维化小鼠模型8。胆管结扎（BDL）模型的特点是出现黄疸和快速进展的门静脉纤维化9。喂食α-萘基异硫氰酸酯（ANIT）的小鼠模型则表现为局限于肝内胆管的胆管炎及肝细胞损伤10。通过延迟接种恒河猴轮病毒（RRV）可诱导产生持续黄疸的小鼠模型11。尽管目前已建立多种动物模型，尤其是小鼠模型，但每种模型均存在各自的局限性。这些模型仅能模拟BA的部分疾病特征，例如胆道闭锁过程中的急性炎症或肝纤维化，尚无一种模型能与BA的疾病进程和病理特征高度一致。
经典的胆道闭锁（BA）小鼠模型由RRV诱导产生，该模型与人类BA最为相似。然而，尽管RRV诱导的BA模型小鼠表现出与某些肝外胆道闭锁相似的临床症状和病理特征，但该模型缺乏肝纤维化表现，这极大地限制了对BA发病机制的深入研究以及新疗法的开发12。因此，本研究建立了一种新型的伴有慢性肝纤维化的BA小鼠模型。在出生当天接种RRV之前，通过腹腔注射抗Ly6G抗体，随后每间隔2天注射一次，共注射四次，每次剂量为5–10 µg。结果显示，小鼠的BA症状得到改善，生存时间延长，并进入慢性纤维化阶段。该模型不仅模拟了BA的急性期反应，还再现了肝脏损伤及进行性纤维化的过程。因此，这是一种更适用于BA机制研究的动物模型，可为未来BA治疗策略的开发提供理论依据。
Gr-1分子是一种髓系来源的细胞表面标志物，最初发现其在中性粒细胞中表达13。使用抗Ly6G抗体清除后，循环中性粒细胞数量可减少90%以上，并改变其他免疫细胞的活化反应。已有多个研究利用特异性清除抗体报道了Gr-1+细胞群体的功能，发现其对细胞因子及介导的免疫保护作用具有不同影响14。我们研究了Gr-1+细胞在RRV接种的BA小鼠模型中的功能。然而，由于尚未在人类中发现Gr-1分子的表达，因此在BA患者中研究了类似分子CD17715。我们的数据证实了Gr-1+细胞群体在疾病慢性纤维化阶段的重要作用，并提供了一个合适的动物模型，可用于探索潜在的BA治疗方法。

<table><tbody><tr><td>Balb/c 小鼠</td><td>广东赛杰生物技术有限公司</td><td>20221000112</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 Ly6G 抗体</td><td>Bio X Cell</td><td>克隆号 1A8</td><td>新罕布什尔州西黎巴嫩</td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠细胞角蛋白 19 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>克隆号 TROMA III</td><td>爱荷华州爱荷华城</td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 F4/80 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB5580</td><td>明尼苏达州明尼阿波利斯</td></tr><tr><td>RRV 毒株&amp;nbsp;</td><td>美国典型培养物保藏中心（ATCC）</td><td>MMU 18006</td><td>弗吉尼亚州马纳萨斯</td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Leica 光学显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI8+DFC7000T</td><td>德国韦茨拉尔</td></tr><tr><td>日立前处理自动化系统</td><td>日立</td><td>7600 临床分析仪</td><td>日本东京</td></tr><tr><td>异氟烷麻醉剂</td><td>RWD</td><td>R510-22-10</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明 123</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83702</td><td></td></tr><tr><td>天狼星红染料</td><td>Leagene</td><td>DC0041</td><td></td></tr><tr><td>石蜡切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>Solarbio</td><td>G8590</td><td></td></tr></tbody></table>

用于胆道闭锁研究的慢性肝纤维化小鼠模型

A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

胆道闭锁（BA）是一种导致阻塞性黄疸的致命性疾病，也是儿童肝移植最常见的指征。由于其病因复杂且发病机制尚不明确，目前仍缺乏有效的药物治疗手段。当前，由恒河猴轮状病毒（RRV）诱导的经典BA小鼠模型是研究BA发病机制最常用的动物模型。该模型表现为生长迟缓、皮肤和黏膜黄疸、陶土样大便以及深黄色尿液。组织病理学显示严重的肝脏炎症以及肝内和肝外胆管阻塞，与人类BA的症状相似。然而，该模型终末期小鼠的肝脏缺乏纤维化特征，无法完全模拟临床BA中肝纤维化的特性。本研究通过在每次间隔2天的情况下连续四次注射5-10 µg抗Ly6G抗体，建立了一种新型的慢性肝纤维化BA小鼠模型。结果显示，部分小鼠在一定时间后成功形成了具有典型纤维化的慢性BA，表明这些小鼠可作为研究病毒诱导BA肝纤维化机制的合适动物模型，并为未来BA治疗策略的开发提供了一个有效平台。

小鼠经腹腔注射5 &#181;出生后24小时内腹腔注射抗Ly6G抗体，随后注射20 &#181;L 的 RRV 4 小时后。然后，10 &#181;每3天注射一次抗Ly6G抗体，直至第12天（图 1A）。RRV组的中位生存时间为13天。相反，接受抗体治疗的小鼠大多仅出现轻度黄疸，且未观察到体重下降（图 1C）。约20%-30%的小鼠出现胆道闭锁综合征，表现为长期黄疸和低体重，但存活时间超过42天。经抗Ly6G抗体处理后，Gr-1+ 细胞减少15，小鼠进入慢性纤维化阶段，即慢性胆道闭锁。标本于第12天和第42天采集，天狼星红染色的组织切片显示肝纤维化逐渐加重。存活42天的慢性胆道闭锁小鼠用于详细分析。除体型较小外，其耳部、足部及尾部皮肤呈现明显黄疸（图中蓝色箭头所示）。 图 1E注射RRV后第6天，小鼠粪便颜色变浅，尿液颜色加深；至第12天，这种变化与对照组相比已显著不同，此时RRV组小鼠呈现白色粪便与深黄色尿液。至第42天，慢性BA小鼠的尿液与粪便也显示出明显的黄疸特征。图 1D,E）。将胆道闭锁（BA）小鼠的肝脏取出并与对照组进行比较。BA小鼠的肝脏体积较小（图 2B肉眼可见坏死性病变。图 2A,&#160;黑色三角），肝外也观察到一段胆道闭锁。图 2A白色星号）。
肝脏组织切片分析显示，低剂量抗Ly6G疗法降低了门静脉炎症。然而，在第42天，仍可在肝脏组织切片中观察到炎性细胞聚集。图 3A天狼星红染色显示，在注射RRV后第12天，门脉区胶原沉积略有增加。此外，抗Ly6g抗体治疗后未观察到胶原表达发生显著变化，但在第42天时，BA组织样本中的胶原表达显著增加。图 3B）。在偏振光显微镜下观察时，可见邻近肝组织中胶原纤维发生积聚。在第42天，胆道闭锁组织样本中可见大量胶原沉积，主要呈绿色。图 3C），且在存活42天但体重未增加的小鼠中，胶原沉积进一步加剧。随着门脉炎症的减轻，CK19+ 胆管细胞于第12天被观察到。然而，至第42天时，即使CK19表达有所增加，成熟的胆管也几乎无法检测到。+ 可见胆管细胞图 4A,&#160;红色箭头指示胆管上皮细胞）。对于患有慢性胆道闭锁的小鼠，其肝外胆管的连续解剖显示，肝外胆管发生阻塞并伴有巨噬细胞的炎性浸润。图 4B（黑色箭头指示巨噬细胞）。
与单独使用RRV相比，低剂量抗Ly6G抗体处理降低了RRV接种后第12天的肝酶水平所反映的肝损伤程度。慢性BA组小鼠肝脏中的丙氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶水平高于正常对照组。最显著的变化出现在胆红素水平上：与单独使用RRV相比，RRV + 抗Ly6G处理的小鼠在急性BA中表现出总胆红素、直接胆红素和间接胆红素水平的降低。而在慢性BA小鼠中，总胆红素、直接胆红素和间接胆红素水平则升高。图 5表明在胆道闭锁的慢性纤维化阶段肝功能显著降低。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig01.jpg" /> 
图 1抗Ly6G抗体治疗对轮状病毒（RRV）感染诱导的胆道闭锁小鼠模型的影响。 (A) 示意图：低剂量抗体诱导小鼠急性与慢性期胆道闭锁，箭头标示抗体与轮状病毒（RRV）的注射时间。B) 正常对照组（Cont.）、恒河猴轮状病毒（RRV）组及RRV+抗Ly6G抗体组小鼠的生存曲线。C各组小鼠的体重变化曲线。D) 各组小鼠在第12天的代表性图像及其粪便与尿液。E各组小鼠及其第42天粪便与尿液的典型图像。蓝色箭头指示其耳朵与尾巴呈黄色。本图经 Zhang 等人许可转载。15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig02.jpg" /> 
图 2抗Ly6G抗体治疗对轮状病毒（RRV）感染诱导的胆道闭锁小鼠模型肝脏的影响。 (A) 慢性胆道闭锁小鼠（右）与正常小鼠在第42天肝脏解剖结构及肝外胆管荧光血管造影对比。B) 慢性胆道闭锁小鼠与正常小鼠肝脏大小对比。黑色三角指示慢性胆道闭锁小鼠的肝脏坏死区域。白色星号指示肝外胆道闭锁。本图经Zhang等人许可转载。15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig03.jpg" /> 
图 3正常对照组（Cont.）、恒河猴轮状病毒（RRV）组及RRV + 抗Ly6G抗体组小鼠在第12天与第42天的肝脏组织切片。 (A) 经苏木精和伊红染色的肝组织切片图像&#38;E)。B) 天狼星红染色显示胶原沉积（PSR）。C) 使用偏振光显微镜（Pol. Light）对切片进行进一步观察。缩写：PV = 门静脉。比例尺 = 50。 &#181;m. 本图改编自 Zhang 等人。15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig04.jpg" /> 
图 4正常对照组（Cont.）、恒河猴轮状病毒（RRV）组及RRV + 抗Ly6G抗体组肝组织切片在第12天与第42天的免疫组织化学染色结果。 (A) 不同处理组中胆管上皮细胞标志物（CK19）的表达情况。B) 不同处理组均显示出巨噬细胞的炎性细胞浸润。缩写：PV = 门静脉。红色箭头指示胆管上皮细胞。黑色箭头指示巨噬细胞。比例尺 = 50 &#181;该图已根据 Zhang 等人 的研究进行了修改。15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65044/65044fig05.jpg" /> 
图 5不同处理组小鼠肝功能比较。 实验结束后采集小鼠血液，于医院检验科进行检测。每组包含三至五只小鼠。P &#60; 0.05, **P &#60; 0.01, ***P &#60; 0.001. 缩写：ALT = 丙氨酸氨基转移酶；AST = 天冬氨酸氨基转移酶；ALP = 碱性磷酸酶；TBIL = 总胆红素；DBIL = 直接胆红素；IBIL = 间接胆红素。本图经 Zhang 等人修改。15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65044/65044fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们建立了一种小鼠慢性肝纤维化模型，该模型为胆道闭锁（BA）相关的病毒诱导肝纤维化机制研究提供了合适的动物模型，同时也为未来BA的治疗提供了一个研究平台。

胆道闭锁（biliary atresia, BA）是一种以阻塞性黄疸为特征的致命性疾病，也是儿童肝移植最常见的适应证。由于……

我们已成功利用该方法构建出更符合胆道闭锁病理变化的小鼠模型。该技术可模拟急性与慢性胆道闭锁的症状，有助于未来对疾病机制的研究。使用抗体后，小鼠的生存时间延长，症状得到缓解，提示抗体对胆道闭锁具有治疗作用。按照文稿中的描述将新生小鼠分为不同组后，在恒河猴轮状病毒（rhesus rotavirus，RRV）注射前4小时，对每只小鼠进行腹腔注射5 µg抗Ly6G抗体，以耗竭Gr1阳性细胞。在出生后24小时内，向新生小鼠腹腔注射20 µL恒河猴轮状病毒或生理盐水。RRV注射后，向小鼠腹部给予20 µg抗Ly6G抗体。每天检查并记录所有小鼠的外观、体重和存活情况。进行腹腔注射时，用一只手的食指和拇指捏住幼鼠颈部皮肤，同时用无名指和小指轻轻抓住小鼠后肢，以暴露其腹部。将注射器针头向上倾斜提起，以与皮肤呈15度角的方向将针头插入小鼠右后肢大腿中部。将针头沿皮下路径移动至小鼠右侧肋缘时，将针头向下刺入腹腔，并在小鼠肝脏下方注入液体。注射后立即拔出针头。观察注射部位是否有出血或渗漏现象。在第12天将小鼠麻醉后，在显微镜下进行解剖。将一支1毫升的胰岛素注射器插入心脏左心室以采集血液。在室温下以400 ×g离心血液5分钟，并分离血清用于肝功能检测。使用剪刀和镊子从周围组织中分离小鼠的肝脏和脾脏。拍摄肝脏和胆管的一般外观照片。吸入麻醉后，用剪刀和棉签暴露肝脏、胆囊和肝外胆管。在体位显微镜下，使用1毫升胰岛素注射器向胆囊内注射5至10微升荧光染料罗丹明123，并拍摄图像。将新鲜的小鼠肝组织浸入10%福尔马林中固定24小时。待组织包埋于石蜡中后，使用石蜡切片机将石蜡块切成厚度为4 µm的切片，并将两张连续切片置于同一张载玻片上。然后将切片放入切片架中，用二甲苯脱蜡，并依次在无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和蒸馏水中各浸泡5分钟进行水化。用苏木精染液染色5分钟，再在1%盐酸和75%酒精中浸泡5秒。用清水冲洗切片后，用伊红染液染色1分钟。按照之前的方法制备用于染色的组织切片，并使用 Tris-EDTA 缓冲液进行抗原修复。将切片置于微波炉中，在 95 摄氏度下加热 10 分钟，然后取出并自然冷却至室温。为消除内源性过氧化物酶活性，将组织切片放入 3% 过氧化氢中处理 10 分钟，随后用 5% 山羊血清孵育切片以阻断非特异性结合。接着，向切片中加入一抗——大鼠抗小鼠细胞角蛋白19（Cytokeratin 19）或大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体，在4°C条件下孵育过夜。随后在室温下用相应的二抗孵育切片30分钟。使用3,3'-二氨基联苯胺（3,3′-diaminobenzidine）作为显色剂，在显微镜下观察显色反应。在40倍显微镜下观察切片，根据需要拍照并进行分析。组织切片制备完成后，用苏木精复染，于室温下每张切片加入50 µL Sirius Red染液，染色1小时。将载片在室温下自然干燥4小时，每张切片滴加一滴中性树胶，加盖盖玻片，注意避免产生气泡。将载玻片在室温下放置24小时，以固化中性树胶。使用偏振对比光显微镜观察胶原沉积的细节。选择清晰且合适的视野，并调节显微镜视野的亮度和白平衡。在40倍显微镜下获取图像并根据需要进行分析。RRV注射后，RRV组的中位生存时间为13天。大多数接受抗体治疗的小鼠出现轻度黄疸，且未观察到体重下降。BA 小鼠的肝脏出现坏死性病变以及肝外胆管闭锁节段。肝脏体积较对照组小。组织学分析显示，低剂量抗 Ly6G 治疗可减轻门静脉炎症。在第42天的肝组织切片中仍可观察到炎性细胞聚集。在第12天，门脉区胶原沉积略有增加。到第42天，胶原表达显著增加，在胆道闭锁组织中可见大量胶原沉积。第12天观察到CK19阳性细胞。第42天，CK19阳性细胞增多，但成熟的胆管较少。慢性BA小鼠的肝外胆管阻塞，并伴有巨噬细胞的炎性浸润。慢性BA组小鼠肝脏中的ALT和ALP水平高于正常对照组。总胆红素、直接胆红素和间接胆红素水平均升高，表明在BA的慢性纤维化阶段肝功能显著下降。注射时应小心操作，避免穿刺小鼠肝脏。注射后应观察小鼠状态约10秒，并清理伤口处的血液。

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