慢性肝纤维化小鼠模型用于研究胆道闭锁

我们已经成功地使用这种方法创建了一个更符合胆道闭锁病理变化的小鼠模型。该技术可以模拟急慢性胆道闭锁的症状，有助于未来的疾病机制研究。使用抗体后，小鼠存活时间延长，症状缓解，提示抗体对胆道闭锁的治疗作用。

如手稿中所述，将新生小鼠分成不同的组后，在恒河猴轮状病毒或RRV注射前四小时腹膜内注射5微克抗Ly6G抗体以消耗Gr1阳性细胞。出生后24小时内，腹膜内向新生小鼠注射20微升恒河猴轮状病毒或盐水。RRV注射后，将20微克抗Ly6G抗体注入小鼠腹部。

每天检查并记录所有小鼠的外观、体重和存活率。对于腹膜内注射，通过用一只手的食指和拇指捏颈部皮肤并用无名指和尾指轻轻握住小鼠的后腿来暴露幼鼠的腹部。向上倾斜提起注射器针头，并将针头与皮肤成15度角插入鼠标右后腿的中大腿。

在沿着皮下路径移动针头直到到达小鼠的右肋缘时，将针头向下引导到腹腔并将液体注射到小鼠肝脏下。注射后立即将针头拉出。观察注射部位有无出血或渗漏。

在第12天麻醉小鼠后，在显微镜下解剖。将一毫升胰岛素注射器插入心脏左心室以收集血液。在室温下以400g离心血液5分钟，然后分离血清进行肝功能测量。

用剪刀和镊子从周围组织中解剖小鼠肝脏和脾脏。拍摄肝脏和胆管的一般外观。吸入麻醉后，用剪刀和棉签暴露肝脏、胆囊和肝外胆管。

在姿势显微镜下，用一毫升胰岛素注射器将5至10微升荧光染料罗丹明123注入胆囊并拍照。将新鲜小鼠肝组织浸入10%福尔马林中24小时。将组织嵌入石蜡中后，使用石蜡切片机将石蜡块切成厚度为四微米的部分，并在同一载玻片上放置两个连续的切片。

然后将切片放入切片架中，用二甲苯脱蜡，依次在无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和蒸馏水中水合，各5分钟。用苏木精溶液染色切片五分钟，然后将它们浸泡在 1% 盐酸和 75% 酒精中五秒钟。用清水冲洗切片后，用伊红溶液染色一分钟。

如前所述，准备组织切片进行染色，并使用Tris-EDTA缓冲液进行抗原修复。在微波炉中以 95 摄氏度加热切片 10 分钟，然后取出并自然冷却至室温。为了去除内源性过氧化物酶，将组织切片放入3%过氧化氢中10分钟，并用5%山羊血清处理切片以阻断非特异性结合。

接下来，向切片中加入原代大鼠抗小鼠细胞角蛋白19或大鼠抗小鼠F4 / 80单克隆抗体，并在4摄氏度下孵育过夜。在室温下用适当的二抗孵育切片30分钟。使用3，3-伯二氨基联苯胺作为显色剂，在显微镜下观察显色反应。

在40倍显微镜下观察切片以获得图片并根据需要进行分析。一旦组织切片准备好并用苏木精复染，在室温下用50微升天狼星红染料溶液覆盖每个组织一小时。在室温下自然干燥载玻片四个小时，在每个载玻片上加入一滴中性口香糖，并使用盖玻片覆盖纸巾以避免气泡。

将载玻片在室温下放置 24 小时以固化中性胶。使用偏振对比光显微镜观察胶原蛋白沉积细节。选择清晰合适的视野，调整显微镜视野的亮度和白平衡。

获取图像并根据需要在40倍显微镜下进行分析。注射RRV后，RRV组的中位生存时间为13天。大多数用抗体治疗的小鼠出现轻度黄疸，没有观察到体重减轻。

BA小鼠肝脏显示坏死病变和胆管闭锁的肝外段。肝脏的大小小于对照组。组织学分析显示，低剂量抗Ly6G治疗可减少门静脉炎症。

在第42天，在肝组织切片中仍观察到炎症细胞积聚。在第12天，门静脉区域的胶原蛋白沉积略有增加。在第42天，胶原蛋白表达显着增加，并且在BA组织中观察到大量胶原蛋白沉积。

在第12天观察到CK19阳性细胞。在第42天，CK19阳性细胞增加，但成熟胆管很少。慢性BA小鼠的肝外胆管被阻断并具有微噬细胞的炎症浸润。

慢性BA组肝脏ALT和ALP水平高于正常对照组。总胆红素、直接胆红素和间接胆红素水平升高，提示BA慢性纤维化期肝功能明显降低。注射时应谨慎，不要刺穿小鼠肝脏。注射后，我们应该花大约10秒钟观察小鼠的状态并清除伤口上的血液。