用于胆道闭锁研究的慢性肝纤维化小鼠模型

我们已成功利用该方法构建出更符合胆道闭锁病理变化的小鼠模型。该技术可模拟急性与慢性胆道闭锁的症状，有助于未来对疾病机制的研究。使用抗体后，小鼠的生存时间延长，症状得到缓解，提示抗体对胆道闭锁具有治疗作用。

按照文稿中的描述将新生小鼠分为不同组后，在恒河猴轮状病毒（rhesus rotavirus，RRV）注射前4小时，对每只小鼠进行腹腔注射5 µg抗Ly6G抗体，以耗竭Gr1阳性细胞。在出生后24小时内，向新生小鼠腹腔注射20 µL恒河猴轮状病毒或生理盐水。RRV注射后，向小鼠腹部给予20 µg抗Ly6G抗体。

每天检查并记录所有小鼠的外观、体重和存活情况。进行腹腔注射时，用一只手的食指和拇指捏住幼鼠颈部皮肤，同时用无名指和小指轻轻抓住小鼠后肢，以暴露其腹部。将注射器针头向上倾斜提起，以与皮肤呈15度角的方向将针头插入小鼠右后肢大腿中部。

将针头沿皮下路径移动至小鼠右侧肋缘时，将针头向下刺入腹腔，并在小鼠肝脏下方注入液体。注射后立即拔出针头。观察注射部位是否有出血或渗漏现象。

在第12天将小鼠麻醉后，在显微镜下进行解剖。将一支1毫升的胰岛素注射器插入心脏左心室以采集血液。在室温下以400 ×g离心血液5分钟，并分离血清用于肝功能检测。

使用剪刀和镊子从周围组织中分离小鼠的肝脏和脾脏。拍摄肝脏和胆管的一般外观照片。吸入麻醉后，用剪刀和棉签暴露肝脏、胆囊和肝外胆管。

在体位显微镜下，使用1毫升胰岛素注射器向胆囊内注射5至10微升荧光染料罗丹明123，并拍摄图像。将新鲜的小鼠肝组织浸入10%福尔马林中固定24小时。待组织包埋于石蜡中后，使用石蜡切片机将石蜡块切成厚度为4 µm的切片，并将两张连续切片置于同一张载玻片上。

然后将切片放入切片架中，用二甲苯脱蜡，并依次在无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和蒸馏水中各浸泡5分钟进行水化。用苏木精染液染色5分钟，再在1%盐酸和75%酒精中浸泡5秒。用清水冲洗切片后，用伊红染液染色1分钟。

按照之前的方法制备用于染色的组织切片，并使用 Tris-EDTA 缓冲液进行抗原修复。将切片置于微波炉中，在 95 摄氏度下加热 10 分钟，然后取出并自然冷却至室温。为消除内源性过氧化物酶活性，将组织切片放入 3% 过氧化氢中处理 10 分钟，随后用 5% 山羊血清孵育切片以阻断非特异性结合。

接着，向切片中加入一抗——大鼠抗小鼠细胞角蛋白19（Cytokeratin 19）或大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体，在4°C条件下孵育过夜。随后在室温下用相应的二抗孵育切片30分钟。使用3,3'-二氨基联苯胺（3,3′-diaminobenzidine）作为显色剂，在显微镜下观察显色反应。

在40倍显微镜下观察切片，根据需要拍照并进行分析。组织切片制备完成后，用苏木精复染，于室温下每张切片加入50 µL Sirius Red染液，染色1小时。将载片在室温下自然干燥4小时，每张切片滴加一滴中性树胶，加盖盖玻片，注意避免产生气泡。

将载玻片在室温下放置24小时，以固化中性树胶。使用偏振对比光显微镜观察胶原沉积的细节。选择清晰且合适的视野，并调节显微镜视野的亮度和白平衡。

在40倍显微镜下获取图像并根据需要进行分析。RRV注射后，RRV组的中位生存时间为13天。大多数接受抗体治疗的小鼠出现轻度黄疸，且未观察到体重下降。

BA 小鼠的肝脏出现坏死性病变以及肝外胆管闭锁节段。肝脏体积较对照组小。组织学分析显示，低剂量抗 Ly6G 治疗可减轻门静脉炎症。

在第42天的肝组织切片中仍可观察到炎性细胞聚集。在第12天，门脉区胶原沉积略有增加。到第42天，胶原表达显著增加，在胆道闭锁组织中可见大量胶原沉积。

第12天观察到CK19阳性细胞。第42天，CK19阳性细胞增多，但成熟的胆管较少。慢性BA小鼠的肝外胆管阻塞，并伴有巨噬细胞的炎性浸润。

慢性BA组小鼠肝脏中的ALT和ALP水平高于正常对照组。总胆红素、直接胆红素和间接胆红素水平均升高，表明在BA的慢性纤维化阶段肝功能显著下降。注射时应小心操作，避免穿刺小鼠肝脏。注射后应观察小鼠状态约10秒，并清理伤口处的血液。