用于成像程序性死亡配体1表达的⁶⁸镓标记D-肽PET探针的开发

该方法使用镓-68标记的D型肽DPA。利用放射性示踪剂镓-68标记DPA，能够以非侵入性方式实时可视化全身的PDL-1表达。采用D型肽可使放射性示踪剂具有极强的抗蛋白水解降解能力，并显著延长其代谢半衰期。

特别是，该技术可用于评估各种疾病，前提是能够发现特异性靶点并开发出具有良好示踪动力学的放射性示踪剂。该技术还可通过使用其他放射性核素（如镥-177和锕-225）标记DPA，应用于PD-L1阳性肿瘤的治疗。本次实验操作将由我实验室的研究人员Wu Jiang进行演示。

为了对肽类放射性标记物 d-十二肽拮抗剂（DPA）进行标记，用移液器将 5 微升含有 DPA 的预配缓冲液加入一个 1.5 毫升带螺帽的聚丙烯容器中，再向容器中加入 400 微升 68 镓三氯化物。涡旋混合 5 秒钟。使用 pH 试纸测定混合液的 pH 值，并用 0.1 摩尔氢氧化钠将 pH 值调节至 4 至 4.5。

将溶液在室温下孵育5至10分钟。然后根据文中所述条件，将反应混合物进行放射性高效液相色谱分析，以测定放射性标记产率。为测试示踪剂在磷酸盐缓冲液（PBS）中的稳定性，取10微升醋酸钠溶液中的镓-68标记DPA，加入990微升PBS中。

将混合物在37摄氏度下孵育1小时、2小时和4小时，期间轻微振荡。在每个指定时间点收集200微升溶液，并通过放射性高效液相色谱法（radio HPLC）进行分析。为检测示踪剂在小鼠血清中的稳定性，将10微升醋酸钠溶液中的镓-68标记DPA加入90微升新鲜配制的小鼠血清中，将混合物在37摄氏度下孵育1小时、2小时和4小时，期间轻微振荡。

然后在每个指定时间点收集20微升溶液，并向所收集的等分试样中加入100微升乙腈-水混合液。在25摄氏度下，以5,000 ×g离心10分钟。使用放射性高效液相色谱法分析上清液。

将U-87 MG细胞在12孔板中培养至80%汇合度。随后吸除培养基，并用0.5毫升PBS洗涤细胞。将镓-68标记的DPA用新鲜培养基稀释至浓度为74千贝可勒尔/毫升。

然后向每个孔中加入 0.5 毫升稀释的镓-68标记的DPA缓冲液。将细胞在37摄氏度下与镓-68标记的DPA分别孵育10、30、40和120分钟。孵育结束后，用移液器吸去培养基，并用0.5毫升PBS洗涤细胞三次。

随后，每孔加入 300 微升 0.5 摩尔的氢氧化钠溶液以裂解细胞。30 秒后，将黏稠的细胞裂解液收集至 1.5 毫升离心管中。用 PBS 每孔 0.4 毫升洗涤两次，每次洗涤液均收集至上述 1.5 毫升离心管中。

启动自动γ计数器的内置计算机，并将试管放入内置支架中。将所有样品加载到传送器上后，按下启动按钮。结果由内部软件计算，读数记录每根试管经衰变校正后的每分钟计数（CPM）。

按照文中所述方案收集U-87 MG细胞，并将细胞吸入0.5毫升注射器中。接着取BALB/c Nude小鼠，将细胞以每只小鼠两个肿瘤的数量进行皮下注射。注射后监测肿瘤生长，直至肿瘤体积达到100至300立方毫米。

进行PET成像时，通过预先安装的尾静脉导管将示踪剂静脉注射。使用参考软件在主机上创建扫描工作流程，随后创建研究文件夹，并根据制造商指南设置采集协议。对每只小鼠以3D列表模式进行持续60分钟的动态扫描。

接下来，根据制造商的说明，定义一个直方图协议和一个重建协议。使用汉宁滤波器，以每像素0.5个周期的奈奎斯特截止频率，通过滤波反投影重建小鼠在25至30分钟以及55至60分钟期间的PET动态图像。为所有小鼠生成最大强度投影（MIP）图像。

通过尾静脉注射的方式，将镓-68标记的DPA给予荷U-87 MG肿瘤的BALB/c裸鼠。安乐死后，解剖动物胸壁并打开心脏。使用一支1毫升注射器抽取血液，并将血液从注射器中挤入直径为13毫米的放射免疫分析管（RIA管），用于γ计数器测量。

切除主要器官和肿瘤，并将其放入类似的放射免疫分析管中用于γ计数器检测。称量文中提及的所有主要器官。使用自动γ计数器测量所采集器官中的放射性，并对测量值进行衰变校正。

计算每克湿组织中注入剂量的百分比。镓-68标记的DPA显示出较高的放射化学产率和杂质。其在PBS和小鼠血清中均具有高度稳定性，在4小时孵育后未见镓-68分解或肽段水解。

通过流式细胞术检测发现，约60%的U-87 MG细胞程序性死亡配体一（PDL-1）呈阳性，免疫荧光染色也证实U-87 MG细胞中PDL-1表达强烈。U-87 MG细胞对镓-68标记的DPA表现出时间依赖性的摄取，而使用PDL-1抑制剂BMS-202作为阻断剂后，摄取显著降低。当以镓-68标记的DPA作为竞争剂时，BMS-202的估计结合亲和力为43.8纳摩尔每升。

全身PET显像显示，注射后30分钟和60分钟，肿瘤内有明显的镓-68标记DPA聚集。平行实验表明，注射后60分钟，阴性对照Bon-1肿瘤中镓-68标记DPA的聚集极少。此外，免疫组织化学染色显示，U-87 MG细胞呈现显著的PDL-1表达，而Bon-1肿瘤则无此表达。

苏木精和伊红染色显示两种肿瘤组织之间的细胞形态相似。离体生物分布研究表明，在大多数分析的器官中（包括心脏、肝脏、肺和肌肉），放射性物质和血液均迅速清除。肾脏中积累的放射性最高，而肿瘤在所有时间点均表现出第二高的示踪剂摄取量。

D-肽的结构不同，因此采用高效方法用镓-68标记DPA成为最关键的步骤。该技术为利用PET检测作为有效的放射性药物铺平了道路，可用于管理多种癌症，既可作为PET示踪剂，也可作为放射性诊断试剂。