Name: 通过冷冻STEM断层扫描原 位 可视化细胞器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习冷冻STEM断层扫描技术，用于在完整细胞中原位可视化细胞器，实现纳米级三维成像。该方法无需切片即可观察近天然状态的生物结构，为细胞生物学研究提供高分辨率工具。

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我们非常感谢 SerialEM 软件包的作者和维护者 David Mastronade 与 Günther Resch 提供的持续而坚定的支持。P.K. 的研究由奥地利科学基金（FWF）通过 Schrödinger 奖学金 J4449-B 资助。为实现开放获取，作者已对本投稿所产生的任何作者接受稿版本应用了 CC-BY 公共版权许可。M.E. 和 S.G.W. 感谢以色列科学基金会（项目编号 1696/18）以及欧盟 Horizon 2020 伙伴合作项目 ImpaCT（项目编号 857203）提供的资助。M.E. 感谢欧洲研究委员会（ERC）在 CryoSTEM 项目中提供的资助（项目编号 101055413）。M.E. 担任萨姆与阿亚拉·扎克斯讲席教授，并领导欧文与切尔纳·莫斯科维茨纳米与生物纳米成像中心。M.E. 的实验室受益于哈罗德·佩尔曼家族长期以来的慷慨支持。我们同时感谢欧盟提供的资助。然而，文中所表达的观点和意见仅为作者（们）的观点，不一定反映欧盟或欧洲研究委员会执行机构的意见。欧盟或资助机构均不对这些观点承担责任。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案旨在帮助生命科学领域的显微成像研究人员，获得细胞中常规透射电子显微镜断层成像难以触及区域的细胞器三维结构信息。相同的方案也可用于塑料切片的扫描透射电子显微镜（STEM）断层成像，且对曝光条件的要求更为宽松。本方案应被视为一个起点，而非不可更改的硬性规定。事实上，STEM 的优势在于其灵活性；操作该技术并不存在唯一正确的方式。
需要强调的是，STEM 本身仅指扫描探针，并不定义成像方式。对比度主要取决于探测器的配置。较为简单的方法采用具有轴对称结构的探测器，例如位于光轴中心的圆盘形探测器或环绕光轴的环形探测器。通常情况下，当入射照明直接到达探测器时，我们记录到的是明场（BF）图像，其中（电子散射的）样品呈现为暗色；相反，当探测器仅收集散射电子时，我们记录到的是暗场（DF）图像，其中致密的样品呈现为亮色。当具备合适的硬件条件时，SerialEM 可同时采集并记录这两种信号。此外还存在更为复杂的探测器配置，范围从多段式探测器到全像素化相机。例如，通过分析离轴探测器单元之间的差异，可实现相位衬度成像32,33。对每个像素采集完整的二维散射（衍射）图样，构成了所谓的 4D STEM 技术34，该技术能够从同一原始数据中重建出多种图像对比度。四维 STEM 可实现电子叠层成像（electron ptychography），从而提供另一种获取相位衬度的途径35。
我们重点关注了我们认为对细胞器、完整细胞或微米级厚细胞切片研究最有用的STEM成像模式。这具体涉及使用较小的照明会聚半角进行明场成像，并在探测器端采用相对较大的收集角。较小的会聚角可提供较大的景深，使得在整个倾斜系列过程中整个样品始终保持聚焦19。在实际操作中，配合性能良好的显微镜载物台，这种方法甚至可以消除采集过程中调焦的需要。代价是分辨率有所妥协，如本方案第3节所述。我们建议使用4k图像，探针尺寸约为2 nm，当像素间距为1 nm时，可实现4 µm的视场。然而，强烈建议读者根据实际情况进行优化尝试。第二个考虑因素来自探测器方面。当照明光斑未完全充满同轴明场探测器时，相位衬度被抑制，而散射（振幅）衬度占主导地位；这一条件被称为非相干明场衬度36。问题在于应以多大比例使光斑小于探测器面积，答案取决于样品本身。非常薄的样品在探测器被完全充满时（即收集角与照明角匹配）可获得最佳衬度，但较厚的样品会将全部强度散射掉，导致信号噪声大且衬度差。一个实用的经验法则是：样品越厚，明场探测器的外截止角应越大21。探测器的尺寸和位置当然是固定的，因此需通过调节相机长度来调整衍射光斑的大小，如第1节所述。如果探测器放大器设置使得在直射照明下信号填满动态范围但不饱和（1.12.3），则可逐步增加相机长度，直至获得合理的信号强度和衬度。同样，鼓励读者进行实验探索。可以说，其中的关键在于角度的调控艺术。
另一个在方案中未讨论的参数是显微镜的加速电压。照明电子与样品的相互作用在较低电压下会更强。在其他条件相同的情况下，我们预期较低电压下可获得更高的对比度。另一方面，样品内多重散射的出现限制了可用样品的厚度，因此较高的电压允许使用更厚的样品。然而，这些效应相对较为细微。迄今为止，我们在使用200 kV和300 kV加速电压下的经验结果相似。
关于STEM在分辨率方面能达到的水平，这再次取决于样品和探测器的配置。采用单颗粒分析方法，通过环形暗场STEM可将铁蛋白上的金属离子定位到几埃的精度37。最近，利用积分微分相位衬度（iDPC）STEM32以及叠层成像术（ptychography）35获得的图像，已实现对病毒和蛋白质样品的亚纳米级分辨率。然而，对于厚细胞样品中的独特结构，结合本文所述方法，实现如此高的分辨率并不现实。最佳分辨率等于探针直径，而探针直径与半收敛角相关。其他因素会降低分辨率，特别是为了获得大视场而采用较粗的像素采样、倾斜系列中的未对准，以及透射过程中探针束的扩散。所得图像与塑料切片断层成像结果相当吻合。例如，在本文所述的实验条件下，应能够清晰观察到微管的中空核心结构，但无法分辨单个原纤维。
总之，STEM 方法和硬件目前均处于发展阶段。我们可以预期，成像技术的创新也将影响断层扫描技术，从而将 STEM 推入以往其他技术无法触及的研究领域。我们预计，基于现代光学超分辨率方法的关联冷冻荧光成像技术与 STEM 的融合将尤其富有成果。细胞器的尺度（100–1,000 nm）正是这些新兴方法的理想研究目标。

细胞器的三维（3D）可视化是现代细胞生物学中的一项关键任务。由于涉及的尺度范围广泛，从分泌囊泡的几十纳米到细胞核的数微米，因此很难找到一种适用于所有情况的单一显微技术。尽管现代荧光显微镜在分辨率上能够覆盖大部分尺度范围，但仅有被标记的分子可见，而完整的细胞结构仍需依赖电子显微镜来观察。传统的化学固定、塑料包埋以及重金属染色方法具有很强的侵入性，其结果可能受样品制备细节的影响。另一方面，冷冻电镜（cryo-EM）则受限于必须将水性介质玻璃化；形成的冰晶会散射电子照明，导致比目标有机材料本身对比度更高的伪影。
过去十年中，为细胞研究开发或改进的电子显微镜成像技术不断涌现1。对于大尺寸样品，目前首选的方法是高压冷冻结合迭代聚焦离子束（FIB）切削，以及利用扫描电子显微镜对连续表面进行成像（即FIB-SEM）2。冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）适用于数微米大小的样品，其尺寸受限于软X射线在水中的特征吸收长度3,4,5。这一尺度涵盖了许多完整细胞类型，而X射线吸收对比度的定量特性还提供了浓度测量6或光谱分析7的可能性。当与子层析图平均技术结合时，基于相位衬度透射电子显微镜（TEM）的冷冻透射电子断层成像（cryo-ET）可为大分子或复合物提供最高分辨率8,9,10。然而，完整的细胞器极少具有足够规则的结构以实现整体平均。此外，传统宽场TEM模式由于样品中的非弹性散射（伴随能量损失）以及磁性物镜的色差，其适用的样品厚度仅限于几百纳米11,12。较大的能量展宽要求使用能量滤波器以消除由此产生的离焦雾状背景，但敏感样品在成像过程中仍会遭受辐射损伤，同时图像信号强度随样品厚度增加呈指数衰减。
另一种成像模式——扫描透射电子显微镜（STEM）——无需能量过滤，利用非弹性散射电子进行成像，尽管目前其分辨率低于透射电子显微镜断层成像图1）。事实上，并未形成真实的图像。相反，与扫描电镜类似，数据是逐点采集的，图像由计算机逐点拼接而成。放大倍数仅由扫描步长决定，无需改变透镜电流。当配置恰当时，冷冻扫描透射电子显微断层成像（CSTET）可适用的样品厚度范围可达1.5甚至2 µm，但其理想工作范围（即有用信号强度仍能保持为照明强度显著比例的厚度区间）约为600–900 nm。11,13足以观察到大部分细胞质，偶尔可见细胞核的边缘。实践中我们发现，通过标准的浸入冷冻液体方法进行玻璃化处理会施加&#160;比STEM成像对厚度的要求更为严格。本视频文章的目的是促进CSTET在科研实验室和显微镜平台中用于细胞和细胞器成像的应用。
第一个挑战在于，与冷冻透射电子显微镜断层成像（cryo-TEM tomography）相比，CSTET 中的显微镜操作尚未在生命科学应用中实现标准化。STEM 硬件很少（即使有也极为罕见）专门面向冷冻电镜市场设计。然而，随着新一代显微镜的出现，这一状况正在改变，许多现有设备也可进行改造升级。STEM 作为一种技术已在材料科学领域广泛应用并占据主导地位，该领域对低温和低剂量方法也日益产生兴趣14,15。材料科学文献中充斥着各种缩写术语，如 BF-STEM、ADF-STEM、HAADF-STEM、4D-STEM、DPC-STEM 等，进一步加剧了理解上的混乱。在此，我们提供一个推荐的起点，根据我们在中国台湾魏茨曼科学研究所的集体经验，该方法基于明场（BF）STEM 成像，可提供获得有用结果的最通用实验方案16。此方案远未涵盖所有可能性，甚至未深入探索其全部潜力，但可作为进一步优化的基础。尽管我们重点强调冷冻STEM，但本方案的大部分内容同样适用于室温下对塑料包埋切片进行的STEM断层成像。
STEM 的本质是使用聚焦的电子束探针（图1）对样品进行扫描，该电子束形成照明锥角，并逐像素记录透射模式下衍射（散射）平面上的信号，从而生成二维图像17,18。无定形样品（包括大多数细胞材料）在透射中会产生弥散的散射图案。最简单的实用 STEM 配置是放置一个圆形探测器来记录中心圆盘（即无样品时可直接透过的探针照明部分）。样品会将电子散射出该照明锥角范围，导致信号减弱，从而形成明场（BF）图像——样品在明亮背景上呈现为暗区。也可（或替代地）使用环形探测器来检测照明锥角以外区域的样品散射信号。当无样品时，探测器无信号；当有样品存在时，物体在暗场（DF）图像中表现为暗背景上的亮区。STEM 的命名方式（如明场、环形暗场[ADF]、高角环形暗场[HAADF]等）主要指探测器收集信号的角度范围。
照明的会聚角是扫描透射电子显微镜（STEM）适应细胞断层成像的一项关键调整。当首要目标是高分辨率时，会聚角应尽可能大。（这一点类似于共聚焦激光扫描显微镜；分辨率由探针直径决定，探针直径与波长除以数值孔径成正比。请注意，在电子显微镜中我们指的是半角或半会聚角。）而当优先考虑景深时，适当牺牲分辨率则具有显著优势，因为聚焦后的电子束在一段距离内近似保持平行，该距离等于两倍波长除以半角的平方。理想情况下，整个细胞体积均可保持在焦平面内19。例如，在300 keV条件下，电子的德布罗意波长为0.002 nm，因此1 mrad的会聚角可实现2 nm的分辨率和4微米的景深。在此条件下，断层成像甚至可以在数据采集过程中完全无需重新聚焦，仅需在采集开始时聚焦一次即可。传统的具备断层成像能力的STEM可达到7或8 mrad的半会聚角；因此理论上，分辨率可达约0.25 nm，但此时焦深仅为62 nm。这对于细胞成像而言显然过薄。配备三个聚光镜的更先进显微镜可在较宽范围内连续调节半会聚角；而采用较传统的双聚光镜结构时，会聚角则由聚光镜（C2）光阑离散固定。
对于坚固的塑料包埋样品，可以在每个倾斜角度记录焦平面序列，并将其合并以获得高分辨率图像20；但对于低温样品，辐射剂量的限制过于严格。最后，在权衡明场（BF）与暗场（DF）成像的优势时，对于较厚的样品，应考虑样品中多次弹性散射的影响。明场信号受多次散射的干扰较小，因此在厚样品中可呈现更高的分辨率16,21。
一个实用的经验法则是，设定的收集角度应为会聚角的数倍。样品越厚，所需的收集圆盘应越大。收集圆盘过小会导致信号强度低；而过大则会降低图像对比度，因为只有大角度散射的电子才会被收集。收集角度应根据具体样品进行优化。检测器角度需根据（衍射）相机长度独立校准，显微镜软件通常可方便地显示这些角度。在实际操作中，对于细胞样品的环形暗场扫描透射电子显微术（CSTET），建议以收集半角θ与照明半角α之比在2至5倍之间作为起始参考（图1）。
以下方案描述了使用广泛采用的SerialEM软件进行显微镜控制的STEM断层成像操作22,23。SerialEM不依赖于特定制造商，已被广泛应用于透射电子显微镜（TEM）断层成像中。大多数断层成像的设置操作均可直接沿用自TEM。SerialEM的策略是将扫描系统建模为一台相机，从而实现从TEM到STEM的简便过渡。但需注意的是，放大倍数和像素合并（binning）等参数完全是人为设定的。真正关键的参数包括以微米为单位的视场大小、视场中的像素数量以及曝光时间。像素间距（即采样）等于线性视场除以像素数量，而停留时间（dwell time）则等于像素数量除以曝光时间。
STEM 和 CSTET 的最低配置需要显微镜具备三个功能：扫描发生器、STEM 探测器以及断层扫描控制软件。本方案参考了 FEI/赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific，TFS）的命名体系，但所述概念具有通用性。TFS 的专有软件已在 JoVE 中针对透射电子显微镜（TEM）24 进行过描述，其 STEM 操作非常相似。
我们假设显微镜已由服务团队或经验丰富的工作人员预先校准，且可通过加载文件调用镜筒校准。微调称为直接校准，在TFS显微镜中可存储于所谓的FEG寄存器中。直接校准包括旋转中心、倾斜轴心、衍射校准以及对聚光镜像散的补偿。这些调整需迭代进行。请注意，TFS显微镜具有独立的纳米探针（nP）和微米探针（µP）模式；对于给定的聚光镜光阑，这两种模式分别在透射电子显微镜（TEM）中提供具有平行照明的较窄或较宽视野，以及在扫描透射电子显微镜（STEM）中产生不同程度会聚（高度聚焦）的电子束。其他制造商则采用不同的方案来覆盖会聚角的范围。
开始之前，视野 L，采样间距（像素宽度）l 的选择应根据具体研究的样本而定。例如，对于 l = 1 nm/像素，一幅4,000 × 4,000像素的图像将覆盖4 µm的视场2 应选择合适的参数。分辨率在最佳情况下为空间采样间隔的两倍，即2 nm，因此探针直径d应与此相匹配。探针角度的校准不在本实验方案的范围内，因此我们假设已有现成的表格或屏幕读数可供参考。探针直径近似等于电子波长除以半收敛角（以弧度为单位）：d = λ/θ。对于300 keV电子，波长λ为0.002 nm；对于200 keV电子，波长λ为0.0025 nm。因此，当θ为1 mrad时，对应的束斑直径分别为2 nm或2.5 nm。
本方案按照复杂程度逐步递进。首先进行STEM成像，该步骤依赖于显微镜制造商的软件；随后获取倾转系列图像，此过程我们使用SerialEM软件。许多读者无疑已熟悉SerialEM，因此后续更复杂的操作将更容易掌握。无需严格遵循此处所述的步骤顺序。与自动化相关的改进可直接应用于STEM，同样也适用于TEM。经验丰富的用户可能会逆向执行该方案，首先进行荧光图谱的相关定位，然后设置批量断层成像。有关SerialEM的更多详细信息，可参阅其详尽的文档和教程库，其中包括一篇关于自动化最新进展的近期JoVE文章25。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;SerialEM</td><td>科罗拉多大学</td><td>版本 4.0</td><td>SerialEM 是一个用于显微镜控制和数据采集的免费软件平台。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>具备扫描透射功能的透射电子显微镜</td><td></td><td></td><td>本实验方案基于使用多台赛默飞世尔科技公司显微镜的经验编写：Titan Krios、Talos Arctica 和 Tecnai T20-F。原则上，该方案也适用于其他厂商的设备。</td></tr></tbody></table>

细胞器的可视化 原位 通过冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术

Visualization of Organelles In Situ by Cryo-STEM Tomography

冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）依赖于对嵌入其天然水相环境中的生物或有机样品进行成像；其中水被快速冷冻形成非晶态的玻璃态冰，而不发生结晶。近年来，该方法已广泛用于在接近原子分辨率水平上解析生物大分子的结构。这一技术已扩展至利用断层扫描技术研究细胞器和细胞，但传统的宽场透射电子显微成像模式在样品厚度方面存在严重限制。为此，通常采用聚焦离子束铣削出薄片状样品（lamellae）；通过子断层图平均法从重建结果中获得高分辨率结构信息，但剩余薄层之外的三维关联信息则会丢失。这一厚度限制可通过扫描探针成像技术加以克服，类似于扫描电子显微镜或共聚焦激光扫描显微镜的工作原理。尽管在材料科学中，扫描透射电子显微镜（STEM）可在单张图像中实现原子级分辨率，但冷冻生物样品对电子辐照高度敏感，因此需要特殊考量。本实验方案介绍了一种基于STEM的冷冻断层成像技术的设置方法。文中描述了配备双聚光镜系统和三聚光镜系统的电子显微镜基本光路配置，并采用非商业软件SerialEM实现自动化操作。同时介绍了批量数据采集以及与先前获得的荧光图谱进行关联定位的增强功能。作为示例，我们展示了线粒体的三维重建结果，清晰分辨出其内膜与外膜、磷酸钙颗粒，以及周围的微管、肌动蛋白丝和核糖体。冷冻STEM断层成像技术在揭示细胞质中细胞器的空间分布方面具有显著优势，在某些情况下甚至可呈现贴壁培养细胞的核周区域结构。

在STEM中制备的完整网格拼图显示了含有目标细胞的区域（图4）。请注意，该图像为暗场成像，因此无细胞的孔洞呈暗色。细胞部分区域较亮，这是由于电子被散射至HAADF探测器所致。在最厚的区域（通常位于中心或靠近网格条处），对比度再次变暗，这是由于多重散射导致电子散射角度超出了探测器的接收范围。在实际操作中，这些区域对于断层成像而言过厚。
下一步涉及中等放大倍数的图像（图10）。这类图像通常被称为中倍拼接图或方格图，其中“方格”指的是网格划分而非图像形状。即使在最低倍的微探针STEM模式下，这些图像也以拼接方式获取。在导航窗口中点击相应项目，可将该图像加载至主窗口。在此区域内选择用于断层扫描成像的特定位置。使用预览模式在记录放大倍数下定位目标区域。需要注意的是，预览与记录模式之间可能存在横向位移，具体取决于扫描速度。在此区域可记录单个倾转系列。例如，线粒体通常可在预览和记录图像中被识别（图12）。
对于批量断层扫描，载物台将围绕载网移动，可能无法精确返回到相同位置。锚定图通过将预览图像与较低放大倍数的视图进行匹配，确保所需记录区域能够被可靠地重新识别，即使载物台发生了位移。PyEM23,24 提供了一种更快的替代方案，虽然目前尚未纳入标准安装，但强烈推荐使用。
在CLEM方法中，可利用荧光图谱来确定用于断层成像的目标区域。荧光图像需在外部获取，并必须与完整的载网拼接图进行配准。为便于识别，最好使载网的栅条和孔洞可见，因此可在导入前预先制备荧光图像与明场图像的合并图，例如使用GIMP（https://www.gimp.org）或ImageJ31软件完成（需注意ImageJ会反转垂直轴）。当荧光信号的动态范围较大时，可能难以在不发生饱和的情况下生成此类合并图像。此时，可分别导入两幅图像，然后按照所述方法进行配准（图13）。通过该方式，在Navigator窗口中的荧光图上选定某一点后执行“转至XY”操作，即可将透射电镜中所安装载网的载物台移动至对应位置。需注意，拼接图（或荧光图，若其本身也为拼接图）制作过程中的微小不一致会导致位置的轻微偏移；因此，为获得最佳精度，应将荧光图像专门针对方格图重新进行配准。通常可根据支持膜上的孔洞或与明场光学图像共有的特征，通过肉眼观察完成该配准过程。
倾转系列的重构结果生成一个三维体数据（图14）。本示例的像素尺寸为2.042 nm，对应的视场范围约为4 µm。由于磷酸钙沉积物（橙色箭头）的原子序数高于周围区域，因此特征明显。微管（红色箭头）可在整个视场中被追踪。线粒体的内膜和外膜（绿色箭头）也清晰可见。肌动蛋白可表现为束状结构或单根细丝。为了获得更接近各向同性的分辨率，可对重构结果进行去卷积处理。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig01.jpg" /> 
图1：透射电子显微镜（TEM）与扫描透射电子显微镜（STEM）的比较。 在透射电子显微镜（TEM）中，样品视场由近似平行的电子束照射，物镜在相机上形成放大的图像。对于冷冻电镜（cryo-TEM），物镜光阑被打开以允许散射的电子波（红色虚线）通过，这些散射波与未散射的电子波（绿色）在离焦条件下发生干涉，从而产生相位衬度。而扫描透射电子显微镜（STEM）则通过聚焦电子束在样品上逐点扫描，并以像素为单位收集散射电子。多个探测器可收集不同散射角度的电子。本图改编自30。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig02.jpg" /> 
图2：&#160;由于扫描速率过高导致左侧图像失真的示例。请注意由黄色箭头标记的失真区域，以及Quantifoil上变形的椭圆形孔洞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig03.jpg" /> 
图3：全网格拼接的拼接设置对话框。 选择X和Y方向的放大倍数和拼接图像数量，使总面积达到约2,000 µm，以获得覆盖大部分网格的图像地图。同时选择“移动载物台”而非“移动图像”，并选择“使用拼接图谱”而非“记录参数”。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig04.jpg" /> 
图4：STEM模式下采集的完整低倍GridMap图像。 在暗场图像中，破损区域呈现为完全黑色。深灰色区域可能过厚且玻璃化效果不佳。适合进行断层扫描的区域在此扫描图像中呈白色或浅灰色。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig05.jpg" /> 
图5：移至标记操作。 在低分辨率图中使用“添加点”功能标记一个可识别的物体（本图中标记了38个点）。注意低分辨率图（绿色圆圈）与中等分辨率图（橙色圆圈）之间的偏移。随后，使用标记工具对该物体进行标记（绿色十字，红色圆圈），并启动“移至标记”对话框。所选选项将以相同偏移量移动所有245倍放大的图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig06.jpg" /> 
图6：STEM倾转系列的倾转系列设置对话框。 采用剂量对称模式，从-60°到+60°，步长为2°。由于使用低汇聚角时景深较大，因此跳过自动聚焦。无需优化同心度，因为此前已完成该步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig07.jpg" /> 
图7：中等分辨率图谱的文件属性对话框。 保存为 MRC 堆栈文件，选择整数格式，并将附加信息保存在 .mdoc 元数据文件中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig08.jpg" /> 
图8：保存中等分辨率图谱的拼接设置对话框。 对于200目网格上的一个边长为90 µm的正方形区域，建议总面积至少为90 µm × 90 µm。选择“移动载物台”而非“移动图像”，并在低剂量模式下使用“视图参数”。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig09.jpg" /> 
图9：&#160;记录中等分辨率图谱。 在“项目”对话框中获取用于记录中等分辨率图谱的设置。选择“Mapping”（成像）、“Acquire and save image or montage”（采集并保存图像或拼图），并勾选“Make Navigator map”（生成导航图）。在“主任务之前或之后的任务”中，选择“Rough and Fine Eucentricity”（粗调和精调同心度）。若无需辅助，可选择“当出现错误时不显示消息框”和“结束时关闭镜筒阀门”。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig10.jpg" /> 
图10:&#160;中等分辨率图谱图像 中等分辨率图像（方形图），通过3 × 3拼接在STEM模式下采集。用于数据采集的两张中等分辨率锚定图以蓝色方框标出。比例尺 = 10 &#181;m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig11.jpg" /> 
图11：&#160;批量倾转系列数据。 在“采集项目”对话框中设置批量倾转系列数据的采集。对于倾转系列数据采集，选择“最终数据”并点击“采集倾转系列”。在“主任务前后任务”中，勾选“管理杜瓦瓶/真空”（在“设置”菜单中选择适当参数）、“对项目重新对齐”、“精细同心度”以及“操作前运行脚本”。在“常规选项”中，勾选“发生错误时无消息框”和“结束时关闭柱阀”（见5.14节）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig12.jpg" /> 
图12：线粒体STEM倾转系列在0°倾角下的图像。 橙色箭头指示磷酸钙沉积物（基质颗粒），绿色箭头指示嵴，红色箭头指示15 nm金标记物。比例尺 = 500 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig13.jpg" /> 
图13：配准的冷冻关联显微图谱。 （A）中等分辨率的STEM图（方形图，26 Å）已与（B）低分辨率STEM图、（C）明场通道冷冻荧光显微图和（D）GFP通道冷冻荧光显微图进行配准。九个配准点（标签4-21）显示在（E）导航图中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig13large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65052/65052fig14.jpg" /> 
图14：体渲染。 对SIRT样（30个循环）滤波后的断层图像在不同深度进行的体渲染，分别为（A）60 nm和（B）40 nm厚的切片。像素尺寸为2.048 nm，对应的视场约为4 µm。请注意，与图12相比密度呈反转状态，即高强度结构显示为亮色。橙色、白色、红色、绿色和浅蓝色箭头分别指示磷酸钙沉积物、核糖体、微管、线粒体内膜和外膜以及肌动蛋白丝。比例尺 = 500 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65052/65052fig14large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术提供了一种无需包埋、切片或其他侵入性制备步骤即可观察完整细胞中细胞器的方法。目前该技术获得的三维分辨率可达数纳米，视场范围为数微米，可观察样品厚度约为 1 µm。

冷冻电子显微技术（cryo-EM）依赖于对嵌入其天然水相环境中的生物或有机样品进行成像；水是……

透射电子显微镜断层成像技术广泛用于细胞成像，但在样本厚度方面存在很大局限性。聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB SEM）和软X射线断层成像可用于较大样本，但分辨率较低。扫描透射电子显微镜断层成像技术则完美填补了这一空白。STEM断层扫描技术能够以几纳米的分辨率观察微米级厚度的样品。结合低温制样技术，可实现对生物样品及其切片的三维观察。请回顾STEM光学系统的基本原理，以理解成像过程，并确保技术服务工程师已对STEM模式和Lomax STEM模式进行了良好校准，且校准步骤应与视频中所示一致。首先，加载柱对齐文件并打开柱值。如果使用侧入式冷冻样品杆，请打开冷冻屏蔽罩并以透射电子显微镜（TEM）模式开始。此时电子束应出现在屏幕上。如果光束未显示出来，请降低放大倍数。通过按下控制面板上的按钮，将显微镜调整至同心聚焦状态。将束斑大小设置为一个合适的值，以便直接观察荧光屏或使用内置相机进行观察。将显微镜设置为STEM模式，并确认聚焦使用的是聚光镜而非物镜。在控制面板上设置齐焦聚焦，并退出衍射模式以进行初始调整。确保电子束未被消隐，并降低放大倍数直至电子束出现在屏幕上。调节光束偏移至中心位置，并逐步增加放大倍数至70,000，同时保持光束位于中心。然后插入所需的聚光镜光阑，通常在微探针模式下使用50微米的光阑，并检查光阑的中心对准情况。在前后转动聚焦旋钮时，光斑应均匀地扩展和收缩，但位置保持不变，如同一个平面切割一个假想的垂直沙漏。如果光阑未居中，照明将发生侧向偏移，就像沙漏倾斜了一样。将光束聚焦，按下对齐选项卡中的强度列表聚焦，或返回到等中心聚焦。重新调整光束位置至中心，并调节旋转中心。现在，将焦距步进旋钮调至最小位置，或稍高一步，使光束脉冲轻微，并确保在焦距上下移动时保持静止。选择枢轴点，并通过 X 和 Y 调整将两点重合。调节聚光镜消像散器，使光束呈圆形。上下调节焦距以优化图像。在通过焦点时，图像不应出现向某一方向拉长的倾向。校正透镜后，逐步增加放大倍数至约240,000倍，同时使用束流偏移保持光斑居中，并重复调整旋转中心和枢轴点。返回衍射模式。此时，荧光屏上应呈现为一个均匀的光斑。相机长度现在有效地控制着到探测器的光学距离，类似于X射线晶体学中的设置。调整它，观察圆盘收缩和放大，就像屏幕位置向标本靠近或远离一样。此圆锥代表明场照明。要在高倍率下启用STEM模式，请从明场STEM探测器开始，调整衍射对中，使用所需的相机长度将电子束居中。打开屏幕上的明场标记，将相机长度调至330，升起屏幕并插入探测器。在显微镜软件中开始扫描。参照文稿中的描述，利用显微镜显示画面辅助调节亮度和对比度设置。重复调整数次。将显微镜返回至高倍率模式下的相对较低放大倍数，但不进入低倍率模式。插入荧光屏，并记录屏电流以供参考。与透射电子显微镜（TEM）相同，可以通过调节电子枪透镜和束斑尺寸设置来改变束流，数值增大对应束流减小。此时，保存一个场发射电子枪（FEG）参数设置，以便日后恢复至标准值。切换至LMTEM模式以观察样品。插入样品。将样品调整至等中心高度。有多种方法可以实现这一点。例如，使用载物台摆动器倾斜载网，同时沿 Z 轴方向调节样品高度，直至图像不再发生横向移动。或者，在观察屏幕上标记某些特征，然后将载物台倾斜至 10 到 30 度，此时该特征将发生横向移动。调整样品高度，使其回到原始位置。增加放大倍数或调整台倾斜度以进行微调，并将倾斜度归零。现在切换回STEM模式并插入STEM探测器。确保未勾选启用 LM 扫描。切换至最低的高倍放大模式。通过该方法调节聚光镜像散。当电子束位于样品的薄区时，聚焦于样品两侧投影阴影之间透射束发散的点。然后调节聚光镜调中，使中心圆斑呈正圆形。这需要一定的练习，尤其是对于冷冻样品而言。返回 50 微米光阑并更新 FEG 记录。切换至 LMSTEM 模式，继续扫描以寻找感兴趣的区域。如有必要，可在此时大致调整探测器的亮度和对比度设置。按下同心聚焦按钮，提高放大倍数，并在使用显微镜提供的聚焦旋钮扫描时精细调节焦点，同时检查金珠上的像散情况。到目前为止，所有操作均在纳米探针模式下进行。注意，插入较小的聚光镜光阑会减小半收敛角，这对较厚的样品是有利的。使用 TFS 仪器的另一种方法是切换至微探针模式，这会减小半收敛角。然后调节相机长度，使收集角为收敛角的三倍，即屏幕上明场探测器区域标记的范围约为电子束的三倍。使用方程估算记录时的电子剂量。通常，整个断层图像的电子剂量应控制在每平方埃100至150个电子之间。将样品台返回至整数位置，并通过调节光斑尺寸和/或电子枪透镜设置来调整束流强度，以达到所需的荧光屏电流。在STEM模式下拍摄的完整低倍网格图显示了含有目标细胞的区域。细胞部分呈现亮区，电子向HAADF探测器方向散射。在STEM模式下拍摄的中等分辨率图显示了两张中等分辨率的锚定图。干细胞倾斜系列的零度倾角实现了对线粒体内磷酸钙沉积物、嵴以及金 fiducial 标记的可视化。展示了 60 纳米和 40 纳米厚切片的体渲染图像。冷冻干细胞断层扫描技术（CSTET）在结构生物学与细胞生物学之间架起了桥梁，同时也为超分辨率荧光成像提供了结构背景。无需切片或薄片制备，我们便可在接近天然的状态下观察整个细胞的全貌。

visualization-of-organelles-in-situ-by-cryo-stem-tomography

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过冷冻STEM断层扫描原 位 可视化细胞器

本文展示了如何利用电子冷冻断层扫描技术（ECT）在接近天然的状态下研究细菌细胞的超微结构，分辨率可达“大分子”级别（约4...

细菌细胞的电子冷冻断层扫描技术

我们介绍了一种收集和处理完整线粒体冷冻电子断层成像图的方法。该技术可提供关于天然生物膜中大型膜蛋白复合物的结构、功能和组织的详细信息。...

通过电子冷冻断层扫描技术可视化线粒体中的ATP合酶二聚体

本方案描述了如何可视化蓝细菌中瞬时的DNA压缩过程。采用同步培养、荧光显微镜监测、快速冷冻以及高压冷冻电子断层扫描技术。本文介绍了这些方法的操作流程，并讨论了其未来的应用与发展方向。...

利用高压冷冻电镜断层扫描技术观察蓝细菌中的DNA压缩现象

本文介绍了一种用于冷冻软X射线断层成像（SXT）的实验方案，该方案描述了对完整冷冻保存的细胞进行超微结构成像所需的样品制备和数据采集步骤，成像分辨率达到25...

通过低温软X射线断层扫描对细胞进行三维制图描述

利用聚焦离子束铣削技术，从浸冻的生物样品中制备用于冷冻电子断层扫描的玻璃态原位薄片。...

使用双束扫描电子显微镜制备玻璃态生物样品薄片用于冷冻电子断层扫描

我们提出了一种用于大分子高分辨率结构研究的冷冻生物样品冷冻聚焦离子束微加工薄片制备方案 原位 使用冷冻电子断层扫描技术。本方案提供了制备高质量、高重复性薄片的指南，用于对细胞内大分子的结构进行表征 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）.

样品制备与冷冻聚焦离子束微加工 酿酒酵母 用于冷冻电子断层扫描

本实验方案的目的是引导细胞在冷冻电子显微镜用载网上特定区域进行黏附和生长。该目标通过以下步骤实现：首先涂覆抗污染层，然后按照用户指定的图案进行消融，接着在图案化区域沉积细胞外基质蛋白，最后接种细胞。...

微图案化透射电子显微镜载网以在全细胞冷冻电子断层成像工作流程中引导细胞定位

本实验方案描述了使用 Tomo5 进行高分辨率冷冻电子断层扫描远程数据采集，以及使用 emClarity 进行后续数据处理和子断层平均化的方法。以脱铁铁蛋白为例，详细展示了获得分辨率为 2.86 Å...

冷冻电子断层扫描远程数据采集与亚断层图像平均法

冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）能够以纳米级分辨率实现细胞超微结构的三维可视化，但手动分割仍耗时且复杂。我们提出了一种新颖的工作流程，该流程整合了先进的虚拟现实软件用于cryo-ET断层图的分割，并通过对哺乳动物细胞中线粒体的分割展示了其有效性。...

利用虚拟现实技术实现冷冻电子断层数据的沉浸式分割与分析

本视频方案演示了如何对病毒学样本进行扫描透射电子显微镜断层成像。为获得最佳结果，样本需通过高压冷冻及后续的冷冻置换方法进行制备。...

病毒学中的扫描透射电子显微镜断层成像：高压冷冻-冷冻置换样品的三维成像

学习冷冻STEM断层扫描技术，用于在完整细胞中原位可视化细胞器，实现纳米级三维成像。该方法无需切片即可观察近天然状态的生物结构，为细胞生物学研究提供高分辨率工具。

细胞器的可视化原位通过冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术

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细胞器的可视化 原位 通过冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术

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