废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的定量与全基因组表征

基于废水的流行病学目前正通过检测废水样本中的病毒RNA并识别潜在暴发，在全球范围内用于补充COVID-19防控策略。该技术可提供社区中COVID-19流行情况的全人群快照，包括无症状病例。空气采样也是该方案的重要补充。

临床诊断仍然是管理和控制疾病暴发及大流行的最准确方法。然而，该技术仍可作为其有效补充。该方法包含多个步骤和关键环节。

视觉演示至关重要，因为它可以帮助那些对分子生物学技术不太熟悉的实验室重复该操作流程。首先，收集一升24小时混合废水样品。将20 µL的孟加拉病毒（mengovirus）加入70 mL的样品中。

将样品在700G条件下离心10分钟后，使用截留分子量为10千道尔顿的离心超滤装置，通过离心浓缩所得上清液。将超滤装置反转，于700G离心40分钟，洗脱浓缩产物，并将所得浓缩物用于RNA提取。

采集空气样本时，先在空气采样器中放置一个无菌锥形收集器，然后开始采集。采样结束后，使用商用病毒RNA提取试剂盒或实验室自建方法，从锥形收集器的洗涤液（PBS）中提取RNA。在试剂准备室的洁净工作台内，为每个靶标（孟加拉病毒、SARS-CoV-2、N1和N2基因）配制反应主混合液。

将引物-探针混合液与酶通过倒置混匀五次或短暂涡旋混匀。保持微量离心管置于冷架上，将15 µL混合液分装至条状PCR管或置于冷却架上的96孔PCR板中。盖好板盖，并将其转移至核酸操作区域。

轻轻涡旋振荡提取的RNA样品5秒。取5 µL RNA加入反应体系中，总体积为25 µL，并开始进行RT-qPCR。在PCR板中，将每个样品16 µL加入板上的对应位置，再加入4 µL 5倍逆转录（RT）预混液。

然后开始PCR反应。接下来，为每对引物分别配制10微摩尔的稀释液以及相应的预混液。在新的PCR板中，向每份预混液中加入20微升预混液，然后加入5微升反转录样品。

盖上反应板后，开始PCR反应。PCR结束后，以1000 G离心反应板15至30秒。进行PCR纯化时，向每个孔中加入50微升基于磁珠的试剂，通过移液混匀，随后进行磁性分离。

从磁力架上取下反应板。每份沉淀物中加入15 µL的PCR级水重悬，并在室温下孵育2分钟。将反应板放回磁力架，静置2分钟使磁珠完全沉淀。

然后小心地将每个样品的上清液15微升移至新的PCR板中。接下来，进行文库制备：向每个样品中加入1.75微升DNA文库制备试剂盒中的反应缓冲液和0.75微升酶混合液。盖好板后短暂涡旋振荡，并在1000×g离心15至30秒。

在21摄氏度孵育五分钟，然后在65摄氏度孵育五分钟。向新的PCR板中每个样本加入三微升PCR级水。每个样本加入0.75微升已制备的样本和1.25微升用于测序文库构建的条形码。

然后加入5 µL T4 DNA连接酶预混液，用移液器充分混匀。将反应板在离心机中离心收集后，于21 °C孵育20分钟，再于65 °C孵育10分钟。将所有样品合并后，向混合物中加入192 µL基于磁珠的试剂，用于PCR产物纯化。

用移液器充分混匀，室温孵育10分钟。将离心管置于磁力架上，静置至上清液变澄清并形成磁珠沉淀。

移除上清液，并将离心管从磁力架上取下。加入700微升短片段缓冲液（SFB），通过移液吹打混匀。将离心管重新放回磁力架上，静置直至沉淀形成且液体澄清。

用移液器弃去上清液。向管中加入 35 µL 的 PCR 级水，通过移液混匀，并在室温下孵育 2 分钟。将管置于磁力架上，静置使磁珠完全沉淀，溶液变澄清。

用移液器将35微升上清液转移至新离心管中。接下来，按照文本手稿中的描述配制接头连接反应体系，并在室温下孵育10分钟。向连接反应体系中加入20微升基于磁珠的试剂以进行PCR纯化，并在室温下孵育10分钟。

将离心管置于磁力架上，等待磁珠沉淀形成，上清液变为无色。用移液器小心吸弃上清液。向离心管中加入125 µL SFB，混匀后再次置于磁力架上，使磁珠分离。

当液体变澄清后，弃去上清液，并重复加入SFB，操作如前所述。将离心管敞口置于磁力架上静置30秒。加入15 µL洗脱缓冲液，用移液器充分混匀。

短暂离心后，室温孵育五分钟，随后置于磁力架上两分钟。用移液器将15 µL上清液转移至新的低吸附管中，使用荧光法定量DNA试剂盒测定浓度。接下来，将流动池插入实时DNA和RNA测序仪中。

将设定为 200 微升的 1,000 微升移液器吸头插入引液口。旋转体积调节旋钮以增加体积，直至看到吸头内出现液体，然后丢弃该吸头。向引液口加入 800 微升引液混合液，避免产生气泡，并静置五分钟。

用移液器将200微升文库混合液加入启动端口。关闭盖端口和启动端口。在软件中启动测序实验，并选择开启碱基识别。该方法可检测并定量废水和空气样本中的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA。

废水样品在三个重复样本之间的标准偏差为1.91%至13.98%，基因拷贝数范围为每升3.05×10³至2.83×10⁸拷贝。空气样品的基因拷贝数范围为每升6.17×10³至5.48×10⁹拷贝，两个重复样本之间的标准偏差介于0.54%至10.95%之间。如本方案所述，对样品进行了测序，此处总结了三个测序样品结果的示例。在所有三个样品中，均检测到BA.5谱系。

x 被 Freyja 工具确定为最普遍的类型。废水样本的浓缩是一个关键步骤，因为病毒 RNA 在废水中浓度较低。因此，该步骤对于准确检测和定量至关重要。

通过在RT-qPCR实验方案中使用不同的引物，该方法可被调整用于检测和定量其他病原体。该技术已成功对废水和空气样本中的SARS-CoV-2进行了准确定量。可从不同地点的样本中检测并定量多种不同的病原体。