Name: 废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的定量和全基因组表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的定量检测与全基因组表征方法。该方案采用平铺扩增子长模板测序技术，为基于废水的流行病学研究提供重要支持。

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本工作获得了卡斯蒂利亚-莱昂地区政府和欧洲区域发展基金（FEDER）项目（项目编号：CLU 2017-09、UIC315 和 VA266P20）的经费支持。

本文所述所有方法此前已在其他地方发表，并对原始方法进行了少量修改。
1. 废水采集与样品预处理
注意：由于环境样本中SARS-CoV-2 RNA的浓度较低，因此实施浓缩步骤对于成功检测至关重要33,34,35。此处描述的是首个报道的在废水中检测SARS-CoV-2的方法36。
<ol>
	<li>废水样品的采集与浓缩
	<ol>
		<li>采集1 L的24小时混合废水样品。将样品储存在4 °C条件下，并在24小时内开始进行实验操作。</li>
		<li>通过轻轻摇动瓶子使样品均质化，取70 mL样品加入一个100 mL离心管中，或将其分装至两个50 mL离心管中。</li>
		<li>向每70 mL样品中加入20 µL的脑心肌炎病毒（mengovirus，3.2 x 103 拷贝/µL），作为浓缩过程的内参对照；或者，向每个50 mL离心管中加入10 µL的脑心肌炎病毒（3.2 x 103 拷贝/µL）。</li>
		<li>将样品混匀后，在4 °C条件下以700 x g离心10分钟，以去除大颗粒物质和生物体（沉淀物）。</li>
		<li>取上清液，使用截留分子量为10 KDa的超滤离心装置，在4 °C条件下以4,000 x g离心40分钟进行浓缩。通过将超滤装置倒置，并在700 x g条件下离心40分钟，洗脱浓缩液。</li>
		<li>测量所得浓缩液的体积。该体积会因样品中堵塞滤膜的固体物含量不同而变化。在本研究中，获得的浓缩液体积介于200–1,200 µL之间。</li>
		<li>使用商业试剂盒或实验室自建方法对所得浓缩液进行RNA提取。本研究中所用样品采用特定的商业病毒RNA提取试剂盒，洗脱体积为50 µL。</li>
		<li>使用荧光定量RNA检测试剂盒测定提取RNA的浓度。将提取的RNA分装成若干份，于-80 °C冷冻保存，待后续分析使用。 
		注意：每次RNA提取操作均应设置一个提取阴性对照（NCI），仅包含缓冲液，用于检测提取过程中可能发生的污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Coriolis紧凑型空气采样器采集空气样品
	<ol>
		<li>根据研究目标确定采样频率和采样地点，制定相应的采样策略。</li>
		<li>设置空气采样器的流速（本实验中为50 L/min，持续30分钟）。请注意，流速超过200 L/min可能会导致病毒RNA降解，因此建议使用低于200 L/min的流速。</li>
		<li>启动采样前，在空气采样器中放置无菌锥形收集管。采样结束后，向锥形管中加入5–15 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻涡旋或手动摇晃15秒使样品混匀。样品可在4 °C条件下保存最多24小时，或分装至冻存管中于-80 °C保存。</li>
		<li>可选择性地进行浓缩步骤。每次实验后应使用漂白剂对锥形管进行清洗和去污染处理。</li>
		<li>使用商业试剂盒或实验室自建方法提取RNA。本研究中所用样品采用特定的商业病毒RNA提取试剂盒，洗脱体积为50 µL。</li>
		<li>使用荧光定量RNA检测试剂盒测定提取RNA的浓度。将提取的RNA分装成若干份，于-80 °C冷冻保存，待后续分析使用。 
		​注意：每次RNA提取操作均应设置一个提取阴性对照（NCI），仅包含缓冲液，用于检测提取过程中可能发生的污染。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）对 SARS-CoV-2 RNA 进行定量
注意：以下方案依据美国疾病控制与预防中心（CDC）2019年新型冠状病毒（2019-nCoV）RT-PCR诊断试剂盒37制定。将引物/探针混合液分装成多份，以避免反复冻融。
<ol>
	<li>在试剂准备室的洁净罩内，按照 表1 为每个靶标（脑心肌炎病毒；SARS-CoV-2 [N1 和 N2 基因]）配制反应主混合液。通过倒置混匀引物/探针混合液和酶共五次。或者，短暂脉冲涡旋引物/探针混合液和酶共五次。 
	注意：配制和使用过程中应始终保持所有试剂处于低温状态。为尽量减少冻融循环次数，强烈建议将试剂分装后冷冻保存。</li>
	<li>离心（1,000 × g，15–30 秒）收集管壁液体至管底，并将离心管置于预冷的试管架或冰上。</li>
	<li>为每个靶标标记1.5 mL 微量离心管。向每管中加入所需量的各试剂（每反应体积 × 反应数，包括所需的对照）。通过反复吹打混匀，并短暂离心5秒以收集管底液体。</li>
	<li>将微量离心管置于预冷试管架中，并向条状PCR管或96孔板中每孔分装15 µL，操作时使用冷却架。盖好板盖，转移至核酸操作区（始终保持在冷却架中）。</li>
	<li>解冻一份提取的RNA样本，轻柔涡旋5秒。向每个含有预先配制主混合液的反应孔或管中加入5 µL RNA（另包括5 µL无模板对照[NTC]、提取阴性对照[NCI]和阳性对照[PC]）。根据需要频繁更换手套，避免交叉污染。</li>
	<li>盖好整个反应板或管，轻柔涡旋混匀。离心（1,000 × g，15–30 秒）反应板或PCR管。</li>
	<li>启动25 µL 逆转录定量PCR（RT-qPCR），循环条件如下：45 °C 反转录10分钟；95 °C 聚合酶激活10分钟；随后进行45个循环，每个循环包括95 °C 变性15秒，60 °C 退火/延伸45秒。</li>
	<li>按照Conte等人的方法38计算脑心肌炎病毒对照的回收效率： 
	<img alt="脑心肌炎病毒回收效率公式；基因组拷贝数计算公式；仅供科研使用" src="/files/ftp_upload/65053/65053eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式1"> × 100</li>
</ol>
3. 污水中的测序变异体及数据分析
注意：所述方案是由 Quick 等人建立的改良方案39,40。该方案采用两组引物，通过 PCR 铺路法（tiling）对 SARS-CoV-2 基因组进行扩增，分别为 ARTIC 引物和 VarSkip 引物。联合使用这两组引物可确保最佳的基因组覆盖度，并最大限度降低因新发突变导致某类引物失效的可能性。总体而言，该方案分为三个部分：逆转录（RT）与扩增子生成、测序文库构建，以及测序与数据分析。
<ol>
	<li>逆转录与扩增子生成
	<ol>
		<li>确保输入样本具有已知的qPCR循环阈值（Ct）值，以便用PCR级水进行正确稀释。Ct值在qPCR定量过程中获得。稀释方法如下：若Ct值为12–15，将样本稀释1:100；若Ct值为15–18，将样本稀释1:10；若Ct值为18–35，则不稀释样本。Ct值高于35的样本极可能无法有效扩增。</li>
		<li>在PCR板中，用移液器吸取 16 µL 将每个样本添加到其在板上的对应位置。 4 µL 逆转录（RT）主混合液（5x）。盖好反应板，按以下条件开始PCR反应： 25 °C 2 分钟， 55 °C 20 分钟 95°C 1 分钟。</li>
		<li>准备 10 µM 每组引物的稀释液（ARTIC pool A 和 pool B，以及 VarSkip pool A 和 pool B）。按照相同方法为每组引物（ARTIC set A 和 B，以及 VarSkip set A 和 B）配制混合反应液 表 2将得到四种预混液。</li>
		<li>在新的PCR板中，用移液器加入 20 µL 将主混合液加入到每个相应的孔中。添加 5 µL 将RT样品各取适量加入每份混合液中。 
		注意：每个样本将包含四种反应混合物——ARTIC pool A 和 B，以及 VarSkip pool A 和 B。</li>
		<li>用封板膜覆盖反应板，并按以下条件开始PCR反应：聚合酶激活在 98 °C 30秒；变性35个循环，温度为 98 °C 15 秒；退火/延伸在 65 °C 4 分钟。离心（1,000 x g （15-30 秒）震荡平板。合并 ARTIC 反应池，并单独合并 VarSkip 反应池。每个样本将具有两个 50 µL 扩增子反应。</li>
		<li>添加 50 µL 向每个孔中加入用于PCR纯化的磁珠试剂，并用移液器充分混匀。室温孵育5分钟。 
		注意：每次使用前，需充分振荡 PCR 纯化试剂以重新悬浮磁珠。</li>
		<li>将平板置于磁力分离架上，静置至磁珠形成沉淀且液体变澄清（约5分钟）。用移液器吸出并弃去上清液。保持PCR板始终置于磁力架上。</li>
		<li>将PCR板置于磁力架上，加入 200 µL 向每个样本中加入80%乙醇，注意不要触碰磁珠沉淀。去除乙醇。</li>
		<li>重复上一步操作。将板置于磁力架上，不盖盖子，静置30秒，使乙醇挥发。</li>
		<li>从磁力架上取下培养板并加入 15 µL 向每个样品中加入PCR级水。用移液器吹打重悬沉淀。室温孵育2分钟。</li>
		<li>将平板放回磁力架上，静置使磁珠完全沉淀（2 分钟）。小心吸取 15 µL 将每个样品的上清液转移至新的PCR板中。</li>
		<li>使用荧光法定量RNA试剂盒测定每个样品的浓度。取每个样品约50 ng用于后续实验。 12.5 µL 进入下一步。如有需要，用PCR级水稀释样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>文库构建
	<ol>
		<li>添加 1.75 µL 来自Illumina DNA文库制备试剂盒的反应缓冲液 0.75 µL 将酶混合液加入每个样本中。盖上酶标板，短暂涡旋振荡，然后离心（1,000 x g 15–30 秒）。于 21°C 5 分钟和 65 °C 5 分钟。</li>
		<li>在新培养板中，用移液器吸取 3 µL 每个样本加入适量PCR级水至新的PCR板中。添加 0.75 µL 制备好的样品 1.25 µL 用于测序文库构建的条形码，以及 5 µL T4 DNA连接酶预混液。用移液器充分混匀，短暂离心（1,000 × g 在离心机中离心15-30秒，然后孵育 21 °C 20分钟，且在 65 °C 10 分钟 
		注意：如果使用的样本少于25个，此步骤中所有试剂体积均需加倍。</li>
		<li>将所有样品混合在一起，通过添加 10 µL 将每个样品加入同一个低吸附管中。取 480 µL 下一步。</li>
		<li>添加 192 µL 加入基于磁珠的PCR纯化试剂至混合物中，用移液器充分混匀。室温孵育10分钟。</li>
		<li>将试管置于磁力架上，静置至溶液上清澄清并形成磁珠沉淀。移除上清液。将试管从磁力架上取下。</li>
		<li>添加 700 µL 加入短片段缓冲液（SFB），用移液器混匀。放回磁力架上，静置至沉淀形成且上清液变澄清（约5分钟）。用移液器吸出上清液并弃去。</li>
		<li>重复上一步操作。将离心管置于磁力架上，加入 100 µL 用移液管吸出80%乙醇，避免触碰磁珠。再次用移液管将乙醇完全移除，让磁珠干燥30秒。 
		注意：切勿让磁珠过度干燥。</li>
		<li>从磁力架上取下试管，加入 35 µL PCR级水。用移液器吹打混匀，室温孵育2分钟。将离心管置于磁力架上，静置使磁珠完全沉淀，溶液变澄清。用移液器吸出液体 35 µL 将上清液转移至新管中。</li>
		<li>测定混合文库的RNA浓度。用移液器吸取达到30–50 ng RNA量所需的体积，并用PCR级水补足至最终体积 30 µL.</li>
		<li>配制接头连接反应体系： 30 µL 文库混合物的 5 µL 接头混合液II 10 µL 连接反应缓冲液（5x）以及 5 µL T4 DNA连接酶。用移液器混匀后离心（1,000 x g 孵育10分钟，室温。</li>
		<li>添加 20 µL 用移液器将基于磁珠的PCR纯化试剂与混合液混匀。室温孵育10分钟。</li>
		<li>将试管置于磁力架上，等待磁珠完全沉降形成沉淀，上清液变为无色。小心吸取并弃去上清液。</li>
		<li>从磁力架上取下并加入 125 µL SFB。用移液器吹打混匀，然后放回磁力架上以分离磁珠。待液体澄清后，用移液器吸出并弃去上清液。</li>
		<li>重复上一步操作。将离心管敞口置于磁力架上30秒，使残留液体部分蒸发。</li>
		<li>从磁力架上取下试管，加入 15 µL 洗脱缓冲液。用移液器充分混匀，短暂离心（1,000 x g 孵育15-30秒。室温孵育5分钟。置于磁力架上2分钟。</li>
		<li>移液器 15 µL 将上清液转移至新的低吸附管中，即为最终文库。使用荧光法定量DNA试剂盒测定浓度。 
		注意：在下一步中， 12 µL 是必需的。如果浓度非常高且小于 12 µL 文库的量不足时，补足至 12 µL 用洗脱缓冲液试剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流动池加载与测序
	<ol>
		<li>将流动池（R9.4.1）插入实时DNA和RNA测序仪中。</li>
		<li>通过添加制备引物混合液 30 µL 将冲洗连接剂（FLT）加入冲洗缓冲液（FB）试剂管中。涡旋混匀后离心（1,000 × g） g 15–30 秒。</li>
		<li>打开引物端口盖。使用一个 1,000 µL 移液器，设定为 200 µL 将吸头插入引液口，旋转体积调节旋钮并增大体积，直至观察到吸头内出现液体，随后弃去吸头。 
		注意：仅转动轮子直至几圈 µL 可见吸头中有液体时即停止。吸取过多液体可能会损坏流式细胞仪的流动室。</li>
		<li>缓慢加入 800 µL 将引物混合液加入引物端口，注意避免产生气泡。静置5分钟。</li>
		<li>同时，准备上样所需的文库。混合 37.5 µL 测序缓冲液 25.5 µL 上样缓冲液，并 12 µL 文库的 
		注意：移液前需混匀上样缓冲液。该试剂中的磁珠沉降速度极快。</li>
		<li>打开端口盖。用移液器 200 µL 将引物混合液加入引物端口。 
		注意：当打开覆盖口并从引物端口加样时，会观察到样品口有小液滴析出。应缓慢移液，使样品口能够将液滴吸入而不会溢出。</li>
		<li>在上样制备好的文库之前，通过移液充分混匀。使用一个 100 µL 移液器设定为 75 µL将文库逐滴加入样本孔中。切勿触碰孔口，每滴液体需等待其完全被孔吸收后再加入下一滴，以避免液体溢出。</li>
		<li>关闭盖子端口和引物端口。打开软件并启动测序实验。选择碱基识别 开启对于包含96个多重样本的文库，通常需要10至12小时的测序时间即可获得足够的数据。 
		注意：通过软件可插入 .csv 格式的样本表。样本表需包含以下数据：flow_cell_id、position_id、sample_id、experiment_id、flow_cell_product_code 和 kit。需要提供测序芯片 ID（列在测序芯片侧面）以及所用试剂盒信息。对于建议的实验方案，应选择 LSK109 试剂盒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测序数据分析
	<ol>
		<li>将压缩的 fastq 读段插入 wf-artic 工作流程41分别使用两种不同的引物方案（ARTIC/V4.1 和 NEB-VarSkip/v1a）运行工作流程。每个样本将生成两个“.primertrimmed.rg.sorted.bam”文件。</li>
		<li>使用“samtools merge”命令将BAM文件合并为一个文件42将合并后的BAM文件输入Freyja工具，保留默认设置，以恢复相对谱系丰度43.</li>
		<li>创建 FASTA 文件，将合并后的 BAM 文件使用默认参数输入到 "samtools mpileup" 和 "ivar" 工具中44,45对于突变检测，将FASTA文件载入Nextclade工具中46,47.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者没有竞争性经济利益或其他利益冲突。

利用（逆转录-）定量聚合酶链式反应（(RT-)qPCR）方法进行微生物和病毒的检测与定量因其极高的灵敏度而得到广泛认可。然而，在分析环境样品时，这些技术面临诸多挑战。废水样品中含有大量抑制性物质，可能扭曲检测结果并产生误导性数据。为克服这些局限性并提高检测精度，研究人员设计并实施了一套复杂的实验流程。该流程通过整合科学文献中的多种方案，并针对qPCR方法固有的限制，特别在每个操作步骤中引入了一系列严格的质控措施。通过整合这些严谨的质量控制手段，本方案为基于qPCR的检测与定量技术在复杂环境样品中的应用提供了可靠的解决方案51,52。核酸提取阴性对照（NCI）和无模板对照（NTC）是评估RNA提取及逆转录-定量PCR（RT-qPCR）反应过程中是否存在污染的关键工具。此外，引入孟加拉病毒（mengovirus）控制RNA可有效评估样品间的变异程度，以及浓缩步骤的效率和复杂环境样品中抑制性物质的影响。在每一次RT-qPCR反应中，必须设置阳性对照，以确认扩增过程的有效性。严格监控实验流程的每一个步骤至关重要，包括样品的储存与...

2019年12月，一种由先前未知的冠状病毒SARS-CoV-2引起的新型疾病COVID-19出现1。由此引发的全球大流行对世界各地的临床和公共卫生实验室构成了重大挑战，因为需要对大量个体进行检测，以准确评估病毒在社区中的传播情况和流行程度。然而，在许多地区，及时且全面覆盖空间范围的必要检测水平在经济上难以实现2,3。目前基于个体临床诊断的监测系统在很大程度上依赖于症状严重程度和个体报告情况，同时也受到这些症状与人群中正在流行的其他疾病症状重叠程度的影响4,5,6,7,8,9,10。因此，大量无症状病例导致了对疾病负担的严重低估7,11。
由于这些挑战，基于废水的流行病学（WBE）被提出作为新冠肺炎监测的一种补充性监测策略。WBE 最早于2001年被描述12，最初用于追踪可卡因及其他非法药物13。该方法基于一个假设：对于任何在废水中稳定且由人类排泄的物质，均可计算其初始浓度8,12。WBE 已在多个国家成功实施，作为SARS-CoV-2监测的一种补充且高效的监测系统3,8,14,15,16。在水环境中检测人类病毒的大多数方法均遵循以下步骤：浓缩、核酸提取、选定的基因组片段（或多个片段）扩增，以及扩增后基因组片段的检测/定量3。
检测和定量SARS-CoV-2的另一个重要环境是空气样本。最初认为SARS-CoV-2主要通过感染者在说话、打喷嚏、咳嗽、唱歌或呼吸时产生的气溶胶中的呼吸道飞沫进行近距离人际传播17。然而，多项研究开始报告在空气样本中存在SARS-CoV-2 RNA，尤其是在医疗机构和其他封闭空间内18,19,20,21。当病毒浓度足够高时，在医院和其他封闭室内环境中采集的空气样本中已发现SARS-CoV-2具有活性的证据22,23,24。室外研究通常未发现SARS-CoV-2存在的证据，仅在人群密集的户外场所例外21,25,26,27,28,29。截至目前，SARS-CoV-2的空气传播已被确认为一种传播途径30,31。最近的一项综述研究指出了室外与室内的差异：在非人群密集区域，室外空气传播风险极低；而在通风不良的室内环境中，若存在较强的病毒源（即较多感染者），则可能存在较大传播风险。最近一项全面的综述研究强调了室外与室内环境中空气传播风险的显著差异，特别是在通风不良的人群密集区域。该研究表明，在室外环境中，由于有更大的空气体积可供病毒颗粒稀释和扩散，空气传播的风险极低32。这些发现对与COVID-19相关的公共卫生政策和指南具有重要意义。通过认识室内与室外环境之间传播风险的显著差异，决策者可以制定更有效的策略，以减缓病毒传播并保护公众健康。
针对不同环境样本中SARS-CoV-2的检测、定量和测序，存在多种方法和实验方案。本文旨在介绍一系列成熟可靠的实验流程组合，使具备不同能力水平的实验室均能对废水和空气样本中的病毒进行环境检测、定量分析和测序。

<table><tbody><tr><td>接头+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19</td><td>Oxford Nanopore</td><td>EXP-AMII001</td><td>测序</td></tr><tr><td>AllPrep PowerViral DNA/RNA 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28000-50</td><td>RNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A63880</td><td>PCR 纯化，NGS 纯化，PCR 产物纯化</td></tr><tr><td>ARTIC SARS-CoV-2 扩增子面板</td><td>IDT</td><td>10011442</td><td>SARS-CoV-2 基因组扩增</td></tr><tr><td>Blunt/TA连接酶预混液</td><td>NEB</td><td>M0367S</td><td>文库构建</td></tr><tr><td>CENTRICON PLUS&amp;shy;70 10KDA</td><td>Fisher Scientific</td><td>10296062</td><td>浓缩过滤器</td></tr><tr><td>CORIOLIS COMPACT 空气采样器</td><td>Bertin Technologies</td><td>083-DU001</td><td>空气采样器</td></tr><tr><td>杜兰&amp;nbsp;实验室瓶</td><td>默克</td><td>Z305200-10EA</td><td>采样瓶</td></tr><tr><td>流动池（R9.4.1）</td><td>Oxford Nanopore</td><td>FLO-MIN106D</td><td>测序</td></tr><tr><td>常规实验室耗材（离心管、qPCR 板等）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>连接测序试剂盒</td><td>Oxford Nanopore</td><td>SQK-LSK109</td><td>测序</td></tr><tr><td>LunaScript&amp;nbsp;RT SuperMix试剂盒</td><td>NEB</td><td>E3010</td><td>&amp;nbsp;cDNA合成</td></tr><tr><td>Mengovirus 提取对照试剂盒</td><td>生物分子&amp;eacute;rieux</td><td>KMG</td><td>浓度控制</td></tr><tr><td>Nalgene 通用长期储存冻存管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>5011-0012</td><td>样品储存</td></tr><tr><td>原生条形码扩展 1-12（无需 PCR）</td><td>Oxford Nanopore</td><td>EXP-NBD104</td><td>条形码技术</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II 末端修复/dA加尾模块</td><td>NEB</td><td>E7595</td><td>DNA修复</td></tr><tr><td>NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 引物混合物</td><td>NEB</td><td>E7658</td><td>SARS-CoV-2 基因组扩增</td></tr><tr><td>NEBNext&amp;nbsp;快速连接反应缓冲液</td><td>NEB</td><td>B6058S</td><td>测序&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>默克</td><td>P4474</td><td>收集缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS，1×），经无菌过滤</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J61196.AP</td><td>空气样品的洗脱</td></tr><tr><td>Q5&amp;nbsp;热启动高保真2X预混液</td><td>NEB</td><td>M0494S</td><td>热启动DNA聚合酶</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS 检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q32852</td><td>RNA定量</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 RUO qPCR 引物 &amp;amp; 探针试剂盒</td><td>IDT</td><td>10006713</td><td>引物-探针混合液与qPCR阳性对照</td></tr><tr><td>TaqPath 1-Step RT-qPCR 预混液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A15299</td><td>RT-qPCR试剂盒</td></tr></tbody></table>

废水和空气样本中sars-cov-2 rna的定量与全基因组表征

Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples

基于废水的流行病学已成为许多国家监测SARS-CoV-2及其他传染病的一种前景广阔且高效的监测系统。该过程通常包括废水浓缩、核酸提取、特定基因组片段的扩增，以及对扩增产物的检测与定量。该方法同样可用于检测和定量空气样本中的病原体，例如SARS-CoV-2。最初，人们认为SARS-CoV-2主要通过感染者在说话、打喷嚏、咳嗽、唱歌或呼吸时产生的飞沫，经由密切人际接触传播。然而，越来越多的研究报告了在医疗机构空气中存在SARS-CoV-2的RNA，证实了气溶胶传播是该病毒的一种可行传播途径。本研究整合了一系列成熟的实验方案，以促进从废水和空气样本中对病毒进行环境检测、定量及测序分析。

下表总结的结果 表3 展示使用本文所述方法检测和定量废水中及空气样本中SARS-CoV-2 RNA的示例。废水样本采集自西班牙和斯洛文尼亚的污水处理厂，若三个重复样本中至少有两个的Ct值低于40，则视为阳性；若Ct值变异小于5%，则认为定量结果有效。在西班牙和葡萄牙，采集了室内和室外空气样本，并采用相同判定标准。空气样本使用双重复而非三重复，因为本研究旨在检测SARS-CoV-2 RNA而非对其进行精确定量。此外，只有当所有使用的对照（如本方案所述）结果符合预期，且mengovirus RNA对照未出现显著偏差时，RT-qPCR运行才被视为有效。这些样本中mengovirus的回收效率介于13.7%至19.7%之间。通过将提取的RNA稀释10倍和100倍后比较RT-qPCR结果，并结合使用商用抑制检测试剂盒，评估了扩增抑制效应。每种抑制对照试剂盒的操作应严格按照制造商提供的说明进行。
废水样品在三个重复样本之间的标准偏差为1.91%至13.98%，基因拷贝数范围为3.05 × 103 至 2.83 × 108</su...

本方案旨在定量废水中和空气样本中的SARS-CoV-2 RNA，用于基于废水的流行病学研究，并评估室内和室外气溶胶中SARS-CoV-2的暴露风险。本方案还描述了一种用于SARS-CoV-2全基因组表征的分段扩增长模板测序方法。

废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的定量与全基因组表征

基于废水的流行病学监测已成为许多国家针对SARS-CoV-2及其他传染病的一种前景广阔且高效的监测系统。

基于废水的流行病学目前正通过检测废水样本中的病毒RNA并识别潜在暴发，在全球范围内用于补充COVID-19防控策略。该技术可提供社区中COVID-19流行情况的全人群快照，包括无症状病例。空气采样也是该方案的重要补充。临床诊断仍然是管理和控制疾病暴发及大流行的最准确方法。然而，该技术仍可作为其有效补充。该方法包含多个步骤和关键环节。视觉演示至关重要，因为它可以帮助那些对分子生物学技术不太熟悉的实验室重复该操作流程。首先，收集一升24小时混合废水样品。将20 µL的孟加拉病毒（mengovirus）加入70 mL的样品中。将样品在700G条件下离心10分钟后，使用截留分子量为10千道尔顿的离心超滤装置，通过离心浓缩所得上清液。将超滤装置反转，于700G离心40分钟，洗脱浓缩产物，并将所得浓缩物用于RNA提取。采集空气样本时，先在空气采样器中放置一个无菌锥形收集器，然后开始采集。采样结束后，使用商用病毒RNA提取试剂盒或实验室自建方法，从锥形收集器的洗涤液（PBS）中提取RNA。在试剂准备室的洁净工作台内，为每个靶标（孟加拉病毒、SARS-CoV-2、N1和N2基因）配制反应主混合液。将引物-探针混合液与酶通过倒置混匀五次或短暂涡旋混匀。保持微量离心管置于冷架上，将15 µL混合液分装至条状PCR管或置于冷却架上的96孔PCR板中。盖好板盖，并将其转移至核酸操作区域。轻轻涡旋振荡提取的RNA样品5秒。取5 µL RNA加入反应体系中，总体积为25 µL，并开始进行RT-qPCR。在PCR板中，将每个样品16 µL加入板上的对应位置，再加入4 µL 5倍逆转录（RT）预混液。然后开始PCR反应。接下来，为每对引物分别配制10微摩尔的稀释液以及相应的预混液。在新的PCR板中，向每份预混液中加入20微升预混液，然后加入5微升反转录样品。盖上反应板后，开始PCR反应。PCR结束后，以1000 G离心反应板15至30秒。进行PCR纯化时，向每个孔中加入50微升基于磁珠的试剂，通过移液混匀，随后进行磁性分离。从磁力架上取下反应板。每份沉淀物中加入15 µL的PCR级水重悬，并在室温下孵育2分钟。将反应板放回磁力架，静置2分钟使磁珠完全沉淀。然后小心地将每个样品的上清液15微升移至新的PCR板中。接下来，进行文库制备：向每个样品中加入1.75微升DNA文库制备试剂盒中的反应缓冲液和0.75微升酶混合液。盖好板后短暂涡旋振荡，并在1000×g离心15至30秒。在21摄氏度孵育五分钟，然后在65摄氏度孵育五分钟。向新的PCR板中每个样本加入三微升PCR级水。每个样本加入0.75微升已制备的样本和1.25微升用于测序文库构建的条形码。然后加入5 µL T4 DNA连接酶预混液，用移液器充分混匀。将反应板在离心机中离心收集后，于21 °C孵育20分钟，再于65 °C孵育10分钟。将所有样品合并后，向混合物中加入192 µL基于磁珠的试剂，用于PCR产物纯化。用移液器充分混匀，室温孵育10分钟。将离心管置于磁力架上，静置至上清液变澄清并形成磁珠沉淀。移除上清液，并将离心管从磁力架上取下。加入700微升短片段缓冲液（SFB），通过移液吹打混匀。将离心管重新放回磁力架上，静置直至沉淀形成且液体澄清。用移液器弃去上清液。向管中加入 35 µL 的 PCR 级水，通过移液混匀，并在室温下孵育 2 分钟。将管置于磁力架上，静置使磁珠完全沉淀，溶液变澄清。用移液器将35微升上清液转移至新离心管中。接下来，按照文本手稿中的描述配制接头连接反应体系，并在室温下孵育10分钟。向连接反应体系中加入20微升基于磁珠的试剂以进行PCR纯化，并在室温下孵育10分钟。将离心管置于磁力架上，等待磁珠沉淀形成，上清液变为无色。用移液器小心吸弃上清液。向离心管中加入125 µL SFB，混匀后再次置于磁力架上，使磁珠分离。当液体变澄清后，弃去上清液，并重复加入SFB，操作如前所述。将离心管敞口置于磁力架上静置30秒。加入15 µL洗脱缓冲液，用移液器充分混匀。短暂离心后，室温孵育五分钟，随后置于磁力架上两分钟。用移液器将15 µL上清液转移至新的低吸附管中，使用荧光法定量DNA试剂盒测定浓度。接下来，将流动池插入实时DNA和RNA测序仪中。将设定为 200 微升的 1,000 微升移液器吸头插入引液口。旋转体积调节旋钮以增加体积，直至看到吸头内出现液体，然后丢弃该吸头。向引液口加入 800 微升引液混合液，避免产生气泡，并静置五分钟。用移液器将200微升文库混合液加入启动端口。关闭盖端口和启动端口。在软件中启动测序实验，并选择开启碱基识别。该方法可检测并定量废水和空气样本中的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA。废水样品在三个重复样本之间的标准偏差为1.91%至13.98%，基因拷贝数范围为每升3.05×10³至2.83×10⁸拷贝。空气样品的基因拷贝数范围为每升6.17×10³至5.48×10⁹拷贝，两个重复样本之间的标准偏差介于0.54%至10.95%之间。如本方案所述，对样品进行了测序，此处总结了三个测序样品结果的示例。在所有三个样品中，均检测到BA.5谱系。x 被 Freyja 工具确定为最普遍的类型。废水样本的浓缩是一个关键步骤，因为病毒 RNA 在废水中浓度较低。因此，该步骤对于准确检测和定量至关重要。通过在RT-qPCR实验方案中使用不同的引物，该方法可被调整用于检测和定量其他病原体。该技术已成功对废水和空气样本中的SARS-CoV-2进行了准确定量。可从不同地点的样本中检测并定量多种不同的病原体。

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使用免疫RNA-荧光原位杂交技术可视化SARS-CoV-2

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该方案描述了一种利用开源自动化技术对唾液样本进行RT-qPCR分子检测的SARS-CoV-2诊断方法。这种可扩展的方法既可用于临床公共卫生监测，也可用于提升规模较小的高校实验室的检测能力。...

利用开源移液机器人实现高效的SARS-CoV-2定量逆转录PCR唾液诊断策略

从环境水和废水样品中浓缩病毒是一项具有挑战性的任务，主要用于病毒的鉴定与定量。尽管已有多种病毒浓缩方法被开发和验证，本文展示了超滤法和脱脂乳絮凝法在不同样品类型中对RNA病毒的有效性。...

利用脱脂牛奶絮凝与超滤法从环境水和废水样品中浓缩病毒颗粒

本文介绍了一种利用纳米孔技术对狂犬病病毒（RABV）基因组进行快速且经济高效的表征工作流程。该工作流程旨在支持基于基因组信息的本地化监测，提供有关流行RABV谱系及其在区域系统发育树中位置的信息，以指导狂犬病防控措施的制定。...

利用纳米孔技术进行狂犬病病毒快速全基因组测序

本文提供了一套完整的实验方案，用于标准化和实施通过逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术检测人源样本中SARS-CoV-2病毒的方法。该方法可在60分钟内完成，成本低廉，仅需使用价格较低的设备，可适用于任何实验室或基层检测场所。...

通过逆转录-环介导等温扩增法检测SARS-CoV-2病毒

我们提供了两种基于探针的自主研发一步法RT-qPCR试剂盒，用于检测常见呼吸道病毒。第一种检测方法针对SARS-CoV-2（N基因）、甲型流感病毒（H1N1和H3N2）以及乙型流感病毒。第二种检测方法针对SARS-CoV-2（N基因）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV，靶标为UpE和ORF1a）。这些检测方法可在任何专业实验室中成功实施。...

SARS-CoV-2、流感病毒A/B型和MERS-CoV多重实时RT-qPCR检测方法的建立

本文描述了对采样滤膜中大气生物颗粒物的两种互补分析方法：内毒素的提取与检测，以及DNA的提取与检测。...

空气采样滤膜中内毒素与DNA含量的分析

学习废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的定量检测与全基因组表征方法。该方案采用平铺扩增子长模板测序技术，为基于废水的流行病学研究提供重要支持。

废水和空气样本中SARS-CoV-2 RNA的定量与全基因组表征

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