利用离子阱质谱和多级碎裂分析对藏药化合物结构进行标准化鉴定
March 17th, 2023
在这里，我们描述了一种通用方案和设计，可用于鉴定藏药中复杂的天然产物制剂（基质）中的痕量和微量成分。
这种方法可以帮助研究人员分析藏药化合物的结构，尤其是树的成分。它可以为天然药物中化合物含量的定性研究提供见解。该技术的主要优点是在这种情况下获得的化合物结构的准确性高于数据库。
该技术可用于膀胱或尿液中代谢中间体的结构分析。首先，藏药Abelmoschus manihot的种子样品制备。准确称取一克AMS，并将其放入装有30毫升80%甲醇的锥形烧瓶中。
使用40千赫兹的超声波浴超声仪，在25摄氏度下对混合物进行30分钟的提取。然后，将样品以14， 000g离心五分钟。制备注射器和有机0.22微米微孔膜过滤器，并将上清液过滤到两毫升样品瓶中。
打开真空泵的开关后，打开氩气缸的主阀和分压阀，并将压力调节到大约0.3兆帕。然后，打开氮气阀。启动质谱或MS控制软件。
单击软件面板中的加热 ESI 源并设置 MS 参数，包括加热器温度、气体流速、正负模式的喷雾电压以及毛细管温度。单击"应用"按钮激活用于液相色谱或LC的离子源，分别使用0.1%甲酸在纯乙腈的水溶液中制备流动相A和B。在将它们分别连接到 A 和 B 流体通道之前，在超声浴超声仪中以 40 千赫兹脱气至少 15 分钟。
准备 1:9 体积的甲醇水溶液，然后手动将其填充到泵和注射器的清洁液瓶中。启动LC-MS控制软件后，单击直接控制以打开LC控制面板。在泵模块上以逆时针方向打开吹扫阀。
单击更多选项以打开泵设置，并将吹扫参数设置为每分钟 5 毫升，持续三分钟。单击清除以开始去除气泡。完成后，关闭吹扫阀。
然后，单击Prime注射器冲洗注射器三个周期，洗涤缓冲液循环冲洗环一个周期，外部洗涤针头洗涤针头一个周期。将样品瓶放入取样器中。单击"仪器设置"打开"方法编辑"窗口，然后单击"新建"创建新的LC-MS仪器方法。
为方法建立总运行时间并设置压力限制。方法编辑窗口中的总流速、流动梯度、样品温度、柱温和就绪温度增量。对于 MS 方法，请选择常规 MS 或 MSn 实验类型。
输入采集时间、极性、质量范围、分流值数和持续时间的值。单击"保存"将设置配置为仪器方法。单击序列设置以打开序列表，其中输入有关样品类型、文件、名称、路径、样品 ID、仪器方法、位置和进样体积的信息。
通过单击"保存"记录序列表，然后实施设置并启动MS采集。要将MS数据加载到数据处理软件中，请在资源管理器中双击原始文件。在基础峰色谱图BPI中，通过单击并拖动鼠标选择曲线或AUC下的最大面积。
相应的MS谱图将显示在同一窗口中。选择目标离子进行下一次MS/MS分析。重新打开方法编辑窗口，在MSn设置表中，将目标离子的m/z设置为父质量数列中的小数点后一位。
接下来，选择碰撞模式并输入碰撞能量或CE值。设置 MS/MS 扫描范围。单击"保存"以记录 MS 方法，并在序列表中输入新的文件名。
单击"开始"按钮以启动 MS/MS 采集。采集完成后，双击资源管理器中的原始文件，将MS / MS原始文件加载到数据处理软件中。鉴定光谱中最强的碎片离子，并在MSn方法列表中输入其m/z值。
在 MSn 设置表中，设置 MS3 参数，包括碰撞模式、CE 值和扫描范围。再次单击"保存"以记录 MS 方法，并在序列表中输入新的文件名。单击"开始"以启动 MS3 获取。
如前所述，双击资源管理器中的原始文件，将MS3原始文件加载到数据处理软件中，然后重复步骤获取MS4频谱。要分析数据，请双击原始文件以打开从MS到MSn的所有质谱图。 手动计算离子和相应碎片离子之间的m / z差异值。
然后，根据MS4结果手动绘制核心结构，并根据m / z差值使用官能团或分子链段导出原始结构。根据MSn中的每个分子结构手动绘制分子切割路径。模型碳水化合物纤维二糖的ESI-MS在阳性模式下在m / z 365处产生蛋白质化分子M H。
产物离子扫描或CID MS/MS在m / z 305处产生第二个碎片离子。此外，MS3和MS4分析依次在m/z 254和m/z 185处产生第三和第四碎片离子。MS/MS分析揭示了离子碎裂的顺序，即开环水解、CC裂解和脱水。
因此，发现这种方法适用于碳水化合物。使用LC Q-TOF MS对AMS进行的初步定性分析揭示了许多未知化合物的存在。m/z 617处M H离子的阴性MSn分析在m / z 571处产生了第二个碎片离子。
MS3分析该碎片离子在m/z 525处通过损失羟乙基作为甲醇对应于32道尔顿和羟基作为水而产生第三个碎片离子，即18道尔顿。MS4分析在m / z 344和273处产生了第四个碎片离子。手动鉴定核心结构揭示了化合物在m/z 617处的分子结构及其在MSn中的切割路径。
对另一种未知化合物的M H离子进行了产物离子扫描，揭示了其分子结构和裂解机理。真空泵打开后，等待至少五个小时，以确保实验条件下有足够的真空度。统计分析可用于整理具有相同或相似质荷比的片段。
随着质谱溶液的增加，该技术可以帮助研究人员在天然药物中获得新的化合物。
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概述
本文介绍了一种用于识别藏药配方中微量和次要成分的协议。它强调分析复合结构，特别是从树木成分中提取的成分。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 天然产品
- 植物化学
背景
- 藏药利用复杂的天然产品配方。
- 了解成分可以提高这些药物的功效。
- 准确分析化合物对质量控制至关重要。
- 本研究侧重于蠶豆樹种子。
研究目的
- 分析藏药中化合物的结构。
- 提供关于天然药物定性内容的见解。
- 提高化合物结构识别的准确性。
使用的方法
- 蠶豆樹种子的样品制备。
- 称取一克样品。
- 与30毫升80%甲醇混合。
- 利用先进的分析技术进行结构分析。
主要结果
- 该方法比现有数据库提供更高的准确性。
- 获得了化合物定性研究的见解。
- 在分析代谢中间产物方面的潜在应用。
- 在天然药物分析中表现出了有效性。
结论
- 该技术增强了对藏药化合物的理解。
- 它为分析复杂天然产品提供了可靠的方法。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上进行更广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Standardized ion trap mass spectrometry with multiple-stage fragmentation enables precise structural elucidation of unknown compounds in complex natural product matrices such as Tibetan medicines. This capability addresses a critical gap in early discovery and target validation by providing higher confidence in compound identification beyond database matching. The approach supports portfolio advancement by de-risking molecular characterization in natural product-based drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-confidence identification of unknown bioactive compounds in complex mixtures.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying compound structures not represented in spectral databases.
- Facilitates functional target validation through detailed fragmentation analysis.
- Improves predictive confidence for advancing natural product leads.
Screening & Assay Development
- Prepares structurally validated reference compounds for downstream screening workflows.
- Standardizes sample preparation and MS acquisition for reproducible assay development.
- Delivers quantitative mass spectrometric outputs for reliable compound comparison.
- Enables scalability and platform reuse across diverse natural product libraries.
Translational & Preclinical Research
- Aligns compound identification with translational biomarker discovery in natural product research.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical validation by resolving structural ambiguities.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for natural product-derived candidates.
- Provides mechanistic insight into metabolic intermediates relevant to disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This standardized MSn workflow integrates from early discovery through lead identification, enabling robust compound characterization prior to preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving unknown compound structures.
- Screening: Provides reproducible, quantitative MS outputs for assay readiness and compound triage.
- Analytics: Delivers detailed fragmentation spectra and m/z difference analysis for comparative studies.
- Translational Research: Connects compound identification to biomarker alignment and preclinical model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a universal, standardized protocol applicable across diverse natural product sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in compound identification.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of analytical workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency in natural product portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated leads.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry and manual data interpretation for MSn analysis.
- Demands access to advanced LC-MS instrumentation and data processing software.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and MS acquisition protocols.
- Adaptation may be needed for different compound classes or natural product matrices.
- Manual analysis steps may limit throughput and require specialized training.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Abelmoschus manihot Seeds (AMS) Sample Preparation
1:32
Mass Spectrometry (MS) Setting
2:12
Liquid Chromatography Prerun, Method Establishment, and MS Acquisition
4:07
Operating Multiple-Stage Mass Spectrometry
6:10
Manual MSn Data Analysis
6:47
Results: Multiple-Stage Fragmentation and Structural Analysis of Unknown AMS Compounds
8:37
Conclusion
