使用手动授粉、显微镜和 S 基因型分析测定柑橘中的自（内）相容性和相互（内）相容关系
2023年6月30日
该协议提供了一种快速确定柑橘品种中花粉相容性和不相容性的方法。
该技术可以有效地识别S基因型并准确识别柑橘的自身不相容性，为选择合适的传粉树提供必要的信息。这是一种在育种计划中选择合适的亲本树的省时、简单且可靠的技术。这种技术简单易行，第一次做实验需要耐心和细心。
S基因型鉴定和S特异性引物设计需要更多的关注和关注。演示该程序的将是我实验室的硕士研究生Yu Hu。通过将Majia pomelo，柑橘，花朵带到实验室开始花粉收集。
用镊子收集花药，并将它们放入含有滤纸的培养皿中。通过将含有花药的培养皿放入 28 摄氏度的烤箱中干燥花粉粒 24 小时。干燥后，将花粉保存在装有变色硅胶的Micro Centron密封拉链袋中。
关闭袋子并在袋子上贴上花粉品种的名称和储存日期。将300微升液体培养基倒入两毫升离心管的盖子中，并在授粉刷的帮助下均匀地撒上花粉。将花粉放入加湿的黑匣子中，在28摄氏度下孵育12小时。
孵育后，从1， 000微升移液器吸头上切下顶部1毫米尖端，并用少量培养液吸出花粉。将花粉放在显微镜载玻片的中心，并用盖玻片盖住。完成后，使用10X物镜用倒置显微镜观察标本。
对每个重复使用大致相同的花粉密度进行三个独立的重复。对于授粉，使用授粉刷将足够数量的活花粉散布到柱头表面，确保不会损坏雌蕊。用硫酸盐纸袋覆盖授粉的花朵，并使用回形针密封袋子来防止基因型不同的花粉授粉。
在标签上写下物种名称以及授粉的次数和时间。将标签挂在授粉花朵附近的树枝上。授粉后约三到四天取出授粉袋，并将授粉的花收集在拉链袋中。
立即从花朵上取下花瓣、容器和卵巢，并将融合成样式的柱头浸入装有新鲜制备的固定溶液的离心管中。在固定溶液中在四摄氏度下孵育柱头和样式过夜。第二天，丢弃固定剂溶液，然后在95%乙醇中洗涤柱头和造型两到三次。
然后，将70%乙醇溶液添加到样式中，确保样品完全浸入溶液中。这个阶段的样式可以在四摄氏度下储存一到两个月。对于苯胺蓝染色，用蒸馏水洗涤储存在70%乙醇中的样式样品三到四次。
将其浸入四摩尔氢氧化钠溶液中并密封，然后在65摄氏度的水浴中孵育60分钟。在此步骤中，样式的颜色从黄白色更改为橙红色。接下来，将风格浸泡在蒸馏水中。
30分钟后，丢弃蒸馏水，用蒸馏水清洗样式三到四次，或直到样式的颜色变黄。然后，加入苯胺蓝，直到样品浸没并在黑暗中孵育12小时。在荧光显微镜下观察花粉管的生长。
将幻灯片放在平坦的桌子上。使用手术刀沿纵轴将样式分成两半。将一半的样式放在载玻片上，并在载玻片表面加入两到三滴聚乙二醇。
然后，用盖玻片盖住它。完成后，将载玻片放在孔径上方的显微镜载物台上，并使用10X物镜进行可视化。使用 DAPI 过滤器并观察花粉管的生长。
观察每种授粉的五种风格。使用荧光显微镜定量了柑橘的花粉活力和发芽率。相容的花粉成功地在柱头表面发芽并产生正常的花粉管，该花粉管生长并最终导致卵巢受精。
相比之下，不相容的花粉管通过大约 2/3 的样式生长，然后停止生长。琼脂糖凝胶电泳检测使用S位点特异性引物扩增的DNA产物。它显示了DNA产物在500到1， 000个碱基对之间的扩增。
鉴定出相应的S基因型。采用该方法鉴定了不同柑橘类的21个S单倍型。授粉步骤至关重要。
只有成功的授粉才能保证随后对花粉管的观察。该技术用于分析自我不相容性状，并探索和识别自我不相容的女性决定因素。这种方法对于自不相容研究和育种计划很重要。
它还可以帮助农业社区为他们的果园选择传粉树。
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概述
本研究提出了一种快速方法，用于确定柑橘品种的花粉兼容性和不兼容性，特别关注S基因型的识别及其对育种计划的影响。该技术提供了一种简单可靠的方法，用于选择成功受精所需的兼容授粉树。
关键研究组成部分
研究领域
- 柑橘品种的花粉兼容性
- 自不兼容性特征
- 育种计划效率
背景
- 选择适合的授粉树的重要性
- S基因型识别在育种中的作用
- 自不兼容性研究在植物生物学中的重要性
使用的方法
- 用于观察花粉管生长的显微镜技术
- 柑橘品种（Citrus maxima）
- 琼脂糖凝胶电泳用于DNA扩增分析
主要结果
- 兼容花粉在花柱上的成功发芽
- 不兼容的花粉管显示生长减少
- 在不同柑橘品种中识别出21个S单倍型
结论
- 该技术为柑橘的自不兼容性提供了重要的见解。
- 帮助育种者为果园选择适当的授粉树种。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable identification of self- and inter-(in)compatibility in citrus via S-genotype analysis and pollen tube microscopy addresses a critical bottleneck in breeding and germplasm selection. This method enables rapid, reproducible determination of compatible parental lines, directly impacting early-stage target validation and portfolio triage in crop biotechnology. Its integration streamlines the selection of pollinizer trees, reducing time-to-decision for breeding and orchard establishment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of self-incompatibility mechanisms through S-genotype identification.
- Supports biological de-risking by clarifying compatibility relationships among candidate cultivars.
- Facilitates predictive confidence in parental selection for breeding pipelines.
Screening & Assay Development
- Standardizes pollen compatibility assays using quantitative pollen tube growth readouts.
- Improves reproducibility and comparability across independent pollination experiments.
- Prepares validated biological systems for downstream genetic and phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genotype-phenotype relationships for translational continuity in breeding programs.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate cultivars based on compatibility profiles.
- Provides mechanistic de-risking for selection of breeding parents and pollinizers.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits at the intersection of early discovery, lead identification, and pre-breeding workflows in crop R&D.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of self-incompatibility and clarifies S-locus-driven compatibility pathways.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible pollen tube growth metrics for compatibility assessment.
- Analytics: Provides PCR-based S-genotype outputs and microscopy-based phenotypic readouts for robust comparison.
- Translational Research: Ensures continuity from genotype identification to phenotypic validation in breeding pipelines.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized platform for compatibility testing across diverse citrus germplasm.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in compatibility group assignment and parental selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in compatibility testing workflows.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for breeding and orchard establishment, reducing biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cultivars and pollinizers for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PCR-based genotyping and fluorescence microscopy.
- Needs access to electrophoresis, imaging, and sample preparation infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of pollination and staining protocols.
- Adaptable to diverse citrus species but may require primer redesign for novel S haplotypes.
- Dependent on careful execution of manual pollination and sample handling steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:02
Pollen Collection
1:40
In Vitro Pollen Germination Test
2:27
Pollination
3:02
Sampling, Fixation, and Preservation
3:55
Aniline Blue Staining
4:46
Fluorescence Microscopy
5:26
Results: Determining Pollen Compatibility and Incompatibility in Citrus Cultivars
6:16
Conclusion
