使用手动授粉、显微镜和 S 基因型分析测定柑橘中的自（内）相容性和相互（内）相容关系

该技术可以有效地识别S基因型并准确识别柑橘的自身不相容性，为选择合适的传粉树提供必要的信息。这是一种在育种计划中选择合适的亲本树的省时、简单且可靠的技术。这种技术简单易行，第一次做实验需要耐心和细心。

S基因型鉴定和S特异性引物设计需要更多的关注和关注。演示该程序的将是我实验室的硕士研究生Yu Hu。通过将Majia pomelo，柑橘，花朵带到实验室开始花粉收集。

用镊子收集花药，并将它们放入含有滤纸的培养皿中。通过将含有花药的培养皿放入 28 摄氏度的烤箱中干燥花粉粒 24 小时。干燥后，将花粉保存在装有变色硅胶的Micro Centron密封拉链袋中。

关闭袋子并在袋子上贴上花粉品种的名称和储存日期。将300微升液体培养基倒入两毫升离心管的盖子中，并在授粉刷的帮助下均匀地撒上花粉。将花粉放入加湿的黑匣子中，在28摄氏度下孵育12小时。

孵育后，从1， 000微升移液器吸头上切下顶部1毫米尖端，并用少量培养液吸出花粉。将花粉放在显微镜载玻片的中心，并用盖玻片盖住。完成后，使用10X物镜用倒置显微镜观察标本。

对每个重复使用大致相同的花粉密度进行三个独立的重复。对于授粉，使用授粉刷将足够数量的活花粉散布到柱头表面，确保不会损坏雌蕊。用硫酸盐纸袋覆盖授粉的花朵，并使用回形针密封袋子来防止基因型不同的花粉授粉。

在标签上写下物种名称以及授粉的次数和时间。将标签挂在授粉花朵附近的树枝上。授粉后约三到四天取出授粉袋，并将授粉的花收集在拉链袋中。

立即从花朵上取下花瓣、容器和卵巢，并将融合成样式的柱头浸入装有新鲜制备的固定溶液的离心管中。在固定溶液中在四摄氏度下孵育柱头和样式过夜。第二天，丢弃固定剂溶液，然后在95%乙醇中洗涤柱头和造型两到三次。

然后，将70%乙醇溶液添加到样式中，确保样品完全浸入溶液中。这个阶段的样式可以在四摄氏度下储存一到两个月。对于苯胺蓝染色，用蒸馏水洗涤储存在70%乙醇中的样式样品三到四次。

将其浸入四摩尔氢氧化钠溶液中并密封，然后在65摄氏度的水浴中孵育60分钟。在此步骤中，样式的颜色从黄白色更改为橙红色。接下来，将风格浸泡在蒸馏水中。

30分钟后，丢弃蒸馏水，用蒸馏水清洗样式三到四次，或直到样式的颜色变黄。然后，加入苯胺蓝，直到样品浸没并在黑暗中孵育12小时。在荧光显微镜下观察花粉管的生长。

将幻灯片放在平坦的桌子上。使用手术刀沿纵轴将样式分成两半。将一半的样式放在载玻片上，并在载玻片表面加入两到三滴聚乙二醇。

然后，用盖玻片盖住它。完成后，将载玻片放在孔径上方的显微镜载物台上，并使用10X物镜进行可视化。使用 DAPI 过滤器并观察花粉管的生长。

观察每种授粉的五种风格。使用荧光显微镜定量了柑橘的花粉活力和发芽率。相容的花粉成功地在柱头表面发芽并产生正常的花粉管，该花粉管生长并最终导致卵巢受精。

相比之下，不相容的花粉管通过大约 2/3 的样式生长，然后停止生长。琼脂糖凝胶电泳检测使用S位点特异性引物扩增的DNA产物。它显示了DNA产物在500到1， 000个碱基对之间的扩增。

鉴定出相应的S基因型。采用该方法鉴定了不同柑橘类的21个S单倍型。授粉步骤至关重要。

只有成功的授粉才能保证随后对花粉管的观察。该技术用于分析自我不相容性状，并探索和识别自我不相容的女性决定因素。这种方法对于自不相容研究和育种计划很重要。

它还可以帮助农业社区为他们的果园选择传粉树。