分离来自癌细胞系的低内毒素含量细胞外囊泡

该协议提供了有关如何在从细胞培养上清液中分离细胞外囊泡以及如何正确评估它们期间避免内毒素污染的指南。该协议的主要优点是，每个与电动汽车有关的实验室都可以通过保持无菌程序和使用简单且广泛使用的设备来限制内毒素污染。每个第一次尝试这种技术的人都应该从低内毒素、非热原标记的新培养基、试剂和塑料器皿开始。

对于该方案，请使用无内毒素试剂、水、培养基、过滤的 PBS、超低内毒素 FBS 和超速离心管。首先，将先前培养的SW480和SW620细胞系中的上清液收集到适当标记的15毫升管中。通过在室温下以500×g离心上清液5分钟来除去细胞碎片。

在不干扰碎片的情况下，将上清液收集到新的标记管中，并在4摄氏度下以3，200×g离心12分钟。小心地将45毫升上清液转移到垂直放置的无菌50毫升管中，不要润湿管的边缘。用无菌透明薄膜包裹管盖，并将其垂直存放在零下80摄氏度，以便随后分离细胞外囊泡。

通过制备含有约90毫升上清液的0.22微米注射器过滤器，注射器和管开始分离。用上清液填充注射器，并将过滤器固定在针头适配器上。通过过滤器将上清液过滤到50毫升管中。

将七毫升滤液移液到准备好的超速离心管中，并在4摄氏度下以100， 000×g离心两小时。使用无菌巴斯德移液管丢弃上清液。使用长过滤移液器尖端将颗粒拉入超速离心管中。

通过加入七毫升过滤的无内毒素PBS冲洗细胞外囊泡。超速离心后，使用无菌巴斯德移液管弃去上清液，并将沉淀重悬于200微升无内毒素PBS中。将悬浮液转移到无菌的1.5毫升低蛋白结合试管中。

然后将10微升悬浮液转移到新的1.5毫升管中进行进一步分析。包裹管子的盖子，并将其存放在零下80摄氏度。现在，在新管中，使用过滤的PBS以1比1000的比例稀释一微升悬浮液，以进行纳米颗粒跟踪分析。

要进行印迹分析，首先将20 μg样品与上样缓冲液混合。将样品在 70 摄氏度下孵育 10 分钟。然后用SDS将20微克样品加载到10至14%聚丙烯酰胺凝胶的每个孔中，并在150伏电压下使用电泳缓冲液进行电泳45分钟。

接下来，将凝胶放入带有Towbin缓冲液的转印机中，并以25伏电压将蛋白质半干转印到聚偏二氟乙烯膜上一小时。用1%BSA在摇杆上孵育一小时来封闭膜。将BSA稀释的抗体（抗CD9或抗Alix）加入膜中，并在摇臂上以4摄氏度孵育过夜。

去除抗体后，用10毫升TBST洗涤膜三次，持续10分钟。现在加入山羊抗兔或抗小鼠二抗，并在室温下在摇杆上再次孵育一小时。丢弃抗体，并如前所述清洗膜。

将一毫升含有底物和鲁米诺的溶液以相等的比例倒在膜上。立即将膜置于成像系统中，并在屏幕上可视化蛋白质条带。在本研究中，蛋白质印迹分析证实了两种细胞外囊泡标志物CD9和Alix的存在。

从SW480和SW620分离的囊泡的平均大小和浓度相似。用不同剂量的脂多糖（LPS）刺激单核细胞，显示使白细胞介素10分泌的最低剂量LPS和单核细胞中的肿瘤坏死因子为每毫升50皮克。显色LAL测试表明，两种细胞系的细胞外囊泡的LPS污染约为每毫升50皮克。

要记住的最重要的事情是使用不含LPS或耗尽的试剂，并在程序的每一步进行常规LPS测量。防止内毒素污染比消除内毒素更容易。拟议的方案限制了由于内毒素污染EV而导致错误结果的可能性，并允许评估每个细胞的EV活性。

所提出的方案对于处理内毒素敏感细胞（如单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞）的研究人员很有用。