从小鼠胎儿骨骼肌制备用于细胞培养的三维脱细胞基质

据我们所知，本方案是首个从胎儿骨骼肌中制备脱细胞基质的方法，为研究在子宫内开始发育的肌病提供了新途径。该方案可生成发育阶段和组织特异性的指标，用于在受控环境中研究肌细胞行为及其与细胞外基质的相互作用。LAMA2-CMD 是一种先天性肌营养不良症，出生时即开始出现症状。

该模型有助于揭示其发病过程中的模式机制，并推动新的靶向治疗策略的开发。本实验方案可适用于不同的组织和疾病模型。根据基质和细胞类型的差异，可实现不同复杂程度的构建，体现出该系统的多功能性。

这是一个非常简单的实验方案。最具挑战性的部分是样本的采集和处理。但是，通过练习，技术技能可以很容易得到提高。

每次将一个安乐死后的胎鼠转移至含有冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。切除皮肤和四肢后，沿肋骨腹侧剪开，移除胸骨及下方器官。

将胎鼠背侧朝上放置，去除椎骨的颈椎部分。接着，切除背部的脂肪沉积物以及深层背部肌肉的结缔组织。然后，使用手术镊固定肋骨。

使用显微手术刀小心刮取，以将背部深层肌肉从周围组织中分离。将组织置于含 PBS 的 12 孔细胞培养板中，于 4 摄氏度保存以备后续使用。如需长期保存，可将组织置于空的微量离心管中，于 -80 摄氏度保存。

第一天，使用完整的背侧肌肌肉组织。向12孔板的每孔中加入3毫升含1%青霉素和链霉素的低渗缓冲液。将肌肉组织碎片加入每孔中，并在振荡条件下孵育过夜，共18小时。

第二天，用细尖移液器吸出缓冲液。随后用三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）对样本进行三次清洗，每次清洗时摇晃一小时。弃去 PBS 后，将样本置于三毫升 0.05% SDS 洗涤剂溶液中，摇晃孵育 24 小时。

第三天，使用细尖移液器去除 SDS 去垢剂，并用 3 毫升低渗洗涤缓冲液洗涤组织碎片三次，每次振荡 20 分钟。将孔板中的溶液更换为 2 毫升 DNase 溶液，于 37 摄氏度孵育组织碎片 3 小时，并持续振荡。去除 DNase 溶液后，用 3 毫升 PBS 洗涤组织碎片三次，每次振荡 20 分钟，最后一次洗涤过夜。

向接种了亚融合C2C12细胞的T-25培养瓶中加入500微升胰蛋白酶，用1毫升完全培养基重悬细胞。取10微升细胞悬液与10微升台盼蓝染料混合，加载至血细胞计数板，以计数细胞数量并评估细胞活力。在超净工作台内，将脱细胞基质（dECMs）置于含有含1%青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。

使用显微手术刀和镊子将基质分离成小块。将碎片转移至96孔板的孔中，每孔放置三到四块。向每孔加入200 µL预热的完全培养基，并在37°C、5% CO₂条件下孵育2小时。

弃去孔板中的培养基，每孔加入含有 50,000 个活 C2C12 细胞的 200 微升完全培养基。将孔板培养两天。将带有细胞的 dECM 转移至含有 400 微升完全培养基的 48 孔板中。

每两天小心吸除培养基，以防止基质脱落，并补充新鲜培养基，持续至第8天。进行分化时，将完全培养基更换为分化培养基，继续培养至第12天，共培养4天。肌肉组织在分离后立即呈微红色，经低渗缓冲液孵育后因细胞裂解而变为白色。

SDS 使肌肉组织变为透明。经过 DNase 处理后，获得了更小且透明的脱细胞细胞外基质（dECM）。DNA 定量结果显示，与天然组织相比，脱细胞细胞外基质中的 DNA 含量几乎减少了 100%。

脱细胞细胞外基质（dECM）与天然组织在层粘连蛋白 alpha 2 和层粘连蛋白的管状染色方面表现相似。对天然组织的 Western 印迹分析显示层粘连蛋白 alpha 2 亚基存在两条条带，而在 dECM 中检测到三条较小的条带。对于总层粘连蛋白，与天然组织相比，dECM 样品显示出蛋白质片段化现象。

纤连蛋白和胶原蛋白 I 存在于天然组织和脱细胞细胞外基质（dECMs）细胞间的间质中。两种样本中均存在类似的纤连蛋白条带，表明其不受脱细胞过程的影响。在 dECMs 中观察到的胶原蛋白 I 条带较少。

对于胶原蛋白IV，两个样本均显示出相似的管状染色。然而，脱细胞细胞外基质（dECM）条带的分子量较低。C2C12细胞在脱细胞细胞外基质中定植并增殖，融合形成多核肌管。

在分化培养基中孵育四天后，这些细胞表达了肌球蛋白重链蛋白。可见层粘连蛋白α2链、总层粘连蛋白以及纤连蛋白的细胞内和细胞周围染色。脱细胞胎儿小鼠骨骼支架可用于共培养系统中细胞的培养，使其更接近体内环境，从而有助于理解肌肉疾病。