Name: 网络药理学预测及代谢组学验证 凤仙花抗高脂血症的机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 探索网络药理学与代谢组学整合方法，用于分析凤仙花抗高脂血症的活性成分及作用靶点。该技术为天然药物研究提供新思路，可应用于其他中药疗效分析。

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本研究得到中医药养生康复产品开发与创新团队（2022C005）以及新业态跨界融合研究项目的资助 &#34;健康维护与康复+&#34;.

所有涉及动物操作的实验程序均按照成都中医药大学《实验动物护理与使用指南》进行，并经成都中医药大学机构伦理委员会批准（方案编号 2020-36）。本研究采用雄性 C57BL/6 小鼠（20 ± 2 g）。小鼠购自商业来源（见材料表）。
1. 基于网络药理学的预测
注意：网络药理学用于预测复方药物FP治疗高脂血症的活性成分及其关键靶点。
<ol>
	<li>活性成分与关键靶点的筛选
	<ol>
		<li>搜索关键词 &#34;叶下珠果实&#34; 在传统中医系统药理学数据库（TCMSP；&#160;http://tcmspw.com/tcmsp.php）以获取FP候选活性成分及其作用靶点的列表。 
		注意：通常仅将数据库中口服生物利用度（OB）≥30% 且类药性（DL）值≥0.18 的成分作为活性成分纳入。</li>
		<li>搜索关键词 &#34;高脂血症&#34; 在 GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM；https://omim.org/）和治疗靶点数据库（TTD；http://db.idrblab.net/ttd/）中，获取高脂血症的相关候选靶点。下载疾病靶点的电子表格，删除重复靶点，得到高脂血症靶点列表。</li>
		<li>将步骤 1.1.1 和 1.1.2 中的这些列表复制到一个新的电子表格中。使用 &#34;数据 - 识别重复项&#34; 使用工具栏中的功能获取交集目标。将交集目标列表导入 UniProtKB（http://www.uniprot.org/）以标准化基因和蛋白质名称。 
		注意：这些靶点与FP和高脂血症均相关。因此，将这些交集靶点预测为FP对抗高脂血症的作用靶点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建蛋白质-蛋白质相互作用网络
	<ol>
		<li>打开 STRING 数据库（https://string-db.org/）11.5。将 FP 抗高脂血症的交集靶点列表粘贴至 &#34;姓名列表&#34; 对话框。选择&#160;智人 在 &#34;生物体&#34; 并点击 搜索 &#62; 继续. 
		注意：人类和小鼠的基因具有高度相似性，因此后续实验验证采用小鼠进行。</li>
		<li>当结果可用时，勾选 隐藏网络中未连接的节点 在 &#34;高级设置&#34;. 设置 最高置信度（0.900） 在 &#34;最低必需相互作用评分&#34;，然后点击 更新 按钮。</li>
		<li>点击 输出 在标题栏中，下载蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的简短表格文本，格式为 PNG 和 TSV。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>药物-成分-疾病-靶点网络的构建
	<ol>
		<li>打开 Cytoscape 3.9.1（参见 材料表）。导入1.2.3步骤的TSV格式文件。通过控制面板中的样式栏优化网络节点的颜色、字体和边。</li>
		<li>使用 &#34;分析网络&#34; 用于网络拓扑分析。通过 Cytoscape 中的 CytoHubba 插件获取枢纽基因。构建药物-成分-靶点-疾病网络。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GO与KEGG富集分析
	<ol>
		<li>打开 DAVID 生物信息学资源（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）。点击&#160;开始分析 并将目标列表粘贴到左侧对话框中。选择 官方基因符号 在 &#34;选择标识符&#34;选择 Homo sapiens 在 &#34;选择物种&#34;. 蜱虫 基因列表 在 &#34;列表类型&#34;. 点击 提交列表.</li>
		<li>当结果可用时，点击 使用 DAVID 工具之一分析上述基因列表蜱虫 GOTERM_BP_DIRECT，GOTERM_CC_DIRECT，GOTERM_MF_DIRECT 在 &#34;基因本体&#34; 进行 GO 功能富集分析。选中 KEGG通路 在 &#34;通路&#34; 用于KEGG通路富集分析。</li>
		<li>点击 功能注释图表 以展示结果。 
		&#8203;注意：将富集分析的统计显著性阈值设定为 p &#60; 0.05.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验设计
<ol>
	<li>FP 水提物的制备 
	注意：FP 由成都中医药大学夏丽娜教授实验室进行处理8。
	<ol>
		<li>将 90 g 干燥的 FP 粉末加入洁净的 2 L 容量瓶中，用 1 L 纯水浸泡。在 4 °C 水浴中进行超声处理（功率：250 W，频率：35 kHz），助溶 30 分钟。使用双层、1 mm × 1 mm 的无菌医用纱布过滤溶液，获得提取液。重复上述操作三次，以确保 FP 完全溶解。</li>
		<li>采用旋转蒸发法进一步浓缩。设定转速为 50 rpm，温度为 60 °C，持续 4 小时。将水提物浓缩至 100 mL。</li>
		<li>将 FP 粗提物（0.9 g/mL）平均分为两份（每份 50 mL）。其中一份作为高剂量 FP 液体（0.9 g/mL）；向另一份中加入 50 mL 纯水，作为低剂量 FP 液体（0.45 g/mL）。使用高、低剂量 FP 水溶液进行给药。将液体储存于 -20 °C，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物准备
	<ol>
		<li>将 50 只雄性 C57BL/6 小鼠（体重 20 ± 2 g）饲养在通风良好、室温条件下，保持 12 小时光照-黑暗循环，并可自由摄食和饮用纯水。</li>
		<li>将小鼠随机分为两组：10 只小鼠喂食正常饮食，40 只小鼠喂食高脂饮食（见材料表），以诱导高脂血症。 
		注意：喂养 8 周后，对小鼠进行筛选，用于后续药物干预。</li>
		<li>第 8 周时，从小鼠眼眶采集约 200 µL 血液。在 4 °C 条件下以 5,733 × g 离心 10 分钟，获得血浆样本。使用市售检测试剂盒测定 TC 和 TG 水平（见材料表）。</li>
		<li>选择血脂水平最接近正常的 6 只小鼠作为无处理对照组（NC 组）。选择 24 只血脂水平显著升高的小鼠作为高脂饮食组，并随机分为四组：高脂饮食组（HFD 组）、低剂量 FP 组（FP_L 组）、高剂量 FP 组（FP_H 组）和阳性对照组（PC 组）。</li>
		<li>对 FP_L 组和 FP_H 组分别进行胃灌注给药，剂量分别为低剂量（4.5 g/kg）和高剂量（9 g/kg）的 FP；对 PC 组给予辛伐他汀片（5 mg/kg；见材料表）胃灌注；对 NC 组和 HFD 组每日一次给予等体积生理盐水胃灌注，持续 4 周。 
		注意：本研究使用 FP 和辛伐他汀的水溶液进行治疗。</li>
		<li>第 12 周时，使用 1% 戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后处死所有组别的小鼠。从小鼠眶静脉采集约 400 µL 血液样本。 
		注意：用镊子刺激小鼠脚趾和足底，若无反应，则表明麻醉充分。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 5,733 × g 离心血液 10 分钟，获得血浆样本，并使用市售检测试剂盒测定 TC、TG、LDL-C 和 HDL-C 水平（见材料表）。采集肝组织样本16，进行组织病理学分析。将剩余的血浆和肝脏样本用于代谢组学分析（步骤 3）。 
		注意：所有样本均储存于 -80 °C，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肝脏组织病理学检查
	<ol>
		<li>用 4% 多聚甲醛溶液固定新鲜肝组织，时间不少于 24 小时。将组织从固定液中取出，用手术刀修整目标组织。将组织及其对应标签放入脱水机中。</li>
		<li>梯度乙醇脱水：75% 酒精 4 小时，85% 酒精 2 小时，90% 酒精 2 小时，95% 酒精 1 小时，无水乙醇 1 小时，二甲苯 30 分钟。将组织包埋盒放入石蜡模具中，进行三次石蜡浸洗，每次 30 分钟16。</li>
		<li>将浸蜡后的组织放入组织包埋机（见材料表）。在石蜡凝固前，将组织从脱水机中取出，放入包埋盒中，并贴上对应标签。</li>
		<li>将蜡块置于 -20 °C 冷冻台上冷却，从包埋框中取出并修整蜡块。</li>
		<li>使用切片机将修整后的蜡块切成 3 µm 厚的切片（见材料表）。将切片漂浮于 40 °C 水中，捞片后置于 60 °C 烤箱中烘烤。待蜡和水分烘干后取出，室温保存。</li>
		<li>依次将切片置于二甲苯 I 10 分钟、二甲苯 II 10 分钟、二甲苯 III 10 分钟、无水乙醇 I 5 分钟、无水乙醇 II 5 分钟、75% 酒精 5 分钟，并用水冲洗16。</li>
		<li>用苏木精染色液染色 4 分钟，1% 盐酸酒精溶液（75% 酒精）分化，1% 氨水溶液返蓝，然后用水冲洗。</li>
		<li>用伊红染色液染色 2 分钟，然后用水冲洗。</li>
		<li>使用光学显微镜在 200 倍和 400 倍放大倍数下观察切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>液相色谱-质谱（LC-MS）分析
	<ol>
		<li>FP 成分鉴定 
		注意：分析采用超高效液相色谱-杂合四极杆-轨道阱高分辨质谱联用技术（UPLC-Q-Orbitrap HRMS，LC-MS；见材料表）。
		<ol>
			<li>准确称取 1 g 干燥的 FP 粉末，置于洁净的 50 mL 容量瓶中。</li>
			<li>向容量瓶中加入 25 mL 70% 甲醇，准确称重。在 4 °C 水浴中超声处理（功率：250 W，频率：35 kHz）30 分钟以助溶解。再次准确称重，精确测定溶解过程中的质量损失，并用 70% 甲醇补足损失量。 
			注意：不要通过体积测量，因为容量瓶刻度不够精确，尤其是在 4 °C 水浴后。</li>
			<li>充分振荡混匀，使用 0.22 µm 微孔滤膜过滤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>血浆样本制备
		<ol>
			<li>在 1.5 mL 离心管中，向 100 µL 血浆（步骤 2.2.7）中精确加入两倍体积（200 µL）的乙腈，并使用涡旋振荡器至少涡旋 30 秒。所有样本均按此程序操作。</li>
			<li>在 4 °C 条件下以 17,200 × g 离心所有样本 10 分钟。将离心后的上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。在氮气下吹干上清液。用 200 µL 提取溶剂（乙腈:水 = 4:1 [v/v]）重新溶解。</li>
			<li>将重悬溶液涡旋至少 30 秒，并在 4 °C 水浴中超声处理 10 分钟（功率：250 W，频率：35 kHz）。在 4 °C 条件下以 17,200 × g 离心 10 分钟。</li>
			<li>使用 0.22 µm 滤膜过滤上清液，4 °C 保存待分析。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>肝脏样本制备
		<ol>
			<li>将 90 mg 肝组织（步骤 2.2.7）在冰浴条件下用 1 mL 冷甲醇-水（1:1, v/v）匀浆 1 分钟，并在 4 °C 条件下以 21,500 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至 1.5 mL 离心管中。所有样本均按此程序操作。</li>
			<li>对沉淀物再次按相同程序提取一次，合并上清液至新的 1.5 mL 离心管中。在氮气下吹干上清液。用 300 µL 提取溶剂（甲醇:水 = 4:1 [v/v]）重新溶解。</li>
			<li>将重悬溶液涡旋至少 30 秒，并在 4 °C 水浴中超声处理 10 分钟（功率：250 W，频率：35 kHz）。在 4 °C 条件下以 17,200 × g 离心 15 分钟。</li>
			<li>使用 0.22 µm 滤膜过滤上清液，4 °C 保存待分析。 
			注意：混合质量控制（QC）样本通过从每个血浆和肝脏样本中各取 10 µL（每六个样本取一个）混合制备而成。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>LC-MS 分析参数 
		注意：流动相由 0.1% 甲酸（溶剂 A）和乙腈（溶剂 B）组成。将这些溶剂转移至洁净玻璃瓶中，并连接至 LC-MS 系统。
		<ol>
			<li>在 LC-MS 系统的&#34;进样文件&#34;中设置血浆样本的梯度程序如下：1% B（0–1.5 分钟），1%–60% B（1.5–13.0 分钟），60%–99% B（13.0–20.0 分钟），保持 99% B（20.0–25.0 分钟），99%–1% B（25.0–25.1 分钟），并保持 1% B 至 27 分钟。</li>
			<li>在 LC-MS 系统的&#34;进样文件&#34;中设置血浆样本的自动进样器条件如下：进样体积 2 µL，流速 0.3 mL/min，每次分析。</li>
			<li>在 LC-MS 系统的&#34;进样文件&#34;中设置肝脏样本的梯度程序如下：1% B（0–1 分钟），1%–53% B（1–15 分钟），53%–70% B（15–30 分钟），70%–90% B（30–32 分钟），90%–95% B（32–40 分钟），95%–1% B（40–42 分钟），并保持 1% B 至 45 分钟。</li>
			<li>在 LC-MS 系统的&#34;进样文件&#34;中设置肝脏样本的自动进样器条件如下：进样体积 5 µL，流速 0.3 mL/min，每次分析。</li>
			<li>在 LC-MS 系统的&#34;质谱调谐文件&#34;中设置血浆和肝脏样本的质谱检测条件。采用正离子和负离子两种电离模式进行质谱采集。 
			&#8203;注意：加热电喷雾电离参数如下：喷雾电压：正离子模式 3.5 kV，负离子模式 3.8 kV；鞘气流速：55 arb；辅助气流速：15 arb；探头加热温度：300 °C；毛细管温度：350 °C。</li>
			<li>将采集的原始数据导入 Compound Discoverer 软件，并根据制造商说明设置方法模板（见材料表）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 代谢组学验证
注意：将血浆和肝脏代谢物的代谢组学分析数据导入Compound Discoverer软件，采用分子特征提取算法进行代谢特征提取。&#160;参数设置如下：质量偏差为5 × 10⁻⁶；质量范围为100–1,500；信噪比（SNR）阈值为3；保留时间偏差为0.05。通过QC样本峰面积的相对标准偏差（RSD）评估代谢组学数据的稳定性和重复性。
<ol>
	<li>使用 SIMCA-P 软件（参见材料表）对从 LC-MS 结果中获得的积分值进行多变量统计分析。对均值中心化数据采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行样本类别建模。</li>
	<li>OPLS-DA 分析后，筛选变量投影重要性（VIP）值&#62;1 且 Student t 检验 p 值&#60;0.05 的代谢物，作为潜在的差异代谢物。</li>
	<li>通过公共数据库资源鉴定发生改变的代谢物及相关代谢通路，包括人类代谢组数据库（HMDB；http://www.hmdb.ca/）、京都基因与基因组百科全书（KEGG；https://www.kegg.jp/）以及 MetaboAnalyst5.0（https://www.metaboanalyst.ca/）。</li>
	<li>利用 MetaboAnalyst5.0 及“Wu Kong”平台（https://www.omicsolution.com/wkomics/main/）可视化分析结果。</li>
</ol>
4. 分子对接
<ol>
	<li>分别从 TCMSP 数据库下载所选方剂成分的 3D 结构。在“Chemical name”搜索框中输入成分名称，并下载相应的 mol2 格式 3D 结构文件。</li>
	<li>从 AlphaFold 蛋白质结构数据库（Alphafold DB；&#160;https://alphafold.ebi.ac.uk/）下载关键靶点的晶体结构。在搜索框中输入靶点名称，并下载相应的 pdb 格式晶体结构文件。</li>
	<li>将成分和靶点结构文件导入 AutoDockTools 软件。点击 Edit &#62; Delete Water 删除水分子。点击 Edit &#62; Hydrogens &#62; Add 添加氢原子。将成分设为“配体”（ligand），并选择整个靶点作为“受体”（receptor），进行盲对接17。</li>
	<li>在 &#34;center&#34; 和 &#34;size&#34; 后的输入框中输入数值，以调整新构建的空间范围，确保其能够完全包含配体和受体。将配体和受体文件保存为 pdbqt 格式。</li>
	<li>使用 AutoDock Vina 进行分子对接。将 &#34;Receptor&#34; 项设置为“receptor.pdbqt”的文件名，将 &#34;Ligand&#34; 项设置为“ligand.pdbqt”的文件名。获取配体与受体结合的最佳位置，并记录该位置的结合能数值。 
	注：对接过程采用遗传算法进行计算14。所有对接运行参数均使用默认值。对接结果将根据结合能从高到低自动排序。</li>
	<li>将对接结果文件导入 PILP（Protein-ligand Interaction Profiler，https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index）以获得可视化系统模型。下载 pse 格式的模型文件，并导入 PyMOL 软件（见&#160;材料表）进行进一步可视化构建。</li>
</ol>
5. 统计学分析
注意：使用 SPSS 统计软件（参见材料表）进行数据分析。将 p &#60; 0.05 的结果视为具有统计学显著性。
<ol>
	<li>以均值 ± 标准差（SD）表示数值。</li>
	<li>采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行事后最小显著性差异检验（LSD）、Dunnett 检验（方差齐性时）或 Dunnett's T3 检验（方差不齐时），以检验各组间的统计学显著性。</li>
</ol>

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<li>Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+main+components+of+Tibetan+medicine+Phyllanthus+emblica+L%5BTitle%5D)+AND+%22World+Science+and+Technology-Modernization+of+Traditional+Chinese+Medicine+and+Materia+Medica%22%5BJournal%5D)">Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L.</a> World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).</li>
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<li>Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+clinical+study+of+hypolipidemic+efficacy+of+Amla+%28Emblica+officinalis%29+with+3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A+reductase+inhibitor+simvastatin%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin.</a> Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238(2012).</li>
<li>Jung, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+kynurenic+acid+reduces+hyperlipidemia-induced+inflammation+and+insulin+resistance+in+skeletal+muscle+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. , 518(2020).</li>
<li>Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+targets+of+taurine+confer+anti-hyperlipidemic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects.</a> Life Sciences. 278, 119579(2021).</li>
<li>Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+1A1+%28CYP1A1%29+catalyzes+lipid+peroxidation+of+oleic+acid-induced+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells.</a> Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-naphthoflavone+attenuates+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+oleic+acid-treated+HepG2+hepatocytes+and+in+high+fat+diet-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287(2019).</li>
<li>Dai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+%CE%B1-galacto-oligosaccharides+against+a+high-fat%2Fwestern-style+diet-induced+metabolic+abnormalities+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice.</a> Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl%282%29-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Noor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+pharmacology+approach+for+medicinal+plants%3A+review+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment.</a> Pharmaceuticals. 15 (5), 572(2022).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+potential+bioactive+metabolites+from+traditional+Chinese+medicine+for+type+2+diabetes+mellitus%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview.</a> Front Pharmacol. 13, 1023713(2022).</li>
</ol>

所有作者声明均无利益冲突。

近年来，高脂血症的发病率不断上升，主要归因于长期不健康的饮食习惯。中药及其化学成分具有多种药理活性，近年来已得到广泛研究37,38。覆盆子（FP）是一种药食两用的果实资源，在治疗高脂血症方面具有重要的潜在价值。然而，FP抗高脂血症的潜在治疗机制仍需进一步研究。
网络药理学在分子水平上评估药物的多靶点药理作用，并预测天然产物与蛋白质之间的相互作用，以确定其主要作用机制39。第一步是筛选药物的活性成分和关键靶点。本研究共发现9种活性成分和62个核心基因。为进一步阐明茯苓（FP）对高脂血症的分子作用机制，基于网络药理学分析构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和成分-靶点网络。为缩小关键成分和靶点的范围，通过BATMAN-TCM方法筛选出三种与高胆固醇血症及冠状动脉粥样硬化相关的关键活性成分（没食子酸、槲皮素和β-谷固醇）。这些成分均具有降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平或升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平的...

高脂血症是一种对人类健康具有严重影响的常见代谢性疾病，也是心血管疾病的主要危险因素1。近年来，该疾病的发病年龄呈下降趋势，由于长期不规律的生活方式和不健康的饮食习惯，年轻人的患病风险日益增加2。临床上已采用多种药物治疗高脂血症，例如，他汀类药物是治疗高脂血症及相关动脉粥样硬化性疾病患者最常用的药物之一。然而，长期使用他汀类药物会产生不可忽视的副作用，可能导致预后不良，如不耐受、治疗抵抗和不良事件3,4。这些缺陷已成为高脂血症患者的额外负担。因此，亟需提出具有稳定降脂效果且副作用更少的新型治疗方法。
由于传统中药（TCM）疗效良好且副作用较少，已被广泛用于疾病治疗5。余甘子（Fructus Phyllanthi，FP）是大戟科植物余甘子 Phyllanthus emblica Linn. 的干燥果实，俗称余甘果或印度 gooseberry（印度醋栗），是传统中医和印度医学中著名的药食同源物质6,7。根据中医理论，该药材具有清热、凉血、助消化的功效8。现代药理学研究表明，余甘子富含没食子酸、鞣花酸和槲皮素等生物活性成分9，可通过抗氧化、抗炎、保肝、降血脂等多种作用机制发挥广泛的生物学功能10。近期研究还发现，余甘子可有效调节高脂血症患者的血脂水平。例如，Variya 等人11证实，余甘子果汁及其主要化学成分没食子酸能够降低血浆胆固醇水平，并减少肝脏和主动脉中的脂质浸润。其治疗作用与余甘子上调过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPAR-α）的表达以及抑制肝脏脂质生成活性有关。然而，由于余甘子所含生物活性成分种类繁多，其改善高脂血症的具体作用机制仍需进一步研究。本研究旨在探讨余甘子发挥治疗作用的潜在机制，以期为该药材的进一步开发与利用提供科学依据。
目前，网络药理学被认为是一种整体性且高效的手段，用于研究中药的治疗机制。该方法不再局限于寻找单一的致病基因或仅作用于单一靶点的药物，而是构建完整的“药物-成分-基因-疾病”网络，以揭示多成分药物在综合治疗中的多靶点作用机制12。这一技术特别适用于中药，因为中药的化学成分极为复杂。然而，网络药理学仅能从理论上预测化学成分所作用的靶点，还需观察疾病模型中的内源性代谢物变化，以验证网络药理学预测结果的有效性。代谢组学是伴随系统生物学发展而兴起的重要技术，可用于监测内源性代谢物的动态变化13。代谢物的变化反映了机体稳态的改变，也是研究内在作用机制的重要指标。已有研究人员成功将网络药理学与代谢组学相结合，用于探索药物与疾病之间的相互作用机制14,15。
本文通过整合网络药理学与代谢组学技术，探讨了防风（FP）对抗高脂血症的作用机制。采用网络药理学分析防风主要活性成分与高脂血症相关分子靶点之间的关系；随后通过代谢组学观察动物模型内源性代谢物的变化，从而在代谢水平上阐释药物作用机制。相较于单独应用网络药理学或代谢组学的方法，这种整合分析提供了更为具体和全面的研究视角。此外，采用分子对接策略分析了活性成分与关键蛋白之间的相互作用。总体而言，该整合方法能够弥补网络药理学缺乏实验验证的不足，以及代谢组学方法在内源性机制解析上的局限，适用于天然药物治疗机制的研究。本实验方案的主要流程图如图1所示。

<table><tbody><tr><td>101-3B 烘箱</td><td>Luyue 仪器设备厂</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>80312/80302 玻璃载片</td><td>江苏四泰实验设备有限公司</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>80340-1630 盖玻片</td><td>江苏四海实验设备有限公司</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>AccucoreTM C18（3 mm &amp;times; 100 毫米，2.6 &amp;mu;m)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher Chemical</td><td>A998</td><td>版本 1.5.6</td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm &amp;times; 100 mm，1.8 &amp;mu;m)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>Aethanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A995</td><td>版本 3.0</td></tr><tr><td>氨溶液</td><td>成都科隆化学品有限公司</td><td>1336-21-6</td><td>版本 3.9.1</td></tr><tr><td>AutoDockTools</td><td>斯克里普斯海洋研究所</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>BS-240VT 全自动动物生化检测系统</td><td>深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>Compound Discoverer</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>Cytoscape 联盟</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>DM500 光学显微镜</td><td>Leica</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>DV215CD 电子天平</td><td>奥豪斯公司</td><td>T15A63</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>成都科隆化学品有限公司</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>A118</td><td></td></tr><tr><td>高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒</td><td>南京建成生物工程研究所</td><td>A112-1-1</td><td></td></tr><tr><td>苏木精染色液</td><td>Biosharp</td><td>BL700B</td><td></td></tr><tr><td>高脂饮食</td><td>ENSIWEIER</td><td>202211091031</td><td></td></tr><tr><td>日立 CT15E/CT15RE 离心机</td><td>日立有限公司</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>匀浆器</td><td>奥来宝科技有限公司</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>成都科隆化学品有限公司</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>成像系统</td><td>LIOO</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>JB-L5 冷冻机</td><td>武汉俊杰电子有限公司</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>JB-L5 组织包埋机</td><td>武汉俊杰电子有限公司</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>JK-5/6 切片机</td><td>武汉俊杰电子有限公司</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>JT-12S 水提离心机</td><td>武汉俊杰电子有限公司</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>KQ3200E 超声波清洗器</td><td>昆山超声仪器有限公司</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>LDL-C 测定试剂盒</td><td>南京建成生物工程研究所</td><td>A113-1-1</td><td></td></tr><tr><td>雄性C57BL/6小鼠</td><td>&amp;nbsp;SBF Biotechnology Co., Ltd.</td><td>\</td><td>版本 2.3.2</td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>上海轶洋仪器有限公司</td><td>10021190865934</td><td></td></tr><tr><td>纯水</td><td>广州华生食品 &amp;amp; 饮料有限公司</td><td>GB19298</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td>\</td><td>版本 14.1</td></tr><tr><td>RE-3000 旋转蒸发仪</td><td>亚荣生化仪器厂有限公司</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>RM2016 病理切片机</td><td>上海徕卡仪器有限公司</td><td>\</td><td>版本 26.0</td></tr><tr><td>SIMCA-P</td><td>Umetrics AB</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>辛伐他汀</td><td>默克雪兰 &amp;amp; Dohme有限公司</td><td>14202220051</td><td></td></tr><tr><td>SPSS</td><td>国际商业机器公司</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>TC 检测试剂盒</td><td>南京建成生物工程研究所</td><td>A111-1-1</td><td></td></tr><tr><td>TG 检测试剂盒</td><td>南京建成生物工程研究所</td><td>A110-1-1</td><td></td></tr><tr><td>超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱-肼类高分辨质谱法</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>北京宝力斯特科技有限公司</td><td>LC-Vortex-P1</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>成都科隆化学品有限公司</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

基于网络药理学预测与代谢组学验证的叶下珠子治疗高脂血症作用机制研究

Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia

高脂血症已成为全球心血管疾病和肝损伤的主要危险因素。余甘子（Fructus Phyllanthi, FP）在中医和印度医学理论中是一种治疗高脂血症的有效药物，但其潜在作用机制仍需进一步探索。本研究旨在通过整合网络药理学预测与代谢组学验证的策略，揭示余甘子抗高脂血症的作用机制。通过评估血浆脂质水平（包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）），建立高脂饮食（HFD）诱导的小鼠模型。采用网络药理学方法筛选余甘子的活性成分及其抗高脂血症的潜在作用靶点。通过血浆和肝脏的代谢组学分析，鉴定正常组、模型组和干预组之间的差异代谢物及其相关通路。进一步构建网络药理学与代谢组学之间的关联，以全面解析余甘子对抗高脂血症的作用过程。通过分子对接验证所获得的关键靶蛋白。结果表明，余甘子可改善高脂饮食诱导的高脂血症小鼠的血浆脂质水平及肝损伤。余甘子中的没食子酸、槲皮素和β-谷固醇被确定为关键活性成分。代谢组学分析发现，血浆中有16种、肝脏中有6种潜在的差异代谢物参与了余甘子对抗高脂血症的治疗作用。进一步的整合分析表明，其干预作用与CYP1A1、AChE和MGAM相关，并涉及L-犬尿氨酸、皮质酮、乙酰胆碱和棉子糖的调节，主要富集于色氨酸代谢通路。分子对接结果证实，上述成分作用于高脂血症相关蛋白靶点，在降脂过程中发挥关键作用。综上所述，本研究为预防和治疗高脂血症提供了新的可能性。

网络药理学 
根据数据库和液相色谱-质谱（LC-MS）分析所获得的药代动力学和药效学特性，共筛选出18种FP中的潜在成分（总离子流色谱图见补充图1）。通过相关文献发现，没食子酸的含量远高于其他成分，且具有显著的降脂作用9,11。因此，该成分也被视为一种潜在的有效成分。最终共确定19种成分及134个与成分相关的靶点。全部19种成分列于表1中。为筛选出最具代表性的成分用于后续分析，将这些成分导入中医药分子机制生物信息学分析工具数据库（BATMAN-TCM；http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）。根据“成分-靶点-通路-疾病”网络，鉴定出若干生物活性成分，如没食子酸、槲皮素和β-谷甾醇，被认为是FP中与高胆固醇血症和冠状动脉粥样硬化相关的关键成分（补充图2）。其中，没食子酸是研究最为广泛的酚酸之一，也是FP中主要的生物活性成分<sup class="xr...

本实验方案描述了一种整合策略，旨在基于网络药理学预测和代谢组学验证，探索余甘子对抗高脂血症的关键靶点和作用机制。

高脂血症已成为全球心血管疾病和肝损伤的主要危险因素。叶下珠果实（Fructus Phyllanthi，FP）是一种有效的药物……

我们的研究包含一系列实验技术，该方案包含读者理解我们方法所需的细节。我们整合的方法弥补了网络药理学与代谢组学的不足，可用于天然药物的治疗性荟萃分析。该方法适用于从化学成分复杂的公司组分或传统中药等物质中筛选活性化合物。首先，在中药系统药理学数据库中通过搜索关键词“phyllanthi fructus”来选择活性成分和关键靶点。为获得叶下珠（Fructus Phyllanthi，简称FP）的候选活性成分及靶点列表，分别在GeneCards数据库、在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM）以及治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database）中搜索“hyperlipidemia”关键词，以获取高脂血症的相关候选靶点。下载疾病靶点的电子表格文件并保存至指定文件夹，去除重复靶点后，得到高脂血症靶点列表。然后将 FP 活性成分列表、FP 作用靶点列表以及高脂血症靶点列表复制到一个新的电子表格中。使用工具栏中的数据识别重复项功能，获取交集靶点。将交集靶点列表导入 UniProt 知识库，以标准化基因和蛋白质名称。为了构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，将FP抗高脂血症的交集靶点列表粘贴至String数据库11.5的名称对话框中。在生物体中选择homo sapiens，点击搜索，然后继续。结果可用后，在高级设置中启用网络中的高断开节点。将最低必需交互评分的最高置信度设置为 0.900。然后点击更新按钮。单击标题栏中的“exports”，以 PNG 和 TSV 格式下载蛋白质-蛋白质相互作用网络的简短表格文本。为构建药物成分-疾病-靶点网络，打开 Cytoscape 3.9.1 并导入 TSV 格式文件。通过控制面板中的样式栏，优化网络节点的颜色、字体和大小。使用 Cytoscape 中 CytoHubba 的网络拓扑分析功能，获取枢纽基因，并构建药物成分-靶点-疾病网络。进行 GO 和 KEGG 富集分析时，打开 David 生物信息学资源，点击“开始分析”，并将靶点列表粘贴至左侧对话框中。在“选择标识符”中选择官方基因符号，在“选择物种”中选择 homo sapiens。然后在“列表类型”中启用基因列表，并点击提交列表。接下来，在基因列表上方的分析功能中，点击使用 DAVID 工具之一的功能注释聚类。启用GO术语BP直接关联、GO术语CC直接关联、GO术语MF直接关联以及基因本体（gene ontology）进行GO功能富集分析。在通路中启用KEGG通路，用于KEGG通路富集分析。点击功能注释图表以显示结果。使用 SIMCA P 软件对从 LCMS 结果中获得的积分值进行多变量统计分析。对均值中心化数据及样本分类建模，采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。在完成 OPLS-DA 分析后，将投影中变量重要性值（VIP 值）大于 1，且经学生 t 检验得到 P 值小于 0.05 的代谢物视为潜在的差异代谢物。通过开放数据库资源鉴定发生紊乱的代谢物及代谢通路，包括人类代谢组数据库（Human Metabolome Database）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）以及MetaboAnalyst 5.0。利用MetaboAnalyst 5.0和Wukong平台可视化分析结果。从中药系统药理学数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database）下载选定的FP成分的三维结构。在化学名称搜索框中搜索成分名称，并下载相应 MOL 二格式的 3D 结构文件。接着，从 AlphaFold 蛋白质结构数据库下载关键靶标的晶体结构。在搜索框中输入靶标名称，下载相应 PDB 格式的晶体结构文件。然后将原料和目标结构文件导入 AutoDock Tools 软件。点击“编辑”并选择“删除水分子”以移除水分子。接着，点击“编辑氢原子”并选择“添加”以添加氢原子。将组分设为配体，并通过选择整个靶标作为受体来执行盲对接。在“center”和“size”后面的框中输入数值，以调整新开发的空间，使其能够完全容纳配体和受体。将配体和受体文件保存为 PDBQT 格式。使用 AutoDock Vina 进行分子对接。将受体栏设置为受体文件名加后缀 .PDBQT，配体栏设置为配体文件名加后缀 .PDBQT。获取配体与受体结合的最佳位置，并记录在最佳位置处的结合能值。将对接文件导入蛋白配体相互作用分析工具，以获得可视化系统模型。下载PSC格式的模型文件，并将其导入PyMOL软件以进一步构建可视化图像。通过网络药理学分析，共发现FP的19种成分及134个成分相关靶点。将茯苓（FP）相关靶点与高脂血症相关靶点匹配后，共鉴定出62个FP抗高脂血症的潜在作用靶点。利用String和Cytoscape构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络。GO富集分析结果表明，FP抗高脂血症的生物学过程和分子功能主要与基因表达和蛋白质结合相关。KEGG 富集分析证明，FP 可干预脂质代谢和动脉粥样硬化。采用 OPLS-DA 分析探索阴性对照组、高脂饮食组和高剂量 FP 小鼠组之间的代谢物分离情况，结果显示同组样本聚集在一起，不同组样本能够良好区分。在血浆和肝脏中，分别鉴定出 16 种和 6 种 FP 影响高脂饮食小鼠的差异代谢物。通过 MetaboAnalyst 5.0 绘制的热图显示，高脂饮食组血浆和肝脏中的所有差异代谢物均发生改变，而 FP 组中大多数改变得到逆转。血浆中色氨酸代谢受到显著影响，肝脏中牛磺酸和次牛磺酸代谢受到显著影响。将差异代谢物导入Cytoscape中的MetScape插件，并与网络药理学鉴定出的枢纽基因进行匹配，以收集化合物-反应-酶-基因网络。进一步构建了成分-靶点-代谢物-通路网络。采用分子对接分析其配体与活性位点的相互作用。该技术是一种系统解析中药药理活性成分的综合方法，为开展全成分药物研究提供了新思路。

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网络药理学预测及代谢组学验证 凤仙花抗高脂血症的机制

本研究揭示了该机制 栝楼属-Fritillaria thunbergii 基于网络药理学和实验验证治疗肺腺癌。该研究还表明，PI3K/AKT 信号通路在药物作用中发挥着关键作用 栝楼属-Fritillaria thunbergii...

网络药理学预测与实验验证 栝楼属-Fritillaria thunbergii 肺腺癌作用机制

本文描述了使用油酸诱导的HepG2细胞作为代谢功能障碍相关脂肪性肝病的模型。...

代谢功能障碍相关脂肪性肝病中脂肪沉积的体外建模

本研究在慢性束缚应激诱导的抑郁大鼠模型中评估了强志方的抗抑郁作用，并通过网络药理学和分子对接分析阐明了其对HIF-1和JAK-STAT通路的调控作用。...

基于网络药理学及慢性束缚应激诱导抑郁大鼠模型验证强志方的抗抑郁作用机制

本文展示了在产科患者中进行的弥散性有害抑制性控制、时间总和以及伤口痛觉过敏测试。这些测试用于评估疼痛处理过程中的抑制性和兴奋性机制，并在此用于评价妊娠期间及围产期不同时间点的内源性镇痛情况，以帮助揭示个体发生持续性疼痛的风险。...

一种用于预测术后疼痛（PPOP）的实验范式

免疫缺陷小鼠中的人类肿瘤异种移植模型是研究癌症生物学的有力工具。本文描述了从人肝细胞癌细胞或肿瘤组织片段建立皮下和肝内异种移植模型的具体实验方案。通过部分肝切除术诱导受体小鼠肝脏再生，可作为促进肝内移植瘤定植的有效策略。...

在免疫缺陷小鼠中建立人肝细胞癌皮下及肝内异种移植模型

在浅肤色紫外线敏感型人类的小鼠模型中，外用佛司可林可诱导表皮黑色素生成。通过药物调节皮肤中的cAMP水平以及表皮色素加深，能够显著防护紫外线引起的炎症反应（晒伤），该保护作用通过最小红斑剂量（MED）检测法进行测定。...

药理学诱导人源化小鼠模型表皮黑色素生成及其对晒伤的防护作用

采用基于种子点的功能连接MRI（fcMRI）分析颞叶癫痫（TLE）患者脑部静息状态下的默认模式网络（DMN）。...

利用功能连接MRI对颞叶癫痫患者默认模式网络进行网络分析

我们概述了一种同时实施两种方法的实验方案 体内 和 离体...

体内 与 离体 研究卵巢癌转移定植腹膜脂肪中乳斑结构的方法

该论文介绍了采用固相微萃取技术对人脑肿瘤进行现场取样，随后进行生化分析，以期发现生物标志物。...

脑肿瘤代谢组学与脂质组学分析的现场取样与提取

激光穿孔与微电极阵列（MEA）相结合，可实现对培养的原代心肌细胞及干细胞来源心肌细胞的动作电位样信号记录。相较于标准记录方法，该技术提供的波形形态可更深入揭示受试化合物的作用机制，将膜片钳与MEA检测结果相联系，有望进一步优化未来的心脏安全性研究。...

基于微电极阵列的激光诱导心肌细胞动作电位样检测以提高安全药理学预测性

探索网络药理学与代谢组学整合方法，用于分析凤仙花抗高脂血症的活性成分及作用靶点。该技术为天然药物研究提供新思路，可应用于其他中药疗效分析。

基于网络药理学预测与代谢组学验证的叶下珠子治疗高脂血症作用机制研究

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