基于网络药理学预测与代谢组学验证的叶下珠子治疗高脂血症作用机制研究

我们的研究包含一系列实验技术，该方案包含读者理解我们方法所需的细节。我们整合的方法弥补了网络药理学与代谢组学的不足，可用于天然药物的治疗性荟萃分析。该方法适用于从化学成分复杂的公司组分或传统中药等物质中筛选活性化合物。

首先，在中药系统药理学数据库中通过搜索关键词“phyllanthi fructus”来选择活性成分和关键靶点。为获得叶下珠（Fructus Phyllanthi，简称FP）的候选活性成分及靶点列表，分别在GeneCards数据库、在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM）以及治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database）中搜索“hyperlipidemia”关键词，以获取高脂血症的相关候选靶点。下载疾病靶点的电子表格文件并保存至指定文件夹，去除重复靶点后，得到高脂血症靶点列表。

然后将 FP 活性成分列表、FP 作用靶点列表以及高脂血症靶点列表复制到一个新的电子表格中。使用工具栏中的数据识别重复项功能，获取交集靶点。将交集靶点列表导入 UniProt 知识库，以标准化基因和蛋白质名称。

为了构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，将FP抗高脂血症的交集靶点列表粘贴至String数据库11.5的名称对话框中。在生物体中选择homo sapiens，点击搜索，然后继续。

结果可用后，在高级设置中启用网络中的高断开节点。将最低必需交互评分的最高置信度设置为 0.900。然后点击更新按钮。

单击标题栏中的“exports”，以 PNG 和 TSV 格式下载蛋白质-蛋白质相互作用网络的简短表格文本。为构建药物成分-疾病-靶点网络，打开 Cytoscape 3.9.1 并导入 TSV 格式文件。通过控制面板中的样式栏，优化网络节点的颜色、字体和大小。

使用 Cytoscape 中 CytoHubba 的网络拓扑分析功能，获取枢纽基因，并构建药物成分-靶点-疾病网络。进行 GO 和 KEGG 富集分析时，打开 David 生物信息学资源，点击“开始分析”，并将靶点列表粘贴至左侧对话框中。

在“选择标识符”中选择官方基因符号，在“选择物种”中选择 homo sapiens。然后在“列表类型”中启用基因列表，并点击提交列表。接下来，在基因列表上方的分析功能中，点击使用 DAVID 工具之一的功能注释聚类。

启用GO术语BP直接关联、GO术语CC直接关联、GO术语MF直接关联以及基因本体（gene ontology）进行GO功能富集分析。在通路中启用KEGG通路，用于KEGG通路富集分析。点击功能注释图表以显示结果。

使用 SIMCA P 软件对从 LCMS 结果中获得的积分值进行多变量统计分析。对均值中心化数据及样本分类建模，采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。在完成 OPLS-DA 分析后，将投影中变量重要性值（VIP 值）大于 1，且经学生 t 检验得到 P 值小于 0.05 的代谢物视为潜在的差异代谢物。

通过开放数据库资源鉴定发生紊乱的代谢物及代谢通路，包括人类代谢组数据库（Human Metabolome Database）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）以及MetaboAnalyst 5.0。利用MetaboAnalyst 5.0和Wukong平台可视化分析结果。从中药系统药理学数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database）下载选定的FP成分的三维结构。

在化学名称搜索框中搜索成分名称，并下载相应 MOL 二格式的 3D 结构文件。接着，从 AlphaFold 蛋白质结构数据库下载关键靶标的晶体结构。在搜索框中输入靶标名称，下载相应 PDB 格式的晶体结构文件。

然后将原料和目标结构文件导入 AutoDock Tools 软件。点击“编辑”并选择“删除水分子”以移除水分子。接着，点击“编辑氢原子”并选择“添加”以添加氢原子。

将组分设为配体，并通过选择整个靶标作为受体来执行盲对接。在“center”和“size”后面的框中输入数值，以调整新开发的空间，使其能够完全容纳配体和受体。将配体和受体文件保存为 PDBQT 格式。

使用 AutoDock Vina 进行分子对接。将受体栏设置为受体文件名加后缀 .PDBQT，配体栏设置为配体文件名加后缀 .PDBQT。获取配体与受体结合的最佳位置，并记录在最佳位置处的结合能值。

将对接文件导入蛋白配体相互作用分析工具，以获得可视化系统模型。下载PSC格式的模型文件，并将其导入PyMOL软件以进一步构建可视化图像。通过网络药理学分析，共发现FP的19种成分及134个成分相关靶点。

将茯苓（FP）相关靶点与高脂血症相关靶点匹配后，共鉴定出62个FP抗高脂血症的潜在作用靶点。利用String和Cytoscape构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络。GO富集分析结果表明，FP抗高脂血症的生物学过程和分子功能主要与基因表达和蛋白质结合相关。

KEGG 富集分析证明，FP 可干预脂质代谢和动脉粥样硬化。采用 OPLS-DA 分析探索阴性对照组、高脂饮食组和高剂量 FP 小鼠组之间的代谢物分离情况，结果显示同组样本聚集在一起，不同组样本能够良好区分。在血浆和肝脏中，分别鉴定出 16 种和 6 种 FP 影响高脂饮食小鼠的差异代谢物。

通过 MetaboAnalyst 5.0 绘制的热图显示，高脂饮食组血浆和肝脏中的所有差异代谢物均发生改变，而 FP 组中大多数改变得到逆转。血浆中色氨酸代谢受到显著影响，肝脏中牛磺酸和次牛磺酸代谢受到显著影响。

将差异代谢物导入Cytoscape中的MetScape插件，并与网络药理学鉴定出的枢纽基因进行匹配，以收集化合物-反应-酶-基因网络。进一步构建了成分-靶点-代谢物-通路网络。采用分子对接分析其配体与活性位点的相互作用。

该技术是一种系统解析中药药理活性成分的综合方法，为开展全成分药物研究提供了新思路。