Name: 使用核内流式细胞术定量分离小鼠脑小胶质细胞中的整体组蛋白翻译后修饰 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 了解核内流式细胞术定量分析小鼠脑小胶质细胞整体组蛋白翻译后修饰的方法。该技术可高通量筛选表观遗传修饰，为神经发育和精神疾病研究提供快速、精准的定量分析手段。

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感谢白艳阳协助完成图5中的免疫印迹实验。本研究由加拿大卫生研究院 [CRC-RS 950-232402 至 AC]、加拿大自然科学与工程研究理事会 [RGPIN-2019-04450、DGECR-2019-00069 至 AC]、苏格兰礼慈善基金会 [21103 至 AC] 和加拿大脑基金会 [AWD-023132 至 AC] 提供资助；不列颠哥伦比亚大学原住民研究生奖学金（6481 至 MT）；不列颠哥伦比亚省研究生奖学金（6768 至 MT）；加拿大开放神经科学平台学生学者奖（10901 至 JK）；不列颠哥伦比亚大学四年博士奖学金（6569 至 JK）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

Mouse Brain Histone Modification Quantification Using Flow Cytometry

<ol><li>Miller, J. L., Grant, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+DNA+Methylation+and+Histone+Modifications+in+Transcriptional+Regulation+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%3A+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans.</a> Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+DNA+methylation+amid+a+perfect+storm+of+autism+aetiologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).</li>
<li>Keiser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+HDAC3+inhibition+ameliorates+impairments+in+synaptic+plasticity+caused+by+simulated+galactic+cosmic+radiation+exposure+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367(2021).</li>
<li>McQuown, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC3+is+a+critical+negative+regulator+of+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).</li>
<li>Barrett, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+Focal+Knockout+of+CBP+Affects+Specific+Histone+Modifications%2C+Long-Term+Potentiation%2C+and+Long-Term+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory.</a> Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).</li>
<li>Datta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Deacetylases+1+and+2+Regulate+Microglia+Function+during+Development%2C+Homeostasis%2C+and+Neurodegeneration+in+a+Context-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner.</a> Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).</li>
<li>Belhocine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+transcriptional+regulation+of+microglial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation.</a> Glia. 70 (3), 572-589 (2022).</li>
<li>Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGosselin%2C+D+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Microglia.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).</li>
<li>Sullivan, O., Ciernia, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Work+hard%2C+play+hard%3A+how+sexually+differentiated+microglia+work+to+shape+social+play+and+reproductive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011(2022).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Crowe, A., Yue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+Determination+of+Protein+Expression+Using+Immunohistochemistry+Staining+and+Analysis%3A+An+Integrated+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol.</a> BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).</li>
<li>Seligson, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+histone+modification+patterns+predict+risk+of+prostate+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence.</a> Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Histone+Modification+Patterns+as+Prognostic+Markers+to+Classify+Glioma+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology%2C+Biomarkers+%26+Prevention%22%5BJournal%5D)">Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).</li>
<li>Pan, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+feedback+regulation+of+microglial+glucose+metabolism+by+histone+H4+lysine+12+lactylation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease.</a> Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+from+the+Ischemic+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), 53658(2016).</li>
<li>Oblak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Evaluation+of+the+5XFAD+Mouse+Model+for+Preclinical+Testing+Applications%3A+A+MODEL-AD+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726(2021).</li>
<li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Microglia.</a> Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70(2019).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Conventional+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Flow+Cytometry+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Conventional Flow Cytometry.</a> Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+artifactual+and+confounding+glial+signatures+by+single-cell+sequencing+of+mouse+and+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain.</a> Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).</li>
<li>Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+quantitative+fluorescence+measurements+with+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).</li>
<li>Rumbaugh, G., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+in+the+brain%3A+measuring+global+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).</li>
<li>Xavier, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+delineation+of+signaling+and+epigenomic+mechanisms+underlying+microglia+inflammatory+activity+in+acute+and+chronic+brain+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRvix%22%5BJournal%5D)">Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies.</a> BioRvix. , (2022).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

本方案通过流式细胞术实现对全基因组HPTM水平的定量评估。尽管本方案提出了一种新方法，但既往研究已采用类似方法对蛋白质进行过定量分析。26以往用于评估组蛋白翻译后修饰全局水平的方法包括免疫组织化学和蛋白质印迹法16,17,19,20基于流式细胞术的方法如下所示&#160;一个&#160;易于定量的方法，而蛋白质印迹和免疫组织化学为半定量方法，通量较低。蛋白质印迹依赖于细胞裂解，因此需要进行蛋白归一化，并使用一种在实验条件下表达水平被认为保持不变的上样对照蛋白。27免疫组织化学是半定量的，通量很低，因为在单细胞水平以下难以对蛋白含量进行准确定量评估。16同样，对于分离的小胶质细胞而言，由于蛋白产量有限，而 Western blot 需要大量的蛋白上样量，因此使用流式细胞术更具优势。19细胞数量需求较低，可从同一只动物中进行多个染色组合的实验。
然而，与其他任何方法一样，该技术也存在局限性，包括抗体的成本和可获得性，因为并非所有抗体在流式细胞术条件下都能良好工作。此外，与免疫印迹相比，该方法所需的抗体浓度要高得多。尽管多重检测技术允许在同一组细胞上同时使用多种抗体，但在分析后无法将抗体从细胞上去除，因此每种抗体只能使用一次细胞样本。这与免疫印迹不同，后者可以对同一张印迹膜进行多次重复使用。然而，根据可用的抗体种类以及流式细胞仪检测通道的数量，有可能同时检测多达十余种标志物。
目前该方法仅能捕获蛋白质表达的整体水平，而无法反映其在基因组上的特定位点信息，且整体水平的变化可能无法体现单个基因组位点的变化。同样，整体水平无变化并不意味着没有任何基因组位点发生改变，而可能仅仅是各变化相互抵消，导致处理组之间整体无显著差异。因此，该技术主要用于筛选出与基因组分析相关的组蛋白翻译后修饰（HPTMs）。此外，该方法不允许在不同蛋白质修饰标记之间进行直接比较，除非以相对于对照组的倍数变化形式进行评估。因此，与基于标准曲线的蛋白质定量方法（如ELISA）相比，该方法存在一定的局限性。
本方案提供了一种分离活体脑内小胶质细胞的策略。该方案依赖于P2RY12蛋白的表达来分离小胶质细胞。然而，P2RY12是小胶质细胞的一种稳态标志物，在疾病模型（如5XFAD22）中其表达可能下调。因此，在使用疾病模型动物时，务必选择其他标志物蛋白（如TMEM119、CD11b或CD45）以辅助小胶质细胞的分离23。同样，本方案以从海马和/或皮层中分离小胶质细胞为例进行介绍。该方案也可用于从其他脑区（包括白质区域）分离小胶质细胞，但根据目标区域的大小，可能需要使用多只动物才能获得足够数量的小胶质细胞。
本文所述方案可有效分离活体脑内小胶质细胞，但在分离阶段存在若干步骤，若操作不当，可能导致细胞得率降低，具体如下所述。
本方案中的灌流操作可使免疫富集片段中获得更高比例的小胶质细胞，从而减少分选仪上的操作时间。然而，灌流并非必需步骤，若有必要，也可采用其他安乐死方法。
在小胶质细胞分离过程中，应完全去除髓鞘。流式细胞仪依赖细胞以快速通过狭窄的管道。由于髓鞘具有黏性且易于聚集，会导致流式细胞仪出现故障，常常引起堵塞，这不仅可能损坏仪器，还会破坏样本，显著降低得率。在收集免疫细胞富集片段时，务必小心彻底去除所有髓鞘，以避免后续实验出现问题。
平板染色与离心管染色的比较：本方案中，我们描述了在1.5 mL离心管或96孔板中进行细胞染色的两种选择。每种方法的适用情况取决于具体实验；但通常而言，离心管染色对得率的影响风险低于平板染色，因为在平板操作中，倾倒步骤若操作不当可能导致细胞丢失。而平板染色速度更快，因为逐个离心管吸取上清液较为耗时。在固定前（如用于分选等操作）建议采用离心管染色，以最大化细胞得率并降低丢失风险。然而，对于HPTM分析，在细胞经固定用于核内染色后，细胞沉淀更为稳定，此时进行倾倒操作导致细胞丢失的风险显著降低。
建立不连续密度梯度：在进行分层操作时，正确设置各层对于获得免疫细胞富集组分至关重要。如果各层受到扰动或混合而变得浑浊，细胞将无法迁移至目标位置，从而难以获取免疫富集的细胞组分。若出现此情况，应将样本连同密度介质一同离心以去除髓鞘，然后收集所有剩余组分，每1 mL密度介质加入3 mL FACS缓冲液进行稀释，并充分混匀（此过程可能需要使用多个离心管）。在制动设为0的条件下，以500 × g 离心10分钟。弃去上清液，仅保留约300 µL溶液。收集全部样本并进行染色。此方法可能导致分选效率降低，并延长流式细胞仪检测时间，但最终得率仍可保持在可接受水平。
使用分离方法时，能够从同一只小鼠脑中获取细胞用于RNA分析以及HPTM评估是十分有利的。在此情况下，分选活的髓系小胶质细胞后，可将细胞分为两部分：一部分用于RNA评估（为获得足够的RNA产量，最少需要75,000个细胞），另一部分用于进一步的流式细胞术分析（每孔至少10,000个细胞，以准确测定MFI）。此时需要进行流式细胞仪分选。然而，若仅计划对细胞进行HPTM分析，则无需分选，可直接对免疫富集组分使用P2RY12抗体和HPTM抗体进行染色。随后可在流式细胞仪上设门圈选P2RY12+的小胶质细胞，如同进行流式分选时的操作，以特异性分析小胶质细胞内的HPTM信号。省去分选步骤可使实验流程更加快速且经济高效。此外，若对培养细胞中的HPTM进行评估，则直接从染色步骤开始即可，无需使用细胞标志物抗体，如图6所示。HPTM评估方案适用于多种细胞类型，包括培养细胞、原代细胞以及诱导多能干细胞（iPSC）来源的细胞。
最后，尽管我们仅介绍了小胶质细胞分离后的两种潜在用途，但实际上还有许多其他应用，包括表观遗传学技术，如ChIP、CUT&amp;#38;Tag和CUT&amp;#38;RUN。在基因组表观遗传学技术中，若需分析特定基因位点的变化，应针对实验目的选择特异性的染色质修饰“书写”和“擦除”酶抑制剂11，以确保所检测到的小胶质细胞表观遗传修饰谱并非来源于分离过程（如酶消化步骤）中的技术性假象。而在评估表观遗传标记的全局水平变化时（例如通过定量流式细胞术），通常不会因实验操作引起足够显著的变化以致在全局水平上被检测到。
总体而言，所讨论的方法提供了一种新颖的单细胞技术，可通过流式细胞术定量检测组蛋白修饰及其他表观遗传改变的全局水平。我们证明了该方法具有足够的灵敏度，可检测小胶质细胞在脂多糖（LPS）刺激下增强子标志物H3K27ac的全局变化 体内这与先前在LPS刺激后进行的H3K27ac ChIP-测序结果一致，显示对LPS有响应的增强子发生了显著的重塑28该方法的应用将有助于研究发育和疾病过程中不同脑细胞类型的全基因组表观遗传学变化。

表观遗传学是研究在不改变DNA序列的情况下调控基因表达的机制的学科。基因表达的表观遗传调控在细胞内具有动态性，能够使细胞快速且协调地响应各种环境刺激。这种动态调控部分源于核小体水平上染色质结构的变化，核小体由组蛋白蛋白（H2A、H2B、H3、H4）组装成八聚体核心，并被DNA紧密缠绕1。组蛋白蛋白与DNA之间的相互作用可控制转录机器对DNA的可及性，从而最终调控基因表达及其他染色质生物学过程2。组蛋白蛋白具有无固定结构的尾部，其上含有带正电荷的残基，可与带负电荷的DNA骨架形成静电相互作用。这些相互作用导致DNA高度紧密包装，降低DNA的可及性。对组蛋白尾部的共价修饰，称为组蛋白翻译后修饰（HPTMs），能够调控这些相互作用3,4。其中研究最为清楚的HPTMs包括组蛋白尾部的乙酰化和甲基化，这些修饰可改变组蛋白尾部与DNA之间静电相互作用的亲和力，从而导致底层DNA可及性的差异，并招募能够识别特定位置HPTMs的转录因子。HPTMs由三类重要的酶进行调控：识别HPTMs的“阅读器”（readers）、添加修饰的“书写器”（writers）以及去除修饰的“擦除器”（erasers）。因此，阅读器、书写器或擦除器酶的招募或解离最终可改变HPTMs的分布格局，进而调控染色质的结构与功能，使得对这些修饰的调控及其读取成为理解细胞生物学和功能的关键3,4。
中枢神经系统（CNS）中的细胞在表观遗传上具有可塑性，能够通过改变其转录组来适应环境刺激。越来越多的证据表明，表观基因组的改变（如DNA甲基化、非编码RNA以及组蛋白翻译后修饰（HPTM））在记忆形成和突触功能中发挥着关键作用5。通过调控相应的“阅读器”、“书写器”或“擦除器”来干扰HPTM的动态过程，可阻断或增强联想学习和长时程增强效应6,7,8。小胶质细胞作为中枢神经系统中的常驻免疫细胞，可通过其表观基因组的动态变化，快速调节转录组以响应免疫刺激9,10,11。这种对局部脑环境的高度适应性使得在脱离体内环境的情况下独立研究小胶质细胞变得困难，已有研究表明，小胶质细胞一旦离开脑组织并在培养基中培养数小时后，其表观基因组和转录组即发生改变11。此外，由于小胶质细胞仅占脑细胞总数的10%，在全组织水平上检测其变化的方法缺乏足够的灵敏度和特异性12,13。因此，为了在离体（ex vivo）条件下研究HPTM水平等表观遗传变化，需要快速分离小胶质细胞。
常用于检测组蛋白翻译后修饰（HPTM）的方法包括染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和靶点切割与标签化测序（CUT&amp;#38;Tag-seq）4。尽管这些技术对特定的HPTM具有高度特异性，并能揭示特定基因组背景下HPTM的存在情况，但每次实验仅能检测众多可能的HPTM中的一种11,14。因此，在开展需要大量时间和资金投入的此类实验之前，通过首先检测HPTM整体水平的变化，缩小值得进一步研究的潜在HPTM范围，具有重要意义。检测HPTM整体水平的两种主要方法是免疫组织化学和蛋白质印迹分析，但这两种方法均为半定量、通量较低，且需要大量组织切片或分离的细胞15,16。因此，我们致力于开发一种高灵敏度、定量的方法，以实现快速、单细胞水平的HPTM整体水平检测。
本方案通过核内流式细胞术，能够快速检测全局组蛋白翻译后修饰（HPTM）水平。既往在癌细胞中的研究已从临床角度证实了检测全局水平的重要性17,18。目前许多研究也常将全局水平作为筛选手段，用于在分析特定HPTM基因组定位之前进行初步评估19,20。对于小胶质细胞而言，由于细胞得率较低，分离后检测其全局HPTM水平具有挑战性；Pan等人的研究中报告了分离小胶质细胞的全局HPTM水平，其通过合并三只动物的小胶质细胞样本，方得以通过Western blot检测蛋白水平19。而采用本方案，我们能够在显著更低的细胞投入量下检测到全局变化，从而实现每只动物多个修饰标志物的筛查，并避免样本 pooling 的必要性。
本文介绍了一种通过定量核内流式细胞术快速检测分离小胶质细胞中组蛋白翻译后修饰（HPTM）水平的实验方案。尽管为简洁起见，本文重点聚焦于HPTM的定量分析，但该方案同样可用于定量检测识别蛋白（reader）、修饰酶（writer）和去修饰酶（eraser）的整体水平。本方案分为两个部分：第一部分为小胶质细胞的分离方法，第二部分为基于流式细胞术的HPTM水平检测方法。该分离方法所获得的细胞可用于RNA提取和HPTM水平分析，从而实现对同一样本中基因表达水平与HPTM水平的联合评估。此外，HPTM检测方法也可应用于其他细胞类型，具体操作如方案中所述。

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon 离心管，聚丙烯，无菌&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24孔透明未处理板</td><td>Costar</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>96孔透明聚苯乙烯微孔板，透明圆底，未处理表面</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>乙酰化组蛋白 H3 K9 (C5B11)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>9649S</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>乙酰化组蛋白 H4 K8 (2594)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>2594S</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>乙酰化组蛋白 H3 K27 (D5E4)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>8173S</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>乙酰化组蛋白 H3 Lys27 (MA523516)</td><td>Invitrogen</td><td>MA523516</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>放线菌素 D</td><td>New England Biolabs</td><td>15021S</td><td></td></tr><tr><td>茴香霉素</td><td>New England Biolabs</td><td>2222S</td><td></td></tr><tr><td>抗组蛋白 H3（三甲基化 K4）&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab213224</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>抗乳酸化组蛋白 H4（Lys 12）兔单克隆抗体</td><td>PTM Biolabs</td><td>PTM-1411RM</td><td>稀释比例：1:250</td></tr><tr><td>抗 L-乳酸赖氨酸兔多克隆抗体</td><td>PRM Biolabs</td><td>PTM-1401RM</td><td>稀释比例：1:250</td></tr><tr><td>Apc 抗 P2RY12 抗体，克隆：S16007D</td><td>BioLegend</td><td>848006</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Tocris</td><td>5217</td><td></td></tr><tr><td>Cyto-Last 缓冲液</td><td>BioLegend</td><td>422501</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜，无菌</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>12611S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠 AlexaFluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-546-150</td><td>稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>驴抗兔 AlexaFluor488</td><td>ABclonal</td><td>AS035</td><td>稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>驴抗兔 AlexaFluor568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>驴抗兔 Brilliant Violet 421</td><td>BioLegend</td><td>406410</td><td>稀释比例：1:500</td></tr><tr><td>Fisherbrand 一次性刻度移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 一次性 PES 滤器单元，250 mL&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>H3K18ac 多克隆抗体</td><td>Invitrogen</td><td>720095</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>HBSS (10X)，无钙，无镁，无酚红</td><td>Gibco</td><td>14185052</td><td></td></tr><tr><td>HBSS，无钙，无镁，无酚红</td><td>Gibco</td><td>14175103</td><td></td></tr><tr><td>组蛋白 H3 三甲基化 K27 (ab6002)</td><td>Abcam</td><td>ab6002</td><td>稀释比例：1:100</td></tr><tr><td>KONTES Dounce 组织研磨器 125 mm 7 mL&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>乳酸化组蛋白 H3（Lys 18）兔单克隆抗体</td><td>PTM BIolabs</td><td>PTM-1406RM</td><td>稀释比例：1:250</td></tr><tr><td>脂多糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5418</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads 补偿微珠</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td></td></tr><tr><td>PDS 试剂盒，木瓜蛋白酶小瓶 - Worthington Biochemical</td><td>Cedarlane</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>VWR</td><td>RC57004</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>彩虹荧光微粒，单峰（3.0-3.4 μm - 中等强度）</td><td>BioLegend</td><td>422905</td><td></td></tr><tr><td>无RNase 微离心管，1.5 mL</td><td>Invitrogen</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro 试剂盒</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>带盖圆底聚丙烯管，5 mL</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>雷公藤甲素</td><td>New England Biolabs</td><td>97539</td><td></td></tr><tr><td>True Nuclear 转录因子缓冲液套装</td><td>BioLegend</td><td>424401</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX PLUS（抗小鼠 CD16/32）抗体</td><td>BioLegend</td><td>156604</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua 可固定活力检测试剂盒</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td></td></tr></tbody></table>

利用核内流式细胞术定量分析分离的小鼠脑小胶质细胞中组蛋白全局翻译后修饰

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

基因表达的调控部分依赖于染色质结构的改变，包括组蛋白尾部发生翻译后修饰的添加与去除。组蛋白翻译后修饰（HPTMs）可促进或抑制基因表达。例如，组蛋白尾部赖氨酸残基的乙酰化可中和其正电荷，减弱尾部与带负电荷DNA之间的相互作用。组蛋白尾部与DNA相互作用的减少使得底层DNA的可及性增加，从而促进转录因子的结合。此外，乙酰化修饰还可作为含溴结构域的转录激活因子的识别位点，共同促进基因表达的增强。组蛋白修饰可在细胞分化过程中以及响应不同细胞环境和刺激时动态调控。尽管新一代测序技术已开始用于鉴定单个组蛋白修饰的基因组定位，但每次仅能检测一种修饰。鉴于目前已知存在数百种不同的HPTMs，我们开发了一种高通量、定量检测全局HPTMs的方法，可用于在开展更深入的基因组测序前对组蛋白修饰进行筛选。本方案描述了一种基于流式细胞术的检测全局HPTMs的方法，适用于培养细胞或从组织中分离的细胞 体内 组织。我们展示了从小鼠脑内分离的微胶质细胞获得的示例数据，以证明该检测方法在响应细菌来源的免疫刺激物（脂多糖）时，能够灵敏地检测组蛋白翻译后修饰的整体变化。本方案可实现对组蛋白翻译后修饰的快速定量评估，并可应用于任何可通过抗体检测的转录或表观遗传调控因子。

成年小鼠经心脏灌注后处死，用于小胶质细胞的分离。小胶质细胞在冰上分离，并用P2RY12-APC和violet 525活死细胞抗体进行染色。P2RY12阳性且violet 525活死染色阴性的细胞被分选为活的小胶质细胞。从一只解剖后的小鼠脑组织中平均获得的小胶质细胞数量为1.28 × 105 ± 0.05（均值 ± 均值标准误[SEM]，N=100）。雌性小鼠（1.25 × 105 ± 0.09 [均值 ± SEM，N=46]）与雄性小鼠（1.32 × 105 ± 0.07 [均值 ± SEM，N=54]）之间的小胶质细胞得率无显著差异（t(98)=0.6365，p=0.526）。在从特定脑区分离时，小鼠皮层来源的小胶质细胞平均得率为8.3 × 104 ±&#160; 0.08（均值 ± SEM，N=15），海马区来源的为4.1 × 104 ± 0.02（均值 ± SEM，N=16）。如预期所示，不同脑区之间的小胶质细胞得率存在显著差异（F(2, 128)=25.25，P&#60;0.0001）。小胶质细胞分离后，使用低输入量RNA提取试剂盒从小胶质细胞中提取RNA。RNA完整性评分（RIN） consistently 高于9.0（9.62&#160;± 0.05），每细胞平均RNA得率为0.25 ± 0.01 pg（均值 ± SEM，N=32；补充文件S2）。
在处死前24小时，成年小鼠通过腹腔注射1 mg/kg的脂多糖（LPS）。小鼠经心脏灌注HBSS，并按照所述方案从全脑中分离小胶质细胞（图5A）。每种染色实验中，将20,000–30,000个细胞分配至每组抗体检测面板。通过流式细胞术检测分离的小胶质细胞中组蛋白3赖氨酸27乙酰化（H3K27Ac）的整体水平。在雄性和雌性小鼠中，当MFI在性别内部归一化时，LPS处理均导致H3K27Ac水平升高（t(6)=9.676，p&#60;0.0001；图5B）。观察染色细胞的直方图可见，细胞群体仍呈正态分布且变异程度相似；但细胞的荧光强度整体升高，导致MFI增加（图5C）。在相同处理条件下检测H3K9Ac时，也观察到H3K9Ac水平的类似升高（t(6)=7.299，p=0.0003；图5D，E），但LPS相对于PBS处理组的H3K9Ac信号倍数变化小于H3K27Ac信号的倍数变化。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig05.jpg" /> 
图5：分离的小胶质细胞中组蛋白乙酰化的全局变化。（A）小鼠在处死前24小时经腹腔注射磷酸盐缓冲液（PBS）或1 mg/kg脂多糖（LPS）。从小胶质细胞富集的免疫组分中收集细胞，并固定用于流式细胞术及全局组蛋白翻译后修饰水平检测。以中位荧光强度作为蛋白表达水平的替代指标。图片使用BioRender.com制作。（B）H3K27Ac的全局水平在LPS处理后升高。以同一实验和性别内PBS组为基准进行归一化，计算倍数变化。非配对双尾t检验，t(6)=9.676，p&#60;0.0001。柱状图表示均值±标准误（SEM）。N=8只动物；每种条件2只，共进行2次独立实验。（C）示例直方图显示H3K27Ac荧光强度的变化。模态图展示PBS注射小鼠与LPS注射小鼠的直方图对比。（D）示例直方图显示H3K9Ac荧光强度的变化。模态图展示PBS注射小鼠与LPS注射小鼠的直方图对比。（E）H3K9Ac的全局水平在LPS处理后升高。以同一实验和性别内PBS组为基准进行归一化，计算倍数变化。非配对双尾t检验，t(6)=7.299，p=0.0003。柱状图表示均值±标准误（SEM）。N=8只动物；每种条件2只，共进行2次独立实验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了确认所描述的方法是否与其他先前用于全基因组组蛋白修饰定量的方法具有可比性，我们计划使用免疫印迹作为比较工具。然而，分离得到的微胶质细胞产量过低，无法进行合理的评估。因此，我们采用培养的 BV2 细胞来比较细胞内流式细胞术与蛋白质印迹法（WB）。BV2 细胞在完全培养基（DMEMF12，10% 胎牛血清，1× 青霉素/链霉素和 1× L-谷氨酰胺）中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养。细胞使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 进行传代，并以每孔 250,000 个细胞的密度接种，在低血清培养基（DMEM F12，2% 胎牛血清，1× 青霉素/链霉素和 1× L-谷氨酰胺）中处理，并在 37 °C、5% CO2 条件下恢复 12 小时。随后，细胞用 25 ng/mL LPS 处理 24 小时，之后按上述方法进行固定或使用 WB 裂解缓冲液进行裂解。H3K27Ac 信号通过两种方法检测，WB 中以 GAPDH 作为上样对照。对每组数据计算相对于 PBS 对照组的归一化荧光强度（图 6A）。在通过 WB 检测归一化 H3K27Ac 信号变化时，LPS 处理组相对于 H2O 对照组信号增加了 1.527 倍，经非配对 t 检验确定具有显著性差异（t=3.024，df=5；p=0.0293）。在使用流式细胞术检测时，LPS 处理组信号增加了 1.482 倍，差异亦具有显著性（t=7.843，df=10；p&#60;0.0001）。采用双因素方差分析（2-way ANOVA）对两种方法进行比较，结果显示处理因素具有显著效应（F(1,15)=45.21，p&#60;0.0001），但方法本身（F(1,15)=0.05545，p=0.8697）以及处理与方法的交互作用（F(1,15)=0.02785，p=0.8697）均无显著差异。此外，我们进一步验证了组蛋白 H3 水平在 WB 和流式细胞术检测中均未发生变化，双因素方差分析显示 LPS 处理（F(1,7)=0.02170，p=0.8870）、检测方法（F(1,7)=0.01191，p=0.9162）以及交互作用（F(1,7)=0.01191，p=0.9162）均无显著效应（图 6B）。本数据的代表性印迹图和直方图偏移示例也一并展示（图 6C、D）。
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65080/65080fig06.jpg" /> 
图6：流式细胞术与蛋白质印迹法在定量全基因组组蛋白修饰变化方面的比较。（A）BV2细胞在分析前经25 ng/mL脂多糖（LPS）或H2O处理24小时。H3K27Ac的荧光强度以磷酸盐缓冲液（PBS）对照组为基准，表示为倍数变化，流式细胞术与蛋白质印迹法结果均如此。双因素方差分析显示LPS处理具有显著效应（F(1,15)=45.21，p&lt;0.0001），但检测方法（F(1,15)=0.05545，p=0.8697）及交互作用（F(1,15)=0.02785，p=0.8697）无显著差异。对残差采用Tukey多重假设检验校正。*表示p=0.0332，**表示p=0.0021。（B）组蛋白H3&#160;的荧光强度以PBS组为基准，表示为倍数变化，流式细胞术与蛋白质印迹法结果均如此。双因素方差分析显示LPS处理（F(1,7)=0.02170，p=0.8870）、检测方法（F(1,7)=0.01191，p=0.9162）以及交互作用（F(1,7)=0.01191，p=0.9162）均无显著效应。（C）示例蛋白印迹图及（D）流式细胞术偏移图。直方图根据处于峰值荧光强度的细胞数量归一化为百分比。柱状图表示均值±标准误（SEM）。n=2个独立实验，每个实验每组2个重复。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/65080fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
综上所述，这些结果表明，该技术可用于定量评估分离的小胶质细胞中的全局组蛋白翻译后修饰水平。此外，该方法已被证明与先前的技术具有可比性，但所需细胞投入量显著更低。另外，尽管未在此展示，但通过适当的补偿，本技术可在同一检测面板上使用多种抗体，以同时评估不同的组蛋白翻译后修饰。
补充文件 S1：示例分析文件。 该文件包含一个 wsp 分析文件和 7 个 fcs 文件，其中包括未染色样本、P2RY12FMO、568FMO、两个经 PBS 处理的动物样本以及两个经 LPS 处理并用 H3K27Ac 染色的动物样本。本文件的目的是展示实验分析与设门策略，以呈现一次成功实验可能的结果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalS1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 S2：分离数据。该文件包含小胶质细胞分选后的相关数据，包括本方案所述的小胶质细胞数量及RNA产量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65080/SupplementalFileS2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>门控群体&#160;</td>
			<td>占父群比例</td>
			<td>占总体比例</td>
			<td>计数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>89.00%</td>
			<td>25672</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S2&gt;S1</td>
			<td>88.73%</td>
			<td>78.97%</td>
			<td>22779</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC+ &gt; S2 &gt; S1&#160;</td>
			<td>76.61%</td>
			<td>60.50%</td>
			<td>17452</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>610+ &gt; APC+ &gt; S2 &gt; S1</td>
			<td>99.56%</td>
			<td>60.24%</td>
			<td>17376</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2： 示例样本谱系图展示了准确检测蛋白质所需的百分比和事件数量。

本研究描述了一种利用细胞核内流式细胞术对分离自脑组织的小胶质细胞进行全基因组组蛋白修饰定量的实验方案。本研究还包含了用于数据采集的小胶质细胞分离方案。

基因表达的调控部分通过染色质结构的修饰实现，包括在翻译后水平对组蛋白等蛋白添加或去除化学修饰基团……

我们的研究旨在揭示控制大脑基因表达的基本调控机制。我们尤其关注这些机制的紊乱如何导致神经发育和神经精神疾病。我们致力于阐明遗传和环境风险因素如何相互作用，改变细胞功能并引发行为障碍。本方案包含对分离的小胶质细胞中组蛋白修饰进行高通量筛选的方法，使我们能够在开展高通量测序和后续功能研究之前，筛查数十种不同的表观遗传修饰。我们的方案可检测全局组蛋白修饰水平，类似于蛋白质印迹法（western blot）。然而，本技术速度更快、所需起始细胞数量更少、定量性更强，并且可实现多重检测。将分离的小鼠脑组织和每份脑组织对应的1毫升消化缓冲液分别置于冰上的培养皿中。使用洁净的手术刀片将脑组织彻底切成小块。用剪去尖端的塑料移液管，小心地将切碎的脑组织转移至预冷的24孔板中的各个孔内。用一张较大的透明柔性膜覆盖培养板，盖上盖子，在冰上孵育30分钟。随后，将消化后的脑组织溶液转移至预冷的7 mL玻璃Dounce匀浆器中，每个匀浆器内含5 mL冰冷的FACS缓冲液，并置于冰上。用松动的研杵轻轻匀浆每个脑组织，直至获得单细胞悬液。使用紧密研杵轻柔地研磨三到四次，以确保形成单细胞悬液，然后转移至15毫升聚丙烯管中。首先，在含有小鼠脑匀浆的15毫升聚丙烯管中加入2.125毫升等渗密度梯度液。再用FACS缓冲液将每根管子补至终体积为8.5毫升。轻轻倒置离心管20次以充分混匀。使用细刻度移液管，将4毫升粉红色37%密度梯度液轻柔地铺在下方，形成两层清晰的界面。更换移液管，再将2毫升蓝色70%密度梯度液轻柔地铺在37%层下方。将离心管转移至预冷至4°C的离心机中，在制动坡度设为最低档的条件下，以500×g离心20分钟。离心结束后，使用洁净的移液管弃去15毫升离心管顶部的髓鞘层。用另一支移液管小心收集密度梯度的上层部分，转移至一个新的洁净15毫升聚丙烯离心管中。接下来，将移液管沿试管壁缓慢旋转，收集样品中的所有细胞，同时收集免疫富集片段。将免疫富集片段转移至一个新的15毫升聚丙烯试管中。向试管中加入10毫升FACS缓冲液，洗涤样品。轻轻倒置试管20次以充分混匀。将试管放入预冷的离心机中，刹车坡度设为最低档，离心以沉淀分离得到的免疫细胞。将15毫升试管中富集的小鼠脑部免疫细胞沉淀转移至圆底96孔板。将培养板在500 × g条件下离心5分钟之后，通过轻弹去除上清液。用100 µL FACS缓冲液重悬细胞。然后从每个孔中转移10 µL至对照孔中。在500×g下离心5分钟。去除离心后细胞的上清液，加入50微升双倍浓度的FC阻断剂，在冰上孵育10分钟。现在，加入50微升抗体预混液（浓度为最终所需浓度的两倍），避光冰上孵育。然后向每孔加入200微升FACS缓冲液，在500×g离心5分钟。通过轻弹弃去上清液。然后用 300 微升 FACS 缓冲液洗涤细胞。离心后，将细胞重悬于 200 微升 FACS 缓冲液中。最后，将细胞悬液转移至含有 300 微升 FACS 缓冲液的流式分选管中。为了分析抗体组合，需确认流式细胞仪至少配备红、黄、蓝和紫四根激光器。使用补偿微珠或单染细胞对照建立补偿矩阵。为校准和标准化，在每次实验开始时运行彩虹荧光微珠，调节光电倍增管电压，直至微珠峰与先前实验的目标值对齐。为实验设置光电倍增管的电压和增益。然后使用抗体捕获的补偿微球建立补偿矩阵。接下来，在点图中以对数形式绘制侧向散射面积，以线性形式绘制前向散射高度。使用 S1 门排除碎片并根据细胞大小进行筛选。在前向散射光宽度与前向散射光高度的点图中，通过 S2 门选择单细胞。在设定荧光染料门时，应针对每种荧光染料通道使用相应的荧光减一对照（FMO）。通过单参数直方图，确定每个通道中的阳性信号，并据此设置门控。使用已建立的门控策略仔细记录样本。通过P2RY12阳性信号鉴定小胶质细胞，并仅针对小胶质细胞分析相应通道中的蛋白表达水平。在细胞仪分析软件用户界面中，通过复制记录过程中使用的相同设门策略来建立分析门。使用添加统计功能，在补偿后的通道高度上选择目标群体的中位数。利用表格编辑器将相应通道的MFI值导出至电子表格，以进行进一步的统计分析。在将MFI在各组内进行标准化后，脂多糖处理导致组蛋白H3赖氨酸27乙酰化水平升高。对染色细胞的直方图分析显示，细胞群体呈正态分布，并向荧光增强的方向发生偏移。在染色细胞中也观察到组蛋白H3赖氨酸27乙酰化的类似升高。

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