Name: 使用刺胞动物模式生物Clytia hemisphaerica表征体内上皮伤口愈合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 了解刺胞动物Clytia hemisphaerica体内上皮伤口愈合的实时成像方法。该技术通过显微注射染料和药物研究细胞迁移与组织修复机制，为理解复杂生物体的伤口愈合过程提供重要模型。

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E.E.L.L. 获得美国国家科学基金会 PRFB 2011010 项目资助。我们感谢 Tsuyoshi Momose 和 Evelyn Houliston 帮助我们建立钩手水母（Clytia）种群，Jean-Baptiste Reynier 提供显微伤口愈合图像，Harry Kyriazes 建造伪克雷塞尔培养装置（pseudo-kreisel tanks），以及 Elizabeth Baldo 对钩手水母栖息环境的日常维护。图1B 使用 BioRender.com 制作。

1. 动物培养
<ol>
	<li>维持水螅水母（Clytia）&#160;载玻片上的多足虫群体&#160;以及在人工海水（ASW）中的水母 18 &#176;C 在斑马鱼系统中，使用2 L斑马鱼养殖箱培养水螅体群体，以及使用定制的5 L伪克赖塞尔养殖箱培养水母（补充图1)51. ASW 由 4% 的 Instant Ocean 溶于去离子水（DI H₂O）制成2O.</li>
	<li>每天喂食动物2-3日龄的卤虫，具体方法如前所述51. 
	注意：如果动物近期未进食，则伤口愈合成像会更容易，因为此时从肠道释放到视野中的碎屑较少。</li>
	<li>根据需要，将水螅体群体置于盛有1升人工海水（ASW）的2升烧杯中过夜，以收集幼体水母。所有伤口愈合实验均使用2至3周龄的雌性水母。Clytia的繁殖方法已在其他文献中详细描述。51.</li>
</ol>
2. 伤口处理
<ol>
	<li>在细胞内及细胞间制造微伤口（20-500&#160;&#181;m2)
	<ol>
		<li>使用剪刀剪切移液管尖端，制成直径为0.5–0.7 cm的较大开口，以制备改良的转移移液管。 
		注意：移液管的开口应足够宽，以避免对动物造成任何损伤。</li>
		<li>使用改良的移液管将水母置于凹面载玻片上，使水母的外伞面向上，加入适量人工海水（ASW）以刚好浸没动物为宜。</li>
		<li>将盖玻片置于动物样本上并立即进行成像（成像方法见下文描述）。盖玻片会压迫中胶层，受压组织回弹时产生的力会使细胞轻微分离52。这会立即表现为细胞间的空隙以及部分细胞内部的损伤（图1B，B', 图2，以及 图3A-C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>创建小面积上皮伤口（0.02–0.125&#160;毫米2)
	<ol>
		<li>使用改良的移液管（如上所述），将水母置于凹面载玻片上，使水母的外伞面向上。</li>
		<li>使用一个 200 &#181;L 移液器吸头，轻轻刮擦水母表面。轻柔刮擦还可导致基底膜出现撕裂，这些撕裂清晰可见。22用盖玻片覆盖动物以进行成像。或者，有时仅放置盖玻片即可造成微小的上皮损伤，即使不进行划伤操作图1C，C', 图2，以及 图3A-C). 
		注意：刮擦水母表面时不要用力下压，否则会损伤细胞外基质并形成不规则表面——在不规则表面上迁移的上皮细胞更难保持聚焦。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>创建大型上皮伤口（0.5–0.9&#160;毫米2)
	<ol>
		<li>使用微量移液器拉制仪和玻璃毛细管制作显微注射针（步骤5.2）。将空的显微注射针插入固定在显微操作仪上的显微注射针持针器中。切割针尖，使针尖开口直径约为20-40 &#181;m. 
		&#8203;注意：用于大表皮伤口的切割针头可储存并重复使用，以提高实验间的一致性。</li>
		<li>将显微注射仪的维持压力设为零，喷射压力设为约20 PSI。将显微注射仪设置为输送持续2秒的空气脉冲。 
		注意：喷出压力可能需要根据针头开口的直径进行调整（即较细的针头使用较高的压力，较粗的针头使用较低的压力）。</li>
		<li>将水母伞面朝上放置于解剖显微镜载物台上的凹面载玻片中，加入适量人工海水（ASW）以刚好浸没动物。使用显微操作仪调节显微注射针尖，使其恰好位于液面之上。操作时，先将针尖小心浸入液体中（液体可能进入移液器尖端），随后将其回撤，使其接近水母上皮表面。 
		注意：应将尖端置于水母的一个象限区域上方。水母的辐射管将伞膜分为四个明显的象限。选择某一象限作为靶区可获得更清晰的成像效果，因为这样可使生殖腺和辐射管避开伤口区域。</li>
		<li>通过按压注射器上的启动按钮进行脉冲式吹气。根据针头宽度，在同一位置重复脉冲2至4次。较宽的针头需要较少的脉冲次数。 
		注意：应可见由空气脉冲在水面/水母体上造成的凹陷。</li>
		<li>用盖玻片覆盖受伤的动物以成像大面积伤口（图1D，D').</li>
		<li>按照以下步骤（第3节）进行上皮伤口愈合的成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig01.jpg" /> 
图1水母型克氏水母外伞上皮层的完整与损伤区域。（A） 水母型腔肠动物克氏水母身体结构示意图 (A') 从上方观察的完整水母外伞上皮组织。 （B） 卡通示意图&#160;单细胞微损伤（红色锯齿状结构），上皮细胞呈蓝色。 (B') 单细胞微损伤 (C) 小上皮伤口（红色锯齿状）示意图。 (C') 小型上皮伤口。 (D) 大面积上皮伤口示意图（红色锯齿状图形）。 (D') 大型上皮伤口。所有图像均使用微分干涉差（DIC）显微镜获取。（中的比例尺A'-C'): 50 &#181;m. 标尺在（D'): 100 &#181;m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig02.jpg" /> 
图2：多种尺寸的伤口及受损的基底膜。 图示为一个典型的小型伞状表皮伤口，标签指示了由边缘细胞形成的片状伪足。此外，可见上皮细胞内部及细胞之间的微小伤口。请注意伤口上部存在基底膜的小范围撕裂。视频4展示了该伤口的愈合过程。比例尺：50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 上皮伤口愈合的成像
<ol>
	<li>确保显微镜已校准科勒照明53&#160;，并正确设置用于微分干涉差显微镜（DIC）观察54。使用标准光学系统时，上皮细胞几乎不可见（图3D、E）。</li>
	<li>将焦距调整至上伞层。尽管该层较薄，但六边形细胞应清晰可见。 
	注意：上伞层与下伞层之间由一层厚的中胶层分隔，中胶层由垂直纤维支撑。下伞层细胞与辐射管处于同一焦平面。若初始聚焦于下伞层，则需缓慢调节焦距，穿过中胶层和垂直纤维，直至找到上伞层。</li>
	<li>手动识别需成像的伤口。对于较大伤口，使用10倍物镜；对于较小伤口及单细胞伤口，使用20倍物镜。</li>
	<li>启动一个可实时连续采集图像形成视频，或按固定时间间隔采集一系列图像的程序。监测成像过程，确保伤口区域不偏离视野，且目标细胞始终保持在焦平面内。
	<ol>
		<li>单细胞伤口通常在1分钟内闭合，因此应以视频形式记录其闭合过程。</li>
		<li>为捕捉小伤口细胞动态的细节，建议每约10秒采集一次图像。小伤口的闭合时间根据大小不同，通常为20–50分钟。</li>
		<li>未封片的载玻片成像时间不应超过45分钟，因为随着时间推移，载玻片上的水分蒸发会导致动物死亡及细胞破裂。</li>
		<li>若需更长时间观察，可用凡士林密封盖玻片周围以减少蒸发。 
		&#8203;注意：某些水母在载玻片上可能发生脉动，干扰成像。此时，将动物置于人工海水（ASW）中含1%氨基甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine）的1:10稀释液中（pH调至7.5），可有效起到麻醉作用，且在1小时内对愈合过程无明显影响。然而，若动物在Tricaine中放置数小时，则会死亡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig03.jpg" /> 
图3：在伞外上皮制造微小伤口。（A）使用200 µL移液器吸头轻轻刮擦伞外表面，以制造微小&#160;上皮伤口。（B）有时放置盖玻片本身已足以造成微小上皮损伤。（C）水母固定于凹面载玻片上。（D）未使用微分干涉相差（DIC）光学系统的微小上皮伤口图像，以及（E）使用DIC光学系统的图像。比例尺：50 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 分析
<ol>
	<li>准备图像文件 
	注意：为了处理图像文件，请使用已更新 BioFormat 插件的 FIJI/ImageJ 软件。
	<ol>
		<li>在对图像堆栈进行配准之前，将比例尺设置为正确的像素/微米比值；分析 &#62; 设置比例尺。此步骤对于在后续分析中提取实际尺寸测量值是必要的。</li>
		<li>动物样本在显微镜载玻片上常会发生轻微漂移；因此，为消除视频中的漂移现象，需使用 FIJI 插件“基于 SIFT 的线性堆栈配准”对图像进行配准。插件 &#62; 配准 &#62; 基于 SIFT 的线性堆栈配准。</li>
		<li>将配准后的堆栈保存为 .avi 文件。文件 &#62; 另存为 &#62; AVI… 在弹出窗口中设置帧率（本文中的动画图设置为 10 fps），然后点击 确定。使用此输出文件进行伤口愈合分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>伤口面积分析
	<ol>
		<li>在 FIJI/ImageJ 中使用套索工具，沿细胞边缘描记伤口轮廓。使用 Command+M 或 CTRL+M 测量刚刚勾画出的伤口面积。</li>
		<li>每隔 10 帧重复一次伤口面积测量。随后可使用 Prism 9 绘制 FIJI/ImageJ 的测量结果（图 4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig04.jpg" /> 
图4：小型上皮伤口伤口面积的分析。（A） 小型上皮伤口在10分钟内的愈合示例 （B） 不同上皮伤口在21分钟内的愈合示例。紫色轮廓表示 A，B 与使用 FIJI/ImageJ 中的套索工具测量伤口面积的结果相当。 (C) 随时间推移伤口面积的标准化缩小 A. (D) 随时间推移伤口面积的标准化缩小 B. (E) 14个小型伤口随时间变化的平均面积减小情况。n = 14。误差条表示均值上下标准差 &#177; 扫描电镜。比例尺： 50 &#181;m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
5. 中胶层注射
<ol>
	<li>制作注射皿
	<ol>
		<li>将聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底与固化剂按重量比10:1混合，制备聚二甲基硅氧烷。充分搅拌，使基底与固化剂完全混合。</li>
		<li>为去除气泡，将混合物置于真空干燥器中抽气15分钟。将混合物倒入直径60 mm的培养皿中，并用微量离心管管盖固定模具位置。立即将模具放置在管盖上 45&#176; 斜置并用胶带固定。该模具由三块堆叠且相互错位的玻璃载片粘合而成，用于在最终的注射培养皿中形成脊状结构。</li>
		<li>将整个培养皿、模具及混合物放入烘箱中 60 &#176;C 孵育2小时以固化弹性体。移除模具，获得完整的注射盘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微移液管拉制
	<ol>
		<li>使用微电极拉制仪设计拉制程序。采用单步程序并设置为高速。加热温度约为玻璃体斜率测试结果55,56检查所得的微移液管是否具有长而均匀的锥度。 
		注意：使用外径为1.0 mm、内径为0.75 mm、长度为10 cm的薄壁玻璃硼硅酸盐毛细管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染料与药物的注射
	<ol>
		<li>制作显微注射针（同上）。</li>
		<li>使用长枪头移液器吸取过量的染料或药物，回填至显微注射针中，用于水母的注射。 
		注意：适用于Clytia, 二甲基亚砜&#160;（DMSO）应保存在 &#60;用ASW进行1:100稀释，因为较高浓度的DMSO会阻碍伤口愈合。若注射透明溶液，可加入快绿FCF溶液（将0.1%快绿FCF用ASW稀释1:100）以可视化注射液体。</li>
		<li>使用如上所述的改良型移液管，将伞下侧朝上的水母放入PDMS注射培养皿中，加入适量人工海水（ASW）以刚好浸没动物为宜（图5C将培养皿置于解剖显微镜的载物台上。 
		注意：限制过量人工海水可防止水母在培养皿中游动，从而提高注射成功率。</li>
		<li>将显微注射针尖对准水母附近的区域，并将其插入水中。使用显微操作器将针头压入培养皿，直至其弯曲并断裂。该针尖开口直径约为10-20 &#181;m. 
		注意：当天可重复使用该针头进行相同的染料/药物注射。建议每天使用新的针头，并在注射不同染料/药物时更换针头。</li>
		<li>使用显微操作仪，将针尖穿过伞下腔进入中胶层，注意不要刺破外伞层。 
		注意：上皮组织会出现明显的皱褶/折叠现象。一旦将针头插入水母体内，皱褶/折叠现象便会消失。</li>
		<li>在显微注射仪上，将维持压力设为零，喷射压力设为≤20 PSI。向一个或两个象限内注射，每个象限内注入染料或药物，液滴面积约为该象限面积的1/4。 
		注意：根据水母的大小，单次注射位点应使用相应较大或较小的注射体积。注射过量会导致上皮组织严重损伤，甚至导致动物死亡。</li>
		<li>根据所注射的染料或药物，将动物置于盛有新鲜人工海水（ASW）的烧杯中，以促进染料或药物的扩散与孵育。</li>
		<li>成像时，使用改良的移液管将水母转移到凹面载玻片上，使动物的外伞面向上放置图5）。可在该阶段对动物进行损伤处理，以检测注射试剂的效果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig05.jpg" /> 
图5：向细胞外基质（ECM）注射染料或药物的装置示意图。（A）注射装置示意图。（B）注射装置的放大图，显示显微注射针的方向（相对于培养皿中的动物体，角度约为45°）。（C）硅胶注射培养皿的放大图，其中水母置于少量人工海水（ASW）中以进行注射。（D）装载了快绿FCF（Fast Green FCF）的显微注射针经由伞下腔进入水母中胶层。（E）固定后的水母在注射快绿FCF后的状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

无任何披露内容。

此处介绍了伤口成像的方法学 体内 在水螅水母（Clytia）中，一种相对较新的无脊椎动物模式生物40,43,58该系统之所以成为一种独特且强大的研究工具，与其他用于研究伤口愈合和再上皮化的模型不同，主要有以下几个因素。首先，单层上皮附着于透明的细胞外基质（ECM）上，因而更接近于 体外 组织培养实验图1, 图2, 图3, 图&#160;4）。如同在 体外 检测、细胞可在高分辨率下成像。然而，与组织培养不同的是，其具有真实的细胞环境和细胞外基质（ECM），因此可以在活体受伤动物所发生的复杂信号事件背景下观察伤口愈合过程。其次，Clytia 缺乏炎症反应、迁移性成纤维细胞、血管和血液，这使得再上皮化过程&#160;待研究 体内 在更复杂的成年动物伤口愈合过程中所发生的重叠事件不存在的情况下59第三，细胞外基质是无细胞的（补充视频 1）且体积较大，便于显微注射针进入图5 和 图&#160;6）。利用该方法，研究人员可以检测干扰细胞外基质（ECM）结构或信号通路的药理学试剂对伤口愈合的影响。 体内试剂也可被引入上皮细胞，以研究其对 在体内 可以评估伤口愈合情况。第四，目前已建立针对Clytia系统的突变体和转基因动物的实验方案。42,43,44,45. 在体 因此可以在目的基因表达升高或降低的动物中观察伤口愈合情况。
该技术包含若干关键步骤。首先，如图3所示，必须使用正确配置了微分干涉差（DIC）显微镜的显微镜系统，因为扁平且透明的上皮细胞在标准明场光学显微镜下几乎不可见&#160;。其次，掌握轻柔损伤动物个体的技巧也至关重要&#160;，以确保上皮组织受损的同时不破坏下方的细胞外基质（ECM）。在向ECM中进行微量注射时，同样需要保持轻柔的操作，因为在注射过程中若对动物造成严重损伤，可能会影响后续伤口愈合过程的分析。尽管这些技术存在一定的学习曲线，但即使是初学者也能在Malamy实验室中迅速掌握。事实上，这些实验方案已被用于芝加哥大学的本科生实验课程中，以演示细胞迁移现象。
为了获得最佳成像效果，必须确保动物不发生移动&#160;，且选定的伤口区域不偏离视野。如果动物出现脉动现象，按照所述方法使用Tricaine处理非常有效。对于样本漂移的情况，通常需要手动重新调整样本位置。这些运动可通过FIJI/ImageJ中的图像配准功能在最终视频中予以消除。
该系统的局限性在于无法制造出完全相同的伤口，因为使用此处所述方法产生的伤口在形状和大小上均存在差异。因此，准确量化伤口闭合或细胞迁移的速率可能较为困难。位置标记物（如碳颗粒）可附着在受伤动物暴露的细胞外基质上&#160;，可用于测量大伤口中集体细胞迁移的速率（未展示）。对于小伤口闭合的分析，即使伤口的大小和形状存在变异，此类尺寸的伤口闭合速率仍处于有限的范围内（图4）。因此，仍可定量检测促进性或抑制性药理学试剂的作用效果。
尽管本研究仅采用微分干涉差（DIC）显微镜来描述伤口愈合的特征，但相同的方法也可用于荧光或共聚焦显微镜下的愈合成像。为此，已有实验方案可用于构建转基因动物，使其特定的细胞内和细胞外蛋白带有荧光标记。结合DIC与荧光的同步成像，并利用药理学试剂或突变品系对伤口愈合过程进行干预，将是深入理解上皮组织伤口愈合机制的有力策略。

上皮细胞层覆盖所有后生动物的外表面，衬于内脏器官内部，并将动物体分隔成不同的区室。上皮组织还将机体内部与外部环境分隔开来，保护其免受损伤和感染。因此，上皮层的出现是多细胞动物进化过程中的关键环节，从脊椎动物到最原始的后生动物，所有动物中均可见上皮层1。某些器官的上皮为单层结构，例如肺泡、血管和肠道2，以及扁形动物和刺胞动物等无脊椎动物的表皮3。而在其他组织中，如脊椎动物的皮肤4和角膜5，上皮则为复层结构，即包含多层上皮细胞2。在所有情况下，最深层的上皮层均附着于基底膜，这是一种蛋白质层，构成细胞外基质（ECM）的特化区域6,7,8。
上皮层一旦发生破损，必须迅速修复以重建连续的上皮结构。上皮损伤可发生于自然生理过程，例如肠道上皮细胞的脱落9,10，也可由炎症或物理性创伤引起。当单个上皮细胞受损时，该细胞必须自我修复，或被清除，以便周围细胞相互连接并封闭缺损区域11,12。在大于单个细胞尺寸的伤口中，上皮细胞必须移动以相互接触并修复上皮层13。若缺损较小，可通过细胞铺展实现修复；而较大伤口则需要边缘的上皮细胞迁移至伤口区域以闭合缺损，后者这一过程称为再上皮化14,15。在胚胎组织中，上皮细胞通过铺展和迁移来闭合伤口，或由伤口边缘细胞间形成的肌动球蛋白束收缩牵拉细胞跨越缺损，其机制类似于束带收拢16。在许多成体组织中，再上皮化涉及连贯的细胞片层迁移，期间细胞维持与邻近细胞的连接14,17,18。而在其他组织中，细胞间连接被解离，上皮细胞行为更类似于间充质细胞，在再上皮化过程中以协调但独立的方式迁移进入伤口区域14,19,20,21。
上皮细胞的移动受到迁移细胞之间以及细胞与细胞外基质（ECM）之间复杂相互作用的调控。尽管已有大量实验文献研究了伤口激活上皮细胞及其后续迁移的机制，但仍有许多问题有待揭示。例如，激活上皮细胞以响应伤口而启动迁移的初始信号尚未被明确鉴定22，目前也尚未完全阐明肌动蛋白如何被重新分布，从而在靠近伤口侧的上皮细胞边缘形成片状伪足22,23,24,25,26,27。集体细胞迁移需要将来自伤口处细胞的信息传递给远离伤口的细胞，但这一通信通路仍不清楚28。当上皮细胞层发生重排时，细胞间连接和细胞与ECM的附着必须被解聚并重新形成，但该过程的调控机制仍知之甚少14,29。推进这些及其他相关问题的研究不仅具有重要的基础生物学意义，也具有重要的临床价值，因为正确的伤口愈合过程至关重要。上皮细胞迁移能力受损会导致慢性伤口；例如遗传性疾病大疱性表皮松解症（epidermolysis bullosa），其参与上皮细胞与ECM附着的基因发生突变，导致皮肤脆弱，易剥脱和起疱。在自然衰老的组织中，再上皮化过程同样受到损害30,31。因此，深入理解这些机制对于开发改善伤口愈合效果的干预措施至关重要。
伤口愈合过程中上皮细胞的迁移已被通过以下方法研究 体外 方法与模式生物。大多数关于伤口愈合及细胞迁移机制的研究均在组织培养中进行，其中单一类型的上皮细胞在替代细胞外基质（ECM）的基底上形成单层培养。通过划痕或使用模板培养的方式在细胞单层中制造特定形状和大小的间隙，随后进行观察。32,33,34。该 体外 模型能够理想地可视化细胞行为，同时可改变基质特性，使细胞暴露于药物及非生物和生物因素中，并利用表达或抑制特定目的基因的载体对细胞进行转染。然而，这种还原论方法可能无法完全捕捉上皮细胞在体内的某些重要行为参数 体内 微环境，包括不同类型细胞之间的通讯以及细胞外基质（ECM）中发生的信号传导事件11. 在体 模型提供了具有多种细胞类型、相互交错的信号通路和复杂细胞外基质的真实伤口环境35用于伤口愈合研究的模型之一是小鼠19，其中近期的技术进步使研究人员能够在活体动物中观察全层伤口愈合过程中的表皮细胞36小鼠及其他 体内 然而，这些系统在研究再上皮化过程时仍存在挑战。首先，尽管能够在自然环境中观察细胞行为具有显著优势，但脊椎动物伤口愈合过程中存在多种时间上重叠的复杂事件，包括血液凝固、免疫细胞募集与炎症反应、成纤维细胞招募、细胞去分化、血管再生以及细胞外基质（ECM）的重塑，这些因素共同增加了研究的复杂性。此外，不透明的组织也使得成像困难。 黑腹果蝇 幼虫和斑马鱼表皮系统37,38 由于其相对简单，已克服了其中一些困难39.
我们实验室最近提出了一种研究上皮伤口愈合的新模型：水螅纲刺胞动物Clytia hemisphaerica（Clytia）的水母体（水母形态）40。Clytia 是一种新兴的模式生物，具有完全测序并注释的基因组41、单细胞 RNA 测序转录组数据42，以及已建立的基因组编辑技术方案（包括诱变和转基因）43,44,45。刺胞动物是现存最早具有上皮层的生物谱系之一，因此研究刺胞动物的伤口愈合有助于揭示保障上皮完整性的祖先级分子通路。对于在生命演化树中保守保留的这些通路而言，Clytia 为在活体（in vivo）条件下研究上皮细胞动态行为及伤口愈合的功能调控提供了一个极具前景的新体系。
覆盖在水螅水母（外伞面）上表面的上皮是一层透明的扁平上皮细胞，单层排列，宽约 50 µm，厚约 1–2 µm（图 1）。这些细胞附着在一种称为中胶层的细胞外基质（ECM）上——也就是水母的&#34;胶质&#34;部分。中胶层在组成上与其他动物（包括脊椎动物）体内的细胞外基质相似46,47,48&#160;，具有基底膜40，并且完全透明。在&#160;Clytia 水母中，该上皮层容易被刮伤或造成损伤（见下文）。上皮和细胞外基质的结构简单且透明，使得在愈合过程中能够对细胞及其运动进行高分辨率成像。最近，Kamran 等人详细表征了 Clytia 上皮中小伤口的愈合过程40。研究表明，Clytia 的愈合机制包括基于片状伪足的细胞爬行、细胞铺展和集体细胞迁移，以及更常见于胚胎系统的拉链式闭合机制（尽管此前已在成体动物结构如角膜中观察到49）。Clytia 的伤口愈合速度极快，这与缺乏炎症反应的其他系统中观察到的现象一致40,50。Clytia 外伞面的愈合完全依赖于现有上皮细胞的运动——没有细胞在细胞外基质中增殖或迁移至伤口部位（补充影片 1）。所有这些发现表明，Clytia&#160;是研究上皮伤口愈合的一个有用模型系统。事实上，Clytia 在伤口愈合过程中对上皮细胞成像的便利性，促成了如下发现：只要基底膜保持完整，上皮细胞的片状伪足就会延伸并铺展到暴露的细胞外基质区域；而一旦基底膜受损，上皮愈合则会切换为拉链式闭合机制40。这是首次揭示细胞选择通过片状伪足爬行还是拉链式机制闭合伤口的潜在机制，突显了特定细胞与细胞外基质相互作用在愈合过程中的重要性，以及在自然环境中观察细胞行为的必要性。
以下描述了创建和成像单细胞微损伤、主要通过细胞铺展闭合的小伤口以及需要集体细胞迁移才能闭合的大伤口的实验方案。此外，还介绍了一种将小分子引入细胞外基质和上皮细胞的方案，从而可对伤口愈合的假定调控通路进行实验性干预。

<table><tbody><tr><td>20500 ACE EKE 显微镜光纤光源</td><td>Kramer Scientific Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam 506 mono</td><td>ZEISS</td><td>426557-0000-000-MA285</td><td></td></tr><tr><td>毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW1004</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素 B</td><td>Abcam</td><td>ab143482</td><td></td></tr><tr><td>凹面载玻片</td><td>Amscope</td><td>BS-C12</td><td></td></tr><tr><td>配备微分干涉（DIC）选项和荧光卤素灯的 DMR 显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td></td></tr><tr><td>快绿 FCF</td><td>Thermo Scientific</td><td>A16520-06</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Biotium</td><td>70022</td><td>激发/发射波长：480/598 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>激发/发射波长：361/497 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器吸头（0.5–10 &amp;mu;L / 2–20 &amp;mu;L）</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>World Precision Instruments</td><td>3301R / M3301L</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片（22×40-1.5）</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-BP</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（60 mm × 15 mm）</td><td>Fisherbrand</td><td>FB085713A</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle v2</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>气动 PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯真空干燥器</td><td>Bel-art</td><td>F42025-0000</td><td></td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEDI Sv11 解剖显微镜</td><td>ZEISS</td><td>STEDI SV11</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184</td><td>Dow Silicones</td><td>1024001</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Z-Hab mini 系统</td><td>Pentair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN 显微镜软件</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

表征上皮伤口愈合 体内 使用刺胞动物模式生物 clytia hemisphaerica

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

所有动物器官，从皮肤、眼睛到肠道，均被上皮细胞层所覆盖，这些细胞层在防止感染的同时帮助维持机体稳态。因此，上皮组织伤口的修复能力对所有后生动物而言至关重要并不令人意外。脊椎动物的上皮伤口愈合涉及多个重叠的过程，包括炎症反应、血管生成以及再上皮化。这些过程的调控依赖于上皮细胞、邻近细胞与细胞外基质（ECM）之间复杂的相互作用；ECM包含结构蛋白、调节蛋白以及活性小分子。由于这种复杂性，加之大多数动物组织不透明且ECM难以接近，使得在活体动物中研究伤口愈合过程十分困难。因此，大量关于上皮伤口愈合的研究是在组织培养系统中进行的，即将单一类型的上皮细胞接种于人工基质上形成单层细胞。 Clytia hemisphaerica (Clytia) 为这些研究提供了独特而富有启发性的补充，使得上皮伤口愈合能够在具有真实细胞外基质（ECM）的完整动物体内进行研究。Clytia 的外胚层上皮由单层大型扁平上皮细胞构成，可在活体动物中利用微分干涉差（DIC）显微镜实现高分辨率成像。由于缺乏迁移性成纤维细胞、血管系统以及炎症反应，因而能够清晰解析再上皮化过程中的关键事件 体内可以分析多种类型伤口的愈合过程，包括单细胞微损伤、小范围和大范围上皮伤口以及损伤基底膜的伤口。该系统可观察到片状伪足形成、收缩环收缩、细胞伸展以及集体细胞迁移等现象。此外，可引入药理学试剂 通过 细胞外基质以调控细胞-细胞外基质相互作用及细胞过程 体内本研究展示了在活体水螅水母（Clytia）中制造伤口、记录愈合过程的影像，以及通过向细胞外基质（ECM）显微注射试剂来探究愈合机制的方法。

按照上述方案，对单细胞微损伤、小伤口和大伤口进行了成像。配准后的图像序列被保存为 .avi 文件。
在视频1中，可见微小伤口在细胞之间和细胞内部闭合（图1 和 图2）。伤口闭合过程中可观察到小型片状伪足，随后发生收缩并愈合。碎片被排除并释放到水中。愈合过程在一分钟或更短时间内完成。
在影片2和3中，不同形状的小伤口通过片状伪足的形成、片状伪足接触的延伸以及伤口边缘细胞的铺展而愈合，如先前所述40（图1和图2）。位于边缘细胞后方数层的细胞不参与此类尺寸伤口的愈合&#160;，也未观察到集体细胞迁移现象。上皮缺损的快速且持续性闭合随后伴随着沿新形成伤口缝合线的组织收缩40。这两个伤口的标准化愈合速率以随时间变化的原始面积百分比表示，结果如图所示（图4C、D）。尽管伤口闭合的动力学存在一定变异性，但对14个不同形状、面积范围为0.02–0.125 mm2的伤口随时间的闭合面积百分比进行平均，可建立未处理动物中伤口愈合的平均曲线（图4E）。
当基底膜受损时，其损伤情况可以清晰可见（图2）。在视频4中，小伤口边缘的细胞在基底膜受损区域周围发生铺展，并通过束带样收缩完成缺损闭合。
如果组织脱水或损伤过于严重而无法修复，细胞运动可能会停止，或者整个细胞层可能破裂（影片 5 和 影片 6）。这种情况通常发生在长时间成像后（45 分钟或更长）。如果在成像早期即发生细胞破裂，则弃用该样本。
如视频7所示，大面积伤口的愈合经历多个阶段。首先，伤口边缘由于边缘区域的收缩而变得平滑且规则，这与先前报道的结果一致57。随后，可见伤口边缘的细胞形成伪足，并向前移动，以最大限度地与相邻细胞的伪足接触。通过对伤口边缘及边缘后方数层细胞的细胞核进行追踪，发现大间隙的闭合是通过集体细胞迁移实现的40。细胞从不脱离，而是作为一个整体以片层形式共同移动。
引入染料和药理学试剂是解析生物学机制的有力工具。许多物质无法进入钩手水母（Clytia）体内（未展示），这可能是因为动物体表覆盖有一层黏液。然而，可通过显微注射将分子直接导入细胞外基质（ECM），从而破坏ECM结构或干扰其内部的调控活性。此外，染料和其他分子能够从基底侧进入上皮细胞。例如，图6展示了在将试剂显微注射至ECM后，使用Hoechst进行细胞核染色、FM1-43进行膜染色，以及细胞松弛素B抑制片状伪足形成的实验结果。在损伤前将这些分子引入ECM和上皮细胞，可&#160;开展用于检测药理学工具对愈合过程影响的实验。
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig06.jpg" /> 
图6：染料或药理学试剂显微注射后水母的上皮细胞。（A） 上图显示注射20 µM Hoechst（细胞核）和50 µM FM1-43（细胞膜）后5分钟的上皮细胞。（B，C） 注射1:1,000 DMSO对照（B）或100 µM细胞松弛素B（C）后的伤口愈合情况。伤口于注射后15分钟制造，图像拍摄于损伤后5分钟。细胞松弛素B抑制了片状伪足的形成。伤口区域细胞间常观察到的“纤维”结构被认为是基底膜受张力拉伸所致——这些结构不被鬼笔环肽染色（未显示）。比例尺：50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1：单细胞微创伤愈合的延时影像。 历时：20 秒。帧率：10 fps。比例尺：50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie1.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：小型上皮伤口愈合的延时视频。 经过时间：9 分 54 秒。帧率：10 fps。比例尺：50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie2.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 3：小型上皮伤口愈合的延时视频。 此伤口比视频 2中的伤口更大且形状更不规则。经过时间：20 分 54 秒。帧率：10 fps。比例尺：50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie3.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 4：伴有基底膜撕裂的小伤口和微小伤口愈合的延时视频。 片状伪足在基底膜撕裂处周围扩散，尽管它们可以在细胞外基质的其他区域上前进。一旦基底膜受损的伤口区域被细胞包围，收缩环机制会拉动细胞覆盖该区域。经过时间：19 分 4 秒。帧率：10 fps。比例尺：50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie4.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 5：小型上皮伤口中细胞的死亡。 细胞死亡可能是由于动物脱水所致。经过时间：4 分 24 秒。帧率：10 fps。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie5.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 6：一个小的上皮伤口未能完成愈合。 经过时间：42 分 32 秒。帧率：10 fps。比例尺：50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie6.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 7：大面积上皮伤口愈合。 经过时间：25 分 29 秒。帧率：10 fps。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie7.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充图1：Clytia培养箱尺寸示意图 定制水母养殖箱的三维可视化 （A） 正面与背面视图。 （B） 侧面视图。图中绿色部件的切口处覆盖有尼龙网。&#160;水直接流入网片上方，流经网片表面并形成环形水流。&#160;水通过末端蓝色部件上的孔流出系统。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充视频 1：水螅水母中的无细胞细胞外基质。 使用共聚焦显微镜拍摄的水螅水母 Z 轴层扫图像。该层扫图像最初聚焦于外伞面，随后每隔 10 µm 扫描穿过细胞外基质，直至板状内胚层和内伞面。微分干涉差（DIC）图像（左）与 Hoechst 核染色图像（右）显示细胞外基质中无细胞存在。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalMovie1.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种在活体上皮组织中制造伤口的方法 Clytia hemisphaerica 高分辨率下水母与图像伤口愈合 体内此外，还介绍了一种在上皮细胞和细胞外基质伤口愈合过程中引入染料和药物以干扰信号传导过程的技术。

表征上皮伤口愈合 体内 使用刺胞动物模式生物 Clytia hemisphaerica

所有动物器官，从皮肤、眼睛到肠道，均被上皮细胞层所覆盖，这些细胞层使器官能够在……的同时维持稳态

本方案可在活体动物中实现伤口愈合过程中上皮细胞的可视化观察，使我们能够了解细胞在其天然复杂环境中的行为。该技术将试剂导入细胞外基质和细胞质内，以研究这些试剂对活体动物伤口愈合过程中细胞铺展和迁移的影响。上皮伤口愈合以及水母纲生物克氏水母（Clytia）的愈合过程与更复杂动物的愈合过程极为相似。因此，我们可以从这一系统中深入了解伤口愈合的机制及其演化起源。本次实验操作将由伊丽莎白·李（Elizabeth Lee）和研究技术员艾米丽·瓦托（Emily Watto）进行演示。开始进行创伤处理时，先通过剪刀剪切移液管尖端，制备一支改良的转移移液管，使其形成一个直径约为0.5至0.7厘米的扩大开口。使用该改良的转移移液管，将从已建立的水螅体群体中采集的水母置于凹面载玻片上，确保水母的伞部朝上。加入适量的人工海水（ASW），以刚好浸没动物为宜。为了在细胞内和细胞间制造微小伤口，将盖玻片置于动物体上。盖玻片会压缩中胶层，压缩组织的回弹作用会使细胞轻微分离。立即对动物进行成像，以观察所形成的微小伤口。为制造微小的上皮伤口，使用改良的转移移液管将水母置于凹面载玻片上，使水母的伞面向上，操作方法如前所述。用200微升移液器吸头轻轻刮擦水母表面，轻柔的刮擦可能在基底膜上造成撕裂。用盖玻片覆盖动物以进行成像。放置盖玻片有时足以产生微小的上皮伤口，即使不进行划伤操作也是如此。使用微量移液器拉制仪和玻璃毛细管，按照文中所述步骤制备显微注射针。将空的显微注射针放入固定在显微操作器上的显微注射针夹持器中，并切割针尖，使开口直径约为 20 至 40 微米。将显微注射仪的持针压力设为零，喷射压力设为约 20 磅每平方英寸。设置显微注射仪以释放持续两秒的气流脉冲。为制造较大的上皮伤口，将水母置于凹面载玻片上，操作方法如前所述。使用显微操作仪，通过将显微注射针尖小心浸入水中后回撤，调整针尖位置，使其刚好位于水面之上，并接近水母的上皮表面。按下注射仪的“开始”按钮，释放空气脉冲。根据尖端的宽度，在同一位置重复脉冲两到四次。较大的尖端需要较少的脉冲。对于大面积伤口成像，用盖玻片覆盖受伤的动物。将焦距调整至 x umbrella。六边形细胞应清晰可见。手动识别一个伤口以对其进行成像。启动一个能够实时以电影形式采集图像的程序，或一个以固定时间间隔采集一系列图像的程序。监测实验进程，确保伤口区域不偏离视野范围，且目标细胞始终保持在焦平面内。如需注射染料或药物，请按照文中所述步骤制备显微注射针。使用长枪头移液器，将过量的染料或药物吸入显微注射针中，以备向水母体内注射。利用改造过的移液管，将伞下腔朝上的水母放入聚二甲基硅氧烷（PDMS）注射培养皿中，加入适量人工海水（ASW）以刚好覆盖动物体。将培养皿置于解剖显微镜的载物台上。聚焦于显微注射针的尖端，并将其推进到水母附近的水中。使用显微操作器将针头压入培养皿，直至其弯曲并折断，形成一个直径约为10至20微米的开口。使用显微操作仪，将针尖穿过伞下腔进入中胶层，注意不要刺破X伞。在显微注射仪上，将维持压力设为零，注射压力设为低于或等于20磅每平方英寸。向一个或两个象限内注射，使每个象限内染料或药物的着色区域大约占该象限面积的四分之一。根据所注射的染料或药物不同，将动物放入盛有新鲜人工海水（ASW）的烧杯中，以促进染料或药物的扩散和孵育。进行成像时，使用改良的转移移液管将水母转移到凹面载玻片上，使动物的伞部朝上放置。在此阶段可对动物进行损伤处理，以检测所注射试剂的作用效果。细胞内及细胞间的微小伤口在愈合过程中形成了小的片状伪足。随后发生收缩，伤口在不到一分钟内愈合。小的上皮伤口也通过片状伪足的形成以及片状伪足接触的延伸而实现愈合。快速且持续的伤口闭合先于新形成伤口边缘处的组织收缩。以随时间变化的伤口总面积百分比表示的两个小伤口的标准化愈合速率，显示出伤口闭合动态存在一定的变异性。来自14个不同伤口的数据被用于建立未经处理动物的平均伤口愈合曲线。在具有基底膜损伤的小伤口中，边缘细胞会向损伤区域周围扩散，并通过束带样收缩闭合缺口。当组织脱水或损伤过于严重而无法修复时，细胞运动可能停止，或整个细胞层可能发生破裂。大面积伤口的愈合则经历多个阶段。伤口边缘收缩后边缘变得平滑，形成片状伪足，并在距离边缘数个细胞层的位置延伸片状伪足接触，促进集体细胞迁移，从而闭合较大的间隙。通过将试剂显微注射到细胞外基质（ECM）中实现细胞核和细胞膜的染色。显微注射细胞松弛素B可抑制损伤后片状伪足的形成。轻柔地操作动物。注射试剂时，确保显微注射针的尖端位于中胶层内，且未完全穿透动物体。目前，正在利用带有荧光标签蛋白的转基因动物，结合荧光显微镜与微分干涉差显微镜，可更清晰地观察上皮伤口愈合过程中的细胞事件。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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表征上皮伤口愈合体内使用刺胞动物模式生物 Clytia hemisphaerica

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