表征上皮伤口愈合 体内 使用刺胞动物模式生物 Clytia hemisphaerica

本方案可在活体动物中实现伤口愈合过程中上皮细胞的可视化观察，使我们能够了解细胞在其天然复杂环境中的行为。该技术将试剂导入细胞外基质和细胞质内，以研究这些试剂对活体动物伤口愈合过程中细胞铺展和迁移的影响。

上皮伤口愈合以及水母纲生物克氏水母（Clytia）的愈合过程与更复杂动物的愈合过程极为相似。因此，我们可以从这一系统中深入了解伤口愈合的机制及其演化起源。本次实验操作将由伊丽莎白·李（Elizabeth Lee）和研究技术员艾米丽·瓦托（Emily Watto）进行演示。

开始进行创伤处理时，先通过剪刀剪切移液管尖端，制备一支改良的转移移液管，使其形成一个直径约为0.5至0.7厘米的扩大开口。使用该改良的转移移液管，将从已建立的水螅体群体中采集的水母置于凹面载玻片上，确保水母的伞部朝上。加入适量的人工海水（ASW），以刚好浸没动物为宜。

为了在细胞内和细胞间制造微小伤口，将盖玻片置于动物体上。盖玻片会压缩中胶层，压缩组织的回弹作用会使细胞轻微分离。立即对动物进行成像，以观察所形成的微小伤口。

为制造微小的上皮伤口，使用改良的转移移液管将水母置于凹面载玻片上，使水母的伞面向上，操作方法如前所述。用200微升移液器吸头轻轻刮擦水母表面，轻柔的刮擦可能在基底膜上造成撕裂。

用盖玻片覆盖动物以进行成像。放置盖玻片有时足以产生微小的上皮伤口，即使不进行划伤操作也是如此。使用微量移液器拉制仪和玻璃毛细管，按照文中所述步骤制备显微注射针。

将空的显微注射针放入固定在显微操作器上的显微注射针夹持器中，并切割针尖，使开口直径约为 20 至 40 微米。将显微注射仪的持针压力设为零，喷射压力设为约 20 磅每平方英寸。设置显微注射仪以释放持续两秒的气流脉冲。

为制造较大的上皮伤口，将水母置于凹面载玻片上，操作方法如前所述。使用显微操作仪，通过将显微注射针尖小心浸入水中后回撤，调整针尖位置，使其刚好位于水面之上，并接近水母的上皮表面。按下注射仪的“开始”按钮，释放空气脉冲。

根据尖端的宽度，在同一位置重复脉冲两到四次。较大的尖端需要较少的脉冲。对于大面积伤口成像，用盖玻片覆盖受伤的动物。

将焦距调整至 x umbrella。六边形细胞应清晰可见。手动识别一个伤口以对其进行成像。

启动一个能够实时以电影形式采集图像的程序，或一个以固定时间间隔采集一系列图像的程序。监测实验进程，确保伤口区域不偏离视野范围，且目标细胞始终保持在焦平面内。如需注射染料或药物，请按照文中所述步骤制备显微注射针。

使用长枪头移液器，将过量的染料或药物吸入显微注射针中，以备向水母体内注射。利用改造过的移液管，将伞下腔朝上的水母放入聚二甲基硅氧烷（PDMS）注射培养皿中，加入适量人工海水（ASW）以刚好覆盖动物体。将培养皿置于解剖显微镜的载物台上。

聚焦于显微注射针的尖端，并将其推进到水母附近的水中。使用显微操作器将针头压入培养皿，直至其弯曲并折断，形成一个直径约为10至20微米的开口。

使用显微操作仪，将针尖穿过伞下腔进入中胶层，注意不要刺破X伞。在显微注射仪上，将维持压力设为零，注射压力设为低于或等于20磅每平方英寸。向一个或两个象限内注射，使每个象限内染料或药物的着色区域大约占该象限面积的四分之一。

根据所注射的染料或药物不同，将动物放入盛有新鲜人工海水（ASW）的烧杯中，以促进染料或药物的扩散和孵育。进行成像时，使用改良的转移移液管将水母转移到凹面载玻片上，使动物的伞部朝上放置。在此阶段可对动物进行损伤处理，以检测所注射试剂的作用效果。

细胞内及细胞间的微小伤口在愈合过程中形成了小的片状伪足。随后发生收缩，伤口在不到一分钟内愈合。小的上皮伤口也通过片状伪足的形成以及片状伪足接触的延伸而实现愈合。

快速且持续的伤口闭合先于新形成伤口边缘处的组织收缩。以随时间变化的伤口总面积百分比表示的两个小伤口的标准化愈合速率，显示出伤口闭合动态存在一定的变异性。来自14个不同伤口的数据被用于建立未经处理动物的平均伤口愈合曲线。

在具有基底膜损伤的小伤口中，边缘细胞会向损伤区域周围扩散，并通过束带样收缩闭合缺口。当组织脱水或损伤过于严重而无法修复时，细胞运动可能停止，或整个细胞层可能发生破裂。大面积伤口的愈合则经历多个阶段。

伤口边缘收缩后边缘变得平滑，形成片状伪足，并在距离边缘数个细胞层的位置延伸片状伪足接触，促进集体细胞迁移，从而闭合较大的间隙。通过将试剂显微注射到细胞外基质（ECM）中实现细胞核和细胞膜的染色。显微注射细胞松弛素B可抑制损伤后片状伪足的形成。

轻柔地操作动物。注射试剂时，确保显微注射针的尖端位于中胶层内，且未完全穿透动物体。目前，正在利用带有荧光标签蛋白的转基因动物，结合荧光显微镜与微分干涉差显微镜，可更清晰地观察上皮伤口愈合过程中的细胞事件。