Name: 儿茶酚胺能多形性室性心动过速的 RyR2R2474S 敲入小鼠心脏的双染料光学映射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学习双染料光学映射技术，用于研究儿茶酚胺能多形性室性心动过速小鼠心脏的电生理特性。该方法可同时记录膜电位和钙信号，揭示心律失常机制，为CPVT治疗提供新见解。

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本研究由国家自然科学基金（81700308 资助 XO，31871181 资助 ML，82270334 资助 XT）、四川省科技计划项目（CN）（2021YJ0206 资助 XO，23ZYZYTS0433，2022YFS0607 资助 XT，2022NSFSC1602 资助 TC）以及药用资源化学与分子工程国家重点实验室（广西师范大学）（CMEMR2017-B08 资助 XO）、英国医学研究理事会（MRC）（G10031871181 资助 ML02647，G1002082，ML）、英国心脏基金会（BHF）（PG/14/80/31106，PG/16/67/32340，PG/12/21/29473，PG/11/59/29004 ML）和牛津大学英国心脏基金会卓越研究中心（BHF CRE at Oxford）（ML）项目资助。

使用10&#160;至14周龄、体重为20–25 g的雄性野生型小鼠或RyR2-R2474S/+小鼠（C57BL/6背景）进行实验。所有实验程序均已由中国四川西南医科大学动物护理与使用委员会批准（批准号：20160930），并符合该机构所遵循的国家指导原则。
1. 准备
<ol>
	<li>储备溶液
	<ol>
		<li>比比斯汀储备液：向含有 2.924 mg (-) 比比斯汀粉末的原装小瓶中加入 1 mL 100% 二甲基亚砜（DMSO），配制成 10 mM 的溶液。</li>
		<li>电压指示剂 RH237 储备液：向含有 1 mg RH237 粉末的原装小瓶中加入 1 mL 100% DMSO，配制成&#160;2.01 mM 的溶液。</li>
		<li>钙指示剂 Rhod-2 AM 储备液：向 1 mg Rhod-2 AM 粉末中加入 1 mL 100% DMSO，配制成 0.89 mM 的溶液。</li>
		<li>普鲁尼克 F127 储备液：向 200&#160;mg 普鲁尼克 F127&#160;中加入 1 mL 100% DMSO，配制成 20% w/v（0.66 mM）的溶液。</li>
		<li>将储备液分装至 200 µL PCR 管中，每管体积分别为 21–51 µL（RH237 为 21 µL，Rhod-2 AM 为 31 µL，比比斯汀为 51 µL），以供单次或双次使用，避免反复冻融。随后用铝箔包裹，并&#160;于 -20 °C 保存，但普鲁尼克 F127 储备液需置于室温避光处保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌流液
	<ol>
		<li>克氏溶液（单位：mM）：配制 1 L 克氏溶液（NaCl 119，NaHCO3 25，NaH2PO4 1.0，KCl 4.7，MgCl2 1.05，CaCl2 1.35，葡萄糖 10）。</li>
		<li>使用 0.22 µm 无菌针头滤器过滤溶液，并用 95% O2/5% CO2 气体进行氧合。</li>
		<li>取 40 mL 克氏溶液置于 50 mL 离心管中，于 4 °C 保存，用于后续心脏分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>朗格多夫灌流系统与光学标测装置
	<ol>
		<li>搭建朗格多夫灌流系统。
		<ol>
			<li>打开水浴锅，将温度设定为 37 °C。</li>
			<li>用 1 L 去离子水清洗朗格多夫灌流系统。</li>
			<li>从进液管路开始灌流，并调节流出速度至 3.5–4 mL/min。随后在 37 °C 条件下，用 O2/CO2 （95%/5%）气体对灌流液进行氧合。 
			注：灌流系统中严禁出现气泡。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准备光学标测系统。
		<ol>
			<li>安装电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机（512 × 512 像素）、镜头（40 倍放大）、波长分离发光二极管（LED）、心电图（ECG）监测仪和刺激电极（图 1）。</li>
			<li>调节镜头与心脏位置之间的合适工作距离。</li>
			<li>将两个 LED 安置于恒温浴槽对角位置，以实现均匀照明，提供波长为 530 nm 的激发光。使用 ET525/50 溅射镀膜滤光片去除 LED 的带外杂光。</li>
			<li>调节手柄开关，使目标表面呈现均匀的方形视野，确保电压和钙信号图像在采集界面上清晰显示。</li>
			<li>将镜头光圈调至最大直径，以避免电压或钙信号的泄漏。</li>
			<li>调节相机镜头至适当高度，使其与恒温浴槽保持合适的工作距离，通常为 10 cm。</li>
			<li>开启相机，使其稳定在 -50 °C 的采样温度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验步骤
<ol>
	<li>小鼠心脏的收获、插管与灌流
	<ol>
		<li>腹腔注射阿佛丁溶液（1.2%，0.5–0.8 mL）和肝素（200 单位），以减轻动物痛苦和疼痛反射，并防止血液凝固。15 分钟后，通过颈椎脱位处死动物。</li>
		<li>用剪刀打开胸腔，小心取出心脏，并将其置于冷 Krebs 溶液（4 °C，95% O2，5% CO2）中，以减缓代谢并保护心脏。</li>
		<li>清除主动脉周围的组织，使用自制插管针（外径：0.8 mm，内径：0.6 mm，长度：27 mm）对主动脉进行插管，并用 4-0 丝线固定。</li>
		<li>在 Langendorff 系统中以 3.5–4.0 mL/min 的恒定流速对心脏进行灌流，并维持温度在 37 ± 1 °C。 
		注意：所有后续操作均在此条件下进行。</li>
		<li>将一根小塑料管（直径 0.7 mm，长度 20 mm）插入左心室，以释放心腔内积聚的液体，避免过度前负荷。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>兴奋-收缩去耦联与双染料负载
	<ol>
		<li>将两个电极插入浴槽中的灌流液中，打开心电图放大器和电刺激控制器的电源，然后启动参考心电图软件并持续监测心电图。</li>
		<li>当心脏达到稳定状态（心脏以约 400 bpm 的节律性搏动）时，在避光条件下进行后续步骤。</li>
		<li>将 50 µL 的 10 mM blebbistatin 储备液与 50 mL Krebs 溶液混合，使终浓度为 10 µM。持续将 blebbistatin-Krebs 混合液灌流至心脏 10 分钟，以实现兴奋与收缩的去耦联，并避免成像过程中的收缩伪影。</li>
		<li>使用红光手电筒检查心脏收缩是否完全停止，因为收缩会影响染料负载的质量。</li>
		<li>完成兴奋-收缩去耦联&#160;后，将 15 µL Rhod-2 AM 储备液与 15 µL Pluronic F127 储备液加入 50 mL Krebs 溶液中，使 Rhod-2 AM 的终浓度为 0.267 µM，Pluronic F127 的终浓度为 0.198 µM。随后，在 Langendorff 灌流系统中持续灌流 Rhod-2 AM 工作液 15 分钟。</li>
		<li>在细胞内钙染料负载过程中保持供氧。由于 Pluronic F127 中容易产生气泡，需在灌流系统中接入气泡捕获装置，以防止冠状动脉发生气体栓塞。</li>
		<li>将 10 µL RH237 储备液稀释至 50 mL 灌流液中，使终浓度达到 0.402 µM，并进行 10 分钟的负载。</li>
		<li>双染料负载结束后，拍摄一系列图像，以确保电压和钙信号均足以用于分析（两种信号之间无相互干扰）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光学标测与心律失常诱导 
	注意：在收缩停止且染料负载适当后开始光学标测，心脏继续按照步骤 2.1(4) 所述条件持续灌流。
	<ol>
		<li>打开两个用于激发光的 LED，将其强度调节至适当范围（足够强以实现良好照明和清晰成像，但不过强以免曝光过度）。</li>
		<li>将心脏置于检测装置下方，确保其处于两个 LED 的充分照明下，并调节光斑直径至 2 cm。</li>
		<li>设定镜头与心脏之间的工作距离为 10 cm，以获得近 500 Hz 的采样率和每像素 120 × 120 µm 的空间分辨率。</li>
		<li>打开信号采样软件，以数字方式控制相机，同时采集电压和钙信号。</li>
		<li>启动心肌起搏器场刺激仪，设置起搏模式为晶体管-晶体管逻辑（TTL），每次脉冲持续时间为 2 ms，初始强度为 0.3 V。</li>
		<li>使用 30 次连续的 10 Hz S1 刺激，通过心电图记录软件测试心脏的舒张期电压阈值。逐步增加电压幅度，直至实现 1:1 捕获（通过心电图监测器检查 QRS 波、动作电位（AP）和钙瞬变（CaT）信号）。</li>
		<li>确定电压阈值后，使用连接在左心室（LV）心尖部心外膜（ELVA）的一对铂电极，以舒张期电压阈值 2 倍的强度对心脏进行起搏。</li>
		<li>实施 S1S1 协议以测量钙或动作电位交替现象及恢复特性。以 100 ms 的基础周长连续起搏，随后每轮递减 10 ms，直至达到 50 ms。每轮包含 30 次连续刺激，脉冲宽度为 2 ms。同时，在刺激前开始光学标测（采样时间包括约 10 次窦性节律和起搏持续时间）。</li>
		<li>采用 S1S2 刺激协议测量心室有效不应期（ERP）：首先以 100 ms 的 S1S1 起搏周长起搏，S2 耦合时间为 60 ms，随后以 2 ms 步长递减，直至 S2 无法捕获异位 QRS 波群。</li>
		<li>为诱导心律失常，实施持续的 50 Hz 爆发性起搏（50 次连续电刺激，脉冲宽度为 2 ms），并在 2 秒静息间隔后重复相同的起搏过程。</li>
		<li>在持续高频起搏期间仔细观察心电图记录，以便在出现有意义的心律失常心电图波形时立即启动同步光学标测记录（由于大多数心律失常由电刺激诱发，为避免遗漏重要心脏事件，光学信号在爆发性起搏前 2–3 秒开始采样）。</li>
		<li>使用 EMCCD 相机进行成像（采样率：500 Hz，像素尺寸：64 × 64）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>图像加载与信号处理
		<ol>
			<li>点击 选择文件夹 和加载图像 ，将图像导入图像采集软件，根据先前所述的设置和协议进行半自动的大规模视频数据分析15,16。</li>
			<li>输入正确的采样参数（如 像素尺寸 和 帧率）。</li>
			<li>通过手动输入设置图像阈值，并选择感兴趣区域（ROI）。</li>
			<li>应用 3 × 3 像素高斯空间滤波器、Savitzky-Golay 滤波器和top-hat基线校正。</li>
			<li>点击 处理图像 以去除基线并计算电生理参数，如 APD80 和 CaTD50。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>电生理参数分析
		<ol>
			<li>设定 APD 的起始时间为峰值，终末点为复极化 80% 处（APD80），用于计算 APD80。类似地，CaTD 的起始时间定义为峰值，终末点定义为舒张 80% 处。</li>
			<li>传导速度（CV）的测量依赖于像素尺寸以及两个或多个像素之间的动作电位传导时间。计算所有选定像素的平均速度——即为所选区域的平均传导速度。同时生成相应的等时线图，以清晰显示传导方向。 
			注意：O'Shea 等人15已详细报道了 CV 的测量方法。</li>
			<li>对于交替现象和心律失常分析，钙交替定义为连续出现的大峰和小峰交替的峰值振幅。使用峰值振幅比（1-A2/A1）评估频率依赖性交替的严重程度。应用相位图分析复杂心律失常，如室性心动过速（VT）。注意在特定区域明显出现并发生移动的旋转子。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li>
<li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge%3A+Modulation+by+p21-activated+kinase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li>
<li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).</li>
<li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li>
<li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li>
<li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3%2F4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li>
</ol>

所有作者均无任何利益冲突需要声明。

根据我们的经验，成功进行小鼠心脏双染料光学标测的关键包括制备良好的溶液和心脏、染料负载、获得最佳的信噪比以及减少运动伪影。
溶液的配制 
克雷布斯（Krebs）溶液对于成功的心脏实验至关重要。由于氯化镁（MgCl2）和氯化钙（CaCl2）易吸水，需预先配制成1 mol/L的储备液，并在其他所有成分溶解于纯水之后再加入克雷布斯溶液中，因为Mg2+和Ca2+容易与CO32-形成沉淀。克雷布斯溶液需用95% O2/5% CO2混合气体至少通气30分钟，以确保充分氧合。由于小鼠心脏对pH值特别敏感，氧合后溶液的pH值应维持在7.4左右。即使溶液中存在微小颗粒，也可能堵塞毛细血管并影响灌注效果，从而干扰实验结果。因此，使用前需用0.22 µm无菌针头滤器过滤溶液。
心脏制备 
...

遗传性心脏疾病儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速（CPVT）在体力活动、应激或儿茶酚胺刺激后表现为多形性室性心动过速（PVT）发作，可能恶化为潜在致命的心室颤动1,2,3,4。自1995年首次报道该临床综合征以来，近期证据表明有七种基因突变与此病相关，这些基因均参与肌浆网（SR）钙库Ca2+释放的调控：其中最常见的是RYR2基因突变，编码Ca2+释放通道的兰诺碱受体2（RyR2）5,6；此外还有FKBP12.67、编码心肌钙调集蛋白的CASQ28、编码连接部肌浆网蛋白三联蛋白的TRDN9，以及均编码钙调蛋白的CALM19、CALM210和CALM311,12。这些基因型模式将心律失常事件归因于肌浆网钙库Ca2+的病理性非调控释放12。
肌浆网（SR）中自发的 Ca2+ 释放可表现为 Ca2+ 火花或 Ca2+ 波，从而激活 Na+/Ca2+ 交换体（NCX）。每交换一个 Ca2+ 离子和三个 Na+ 离子，会产生内向电流，加快舒张期去极化，使膜电位达到动作电位（AP）阈值。在 RyR2 基因敲入小鼠中，窦房结（SAN）内 RyR2R4496C 活性增加，导致舒张期 Ca2+ 依赖性的 ICa,L 降低及 SR Ca2+ 耗竭，意外地降低了 SAN 的自律性，揭示了导致 CPVT 患者窦房结功能障碍的亚细胞病理生理改变13,14。当儿茶酚胺（包括异丙肾上腺素（ISO））刺激使 RyR 敏感化后，胞质内基础 [Ca2+] 升高，心肌细胞胞质中出现相关 Ca2+ 波的可能性随之增加。
在完整的心脏CPVT模型中，由动作电位（AP）激活引发的RyR2介导的Ca2+释放后，Ca2+信号传导的详细动力学变化可能与观察到的室性心律失常有关，但目前尚不清楚这些变化在已报道的所有RyR2基因型范围内如何表现12。本文介绍了在小鼠野生型（WT）和杂合型RyR2-R2474S/+心脏中，结合程序性电刺激（分别在异丙肾上腺素干预前后进行）实现Ca2+信号和跨膜电位（Vm）高通量成像的仪器配置与实验操作流程。该方案为在离体小鼠心脏中开展CPVT疾病机制研究提供了方法支持。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂，中国上海</td><td>N/A</td><td>用于过滤溶液</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>广州洁斐 filtration 有限公司，中国</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 巴斯德移液管</td><td>北京莱伯格科技有限公司，中国</td><td>00900026</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>YZB/GER-5474-2014</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L PCR 管</td><td>生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海</td><td>F611541-0010</td><td>分装储备液&amp;nbsp;以避免反复冻融</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>广州洁斐 filtration 有限公司，中国</td><td>CFT011500</td><td>将台氏液在 4 &amp;deg;C 下保存，用于后续心脏分离</td></tr><tr><td>585/40 nm 滤光片</td><td>Chroma Technology</td><td>N/A</td><td>用于钙信号滤光</td></tr><tr><td>630 nm 长通滤光片</td><td>Chroma Technology</td><td>G15604AJ</td><td>用于电压信号滤光</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-三溴乙醇)</td><td>Sigma-Aldrich，普尔，多塞特，英国</td><td>T48402-100G</td><td>用于减轻痛苦和疼痛反射</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国</td><td>SLBV5564</td><td>兴奋-收缩解偶联剂，用于&amp;nbsp;在映射过程中消除运动伪影</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国</td><td>SLBK1794V</td><td>用于配制台氏液</td></tr><tr><td>定制恒温浴槽</td><td>MappingLab，英国</td><td>TBC-2.1</td><td>用于维持灌注液温度</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>(RNBT7442)</td><td>染料溶剂</td></tr><tr><td>Dumont 镊子</td><td>上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂，上海，中国</td><td>YAF030</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMap 软件</td><td>伯明翰大学</td><td>N/A</td><td>电生理参数的量化分析</td></tr><tr><td>EMCCD 相机</td><td>Evolve 512 Delta, Photometrics, 图森, 亚利桑那州, 美国</td><td>A18G150001</td><td>采集光学信号图像</td></tr><tr><td>ET525/36 溅射镀膜滤光片</td><td>Chroma Technology</td><td>319106</td><td>激发滤光片</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国</td><td>SLBT4811V</td><td>用于配制台氏液</td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>成都海通制药有限公司，中国成都</td><td>(H51021209)</td><td>用于防止冠状动脉内血栓形成</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;虹膜镊</td><td>上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂，上海，中国</td><td>YAA010</td><td></td></tr><tr><td>异丙肾上腺素</td><td>MedChemExpress，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国</td><td>HY-B0468/CS-2582</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国</td><td>SLBS5003</td><td>用于配制台氏液</td></tr><tr><td>MacroLED</td><td>Cairn Research, 法弗舍姆, 英国</td><td>7355/7356</td><td>荧光探针的激发光源</td></tr><tr><td>MacroLED 光源</td><td>Cairn Research, 法弗舍姆, 英国</td><td>7352</td><td>控制 LED</td></tr><tr><td>Mayo 剪刀</td><td>上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂，上海，中国</td><td>YBC010</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>光学信号采样</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国</td><td>BCBS6841V</td><td>用于配制台氏液</td></tr><tr><td>MICRO3-1401</td><td>Cambridge Electronic Design limited, 英国</td><td>M5337</td><td>连接电刺激器与 Spike2 软件</td></tr><tr><td>MyoPacer EP 场刺激器</td><td>Ion Optix 公司，米尔顿，马萨诸塞州，美国</td><td>S006152</td><td>电刺激器</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国</td><td>SLBS2340V</td><td>用于配制台氏液</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国</td><td>BCBW9042</td><td>用于配制台氏液</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国</td><td>SLBX3605</td><td>用于配制台氏液</td></tr><tr><td>NeuroLog 系统</td><td>Digitimer</td><td>NL905-229</td><td>用于心电图放大器</td></tr><tr><td>OmapScope5</td><td>MappingLab, 英国</td><td>N/A</td><td>钙交替和心律失常分析</td></tr><tr><td>眼科剪刀</td><td>淮安特生医疗器械有限公司，江苏，中国</td><td>T4-3904</td><td></td></tr><tr><td>OptoSplit</td><td>Cairn Research, 法弗舍姆, 英国</td><td>6970</td><td>分光以同时检测 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 V&lt;sub&gt;m&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>保定兰格恒流泵有限公司，中国保定</td><td>BT100-2J</td><td>用于泵送溶液</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010060</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Invitrogen, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚州, 美国</td><td>1899021</td><td>增强 Rhod-2 AM 的负载效率</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Thermo Fisher Scientific, 沃尔瑟姆, 马萨诸塞州, 美国</td><td>1971387</td><td>电压敏感性染料</td></tr><tr><td>Rhod-2 AM</td><td>Invitrogen, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚州, 美国</td><td>1890519</td><td>钙离子指示剂</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>保定兰格恒流泵有限公司，中国保定</td><td>96402-16</td><td>连接至蠕动泵</td></tr><tr><td>丝线缝合线</td><td>扬州源康医疗器械有限公司，中国</td><td>20172650032</td><td>用于固定主动脉</td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design limited, 英国</td><td>N/A</td><td>用于记录和分析心电图数据</td></tr><tr><td>刺激电极</td><td>MappingLab, 英国</td><td>SE1600-35-2020</td><td></td></tr><tr><td>T510lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>312461</td><td>用于光源</td></tr><tr><td>T565lpxr</td><td>Chroma Technology</td><td>321343</td><td>用于光源</td></tr></tbody></table>

儿茶酚胺能多形性室性心动过速 ryr2r2474s 基因敲入小鼠心脏的双染料光学标测

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

具有致心律失常风险的心脏疾病儿茶酚胺能性多形性室性心动过速（CPVT）在体力活动、应激或儿茶酚胺刺激后表现为多形性室性心动过速发作，可能恶化为潜在致命的心室颤动。小鼠心脏是模拟包括CPVT在内的遗传性心脏心律失常疾病的常用动物模型。同步光学标测跨膜电位（Vm)以及来自离体灌流小鼠心脏的钙瞬变（CaT）有望揭示心律失常发生的机制。与细胞水平的研究相比，光学标测技术能够检测多种电生理参数，例如激活时间、传导速度、动作电位时程以及CaT时程。本文介绍了用于高通量光学标测CaT和 Vm 在小鼠野生型和杂合子中 RyR2-R2474S/+ 心脏，结合在异丙肾上腺素刺激前后进行程序性电刺激。该方法已证明是机制性研究儿茶酚胺能多形性室性心动过速（CPVT）疾病的一种可行且可靠的手段 离体 小鼠心脏制备

在过去十年中，光学标测已成为研究复杂心脏心律失常的常用方法。光学标测系统包含一台EMCCD相机，其采样率可达1,000 Hz，每个像素的空间分辨率为74 × 74 µm，可在信号采样期间实现较高的信噪比（图1）。当Langendorff灌注心脏达到稳定状态且染料加载完成后，将心脏置于恒温灌流腔内，并用两个530 nm的LED光源照射，以激发电压指示剂RH237和Ca2+指示剂Rhod-2 AM。发射光被分光为600 nm（用于Ca2+）和670 nm（用于Vm）两个波长，由EMCCD相机同时检测。在用阿佛丁（avertin）和肝素灌注15分钟后，使用手术器械（图2A）打开胸腔并迅速取出心脏，随后将其转移至冷的Krebs溶液（4 °C，95% O2，5% CO2）中（图2B）。仔细清除周围组织，用4-0缝线固定主动脉，并将一根0.7 mm的塑料管插入左心...

本方案介绍了对来自野生型及患有儿茶酚胺能多形性室性心动过速的基因敲入型小鼠心脏进行的双染料光学标测，包括以高时间和空间分辨率记录跨膜电压和细胞内Ca2+瞬变的电生理学测量。

儿茶酚胺能多形性室性心动过速 RyR2R2474S 基因敲入小鼠心脏的双染料光学标测

具有致心律失常特性的心脏疾病儿茶酚胺能性多形性室性心动过速（CPVT）表现为多形性室性心动过速发作……

该方法将有助于揭示与儿茶酚胺能多形性室性心动过速等疾病相关的室性停搏涂片的电生理特性及机制。利用此技术，我们可在多种程序化电刺激方案下，同时获取膜电位和细胞内钙信号，特别适用于探究诸如CPVT等心律失常性疾病的潜在机制与动态过程。为成功实施该实验，需确保心脏灌注良好、染料负载适当、实现兴奋-收缩解耦以及精确设置相机参数。首先，搭建光学标测系统，并开启相机以使其温度稳定在零下50摄氏度。将收获的小鼠心脏放入冷的CREB溶液中，以减缓代谢并保护心脏。去除主动脉周围的组织。使用自制的套管针进行插管，并用4-0丝线固定。现在通过Langendorff系统以每分钟3.5至4.0毫升的恒定速度灌注心脏。将一根小型塑料管插入左心室，以释放心室内的积液，避免过高的前负荷，并将塑料管固定在套管针上。然后将两个电极放入浴槽中的灌流液内，打开心电图放大器盒和电刺激控制器的电源。接着启动参考心电图（ECG）软件，持续监测心电图。当心脏达到稳定状态时，在暗处进行后续步骤。将blebbistatin与CREBs溶液的混合液持续灌注心脏10分钟，以解除兴奋-收缩耦联，避免成像过程中出现收缩伪影。随后使用红光手电筒观察心脏，确认收缩已完全停止。在解除兴奋-收缩耦联后，于Langendorff灌注系统中用Rhod-2 AM工作液灌注心脏15分钟。在细胞内钙离子染料负载过程中维持供氧。为防止Pluronic F-127产生气泡，需在灌流系统中接入一个气泡捕获装置。将10 µL RH 237储备液稀释至50 mL灌流液中，灌流10分钟进行负载。完成双染料负载后，拍摄一系列照片。确认电压和钙信号足以用于分析。打开两个LED光源以提供激发光，并将其强度调节至适当范围。将心脏置于检测装置下方，调整两个LED的光斑直径至两厘米，确保心脏得到充分照明。将镜头与心脏之间的工作距离设为10厘米，以达到所需的采样率和空间分辨率。打开信号采样软件，以同时控制相机并采集电压和钙信号。启动 MyoPacer 场刺激器，并将起搏模式设置为晶体管-晶体管逻辑，每次脉冲起搏持续时间为 2 毫秒。将初始强度设为 0.3 伏。将一对铂电极放置于左心室心外膜顶端。使用心电图记录软件，施加30次连续的10赫兹S1刺激，以测试心脏的舒张期电压阈值。逐步增加电压幅度，直至实现一对一捕获。采用S1-S1方案，测量钙瞬变或动作电位交替及恢复特性。从100毫秒的基本周期长度开始，依次进行心脏起搏。在随后的每一轮刺激中，将周期长度减少10毫秒，直至达到50毫秒。在开始刺激前，同时启动光学标测。使用 S1-S2 刺激方案测量心室有效不应期时，首先设定 S1-S1 起搏周长为 100 毫秒。将 S2 耦合间期设为 60 毫秒，并以 2 毫秒为步长逐步递减，直至 S2 无法诱发出异位 QRS 波群。对于心律失常诱导，给予持续的 50 赫兹快速脉冲起搏，并在等待 2 秒静息间期后重复相同的起搏过程。在持续高频起搏期间，密切监测心电图记录，当出现有意义的心律失常波形时，立即开始同步的光学标测记录。随后使用电子倍增电荷耦合器件相机进行图像采集。在图像采集软件中，点击“选择文件夹”，加载图像以启动半自动的大规模视频数据分析流程。输入正确的采样参数以进行分析。手动设置图像阈值并选择感兴趣区域。应用3×3像素高斯空间滤波器、Savitzky-Golay滤波器和帽形基线校正。然后点击“处理图像”以去除基线，并计算动作电位时程（APD-80）和钙瞬变时程（CATD-50）等电生理参数。计算APD-80时，将动作电位时程的起始时间设为峰值，终止点设为复极化80%处。类似地，将钙瞬变时程的起始时间定义为峰值，终止点为舒张80%处。图中显示了APD-80和CATD-80在热图中的典型轨迹。异丙肾上腺素可缩短野生型小鼠和儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速（CPVT）小鼠的APD-80，但在异丙肾上腺素刺激后，两者之间未发现差异。异丙肾上腺素刺激后，CATD-80和CPVT小鼠的APD-80较野生型更长，而处理前无显著差异。根据电压信号，野生型心脏与CPVT心脏在基线状态以及异丙肾上腺素干预后，其心外膜传导能力相同。热图显示，CPVT小鼠在异丙肾上腺素刺激前后，其传导能力与野生型小鼠一致。钙振幅交替分析表明，在14.29和16.67赫兹的连续S1-S1起搏下，野生型心脏的钙信号在基线状态下保持稳定，而CPVT心脏则表现出频率依赖性的交替现象。异丙肾上腺素刺激后，CPVT 心脏在 S1-S1 起搏期间表现出频率依赖性的交替现象和钙信号异常，而野生型心脏则未受影响。心动过速性心律失常分析表明，在基线状态下，野生型和 CPVT 心脏在 50 赫兹爆发起搏期间均表现出正常的传导。在灌注异丙肾上腺素后，CPVT 心脏在 50 赫兹爆发起搏后出现高频旋转子，而野生型心脏仍维持正常传导。采用该方法后，可利用疾病模型小鼠和野生型小鼠来阐明这些模型中的电生理和功能特性，或用于药物研发。光学标测是研究心脏心律失常的有力工具，但由于荧光染料在激发-收缩脱耦条件下的局限性，尚无法应用于临床。随着针对不同靶分子的荧光探针的发展以及高通量计算技术的进步，心脏光学标测技术必将实现更广泛的应用。

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科研

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Biology

生物学

儿茶酚胺能多形性室性心动过速的 RyR2R2474S 敲入小鼠心脏的双染料光学映射

本文介绍了一种高时间和空间分辨率的技术，利用电位敏感染料（di-8-ANEPPS）对离体灌注的大鼠心脏表面动作电位的传播进行光学成像。...

离体灌注大鼠心脏的光学标测

本报告详细描述了在拉伸诱导心房颤动期间，对离体羊心左心房进行Langendorff灌注状态下同步心内膜和心外膜电兴奋光学标测的方法学与结果。...

用于拉伸诱导心房颤动研究的绵羊模型中的高分辨率心内膜与心外膜光学标测

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利用光遗传学多点光刺激在小鼠心脏中实现高级心律管理

学习双染料光学映射技术，用于研究儿茶酚胺能多形性室性心动过速小鼠心脏的电生理特性。该方法可同时记录膜电位和钙信号，揭示心律失常机制，为CPVT治疗提供新见解。

儿茶酚胺能多形性室性心动过速 RyR2^R2474S 基因敲入小鼠心脏的双染料光学标测

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