Name: 在三维悬浮生物反应器中产生人神经原蛋白2诱导神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 了解如何使用三维悬浮生物反应器从人诱导多能干细胞高效分化神经元。该方法可在生理环境中实现高细胞产量和快速神经分化，适用于大规模应用。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EBiSC2 项目获得了创新药物计划 2 联盟（JU）根据资助协议编号 821362 提供的资金支持。该联盟（JU）获得了欧盟“地平线 2020”研究与创新计划以及欧洲制药工业协会联合会（EFPIA）的支持。我们感谢 Nadine J. Smandzich、Helene D. M. Hemmer、Johnn-Majd Balsters 和 Vanessa M. Nalewaja 在免疫细胞化学和基因表达分析方面的协助，同时感谢 Heike Arthen 提供的出色技术支持。此外，我们感谢 Stephanie Bur 建立了生物反应器项目。图 2A 使用 BioRender.com 制作。

注意：所有细胞操作以及培养皿和培养基的制备均应在无菌条件下进行。使用前后应彻底清洁超净工作台，用70%乙醇擦拭所有表面。本方案已针对CERO 3D培养箱与生物反应器（下文简称台式生物反应器）中的神经元分化过程进行了优化。该台式生物反应器配备四个专用生物反应管插槽，每根管的最大容量为50 mL。温度和CO2浓度持续受控，且每个管的培养参数（如转速和时间）可独立调节。除非另有说明，所有吸液步骤均使用吸液移液管和真空泵完成。
1. hiPSC的培养与扩增
注意：本方案使用经基因改造的强力霉素诱导型 NGN2 hiPSC 细胞系 BIONi010-C-13。此处提供的扩增方案已针对 6 cm 一次性培养皿优化，但也可根据需要选用其他培养格式。
<ol>
	<li>用冷的杜氏改良伊格尔培养基/12号配方（DMEM/F12 (-/-)）将基底膜基质稀释至终浓度为 0.083 mg/mL/10 cm2，包被 6 cm 培养皿。将包被后的培养皿在 37 °C 下孵育至少 30 分钟。 
	注意：基底膜基质溶液的详细制备方案可参见生产商说明书。hiPSCs 可在其他细胞外基质上进行无饲养层扩增培养。</li>
	<li>根据 EBiSC 细胞系用户操作规程21，在无饲养层 iPSC 维持培养基中加入 10 µM ROCK 抑制剂（Y-27632）解冻冻存的 hiPSCs。建议接种密度为每 60 mm 培养皿接种 1 × 106 个活细胞。</li>
	<li>次日更换为不含 ROCK 抑制剂的无饲养层 iPSC 维持培养基，并每日更换培养基。</li>
	<li>当 hiPSC 培养物融合度达到 60%–80% 时开始传代。检查是否存在分化区域，若分化区域超过 5%，需手动清除克隆。 
	注意：未分化的 hiPSCs 呈圆形，核仁明显，胞质较少。解冻或传代后早期会形成扁平且紧密排列的克隆。典型的明场显微图像见图1。更多信息请参见 EBiSC 细胞系用户操作规程21。传代前请准备好包被基底膜基质的培养皿和无饲养层 iPSC 维持培养基。</li>
	<li>吸除 hiPSC 培养物中的培养基，用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 1× 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中配制的 0.5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液清洗细胞 2 次（见材料表）。</li>
	<li>移除上清液，在 6 cm 培养皿中加入 2 mL 含 0.5 mM EDTA 的 1× DPBS (-/-) 溶液，在培养箱中 37 °C 孵育 3 分钟。</li>
	<li>吸除 1.5 mL EDTA 溶液，继续孵育 3–5 分钟。</li>
	<li>轻轻敲击培养皿以促进细胞脱落。 
	注意：通过肉眼观察判断细胞脱落情况。hiPSC 克隆通常在 5 分钟后开始脱落，但高融合度的 hiPSC 培养物可能需要更长孵育时间。若克隆未脱落，可将孵育时间延长至 10 分钟，但不得超过此时限。</li>
	<li>向 6 cm 培养皿中加入 5 mL 无饲养层 iPSC 维持培养基，使用 10 mL 移液管或宽口移液枪头轻柔吹打 2 次，使克隆重新悬浮。将细胞转移至 15 mL 离心管中。 
	注意：hiPSCs 对机械应力极为敏感，因此应避免反复吹打。最终细胞悬液应包含较小的克隆片段（50–200 µm）。</li>
	<li>吸除包被培养皿中的上清液，每 6 cm 培养皿准备 4 mL 无饲养层 iPSC 维持培养基。</li>
	<li>以 1:10 至 1:40 的分种比例将小克隆片段转移至新制备的培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养，并每日更换培养基。 
	注意：小克隆应在传代后 1 至 2 小时内贴壁。</li>
</ol>
<img alt="干细胞培养生长；显微镜图像；细胞集落形态；生物医学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：人诱导性多能干细胞培养物的形态学特征。（A,B）不同汇合度下的高质量人诱导性多能干细胞（hiPSC）培养物，显示紧密排列的hiPSC集落，形态均一，边界清晰。（C）hiPSC培养物中集落边缘出现分化细胞簇（白色虚线）。比例尺 = 200 µm。缩写：hiPSC = human induced pluripotent stem cell。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 台式生物反应器系统中 hiPSCs 的预培养（第-2天）
注意：当hiPSC细胞培养的融合度达到60%至80%时，开始预培养。检查hiPSC克隆是否存在分化区域。在此预培养阶段，hiPSC细胞在无饲养层的iPSC维持培养基中培养2天。
<ol>
	<li>配制培养基，包括无饲养层iPSC维持培养基和 10 µM ROCK抑制剂（Y-27632）</li>
	<li>完全吸除hiPSCs的培养基，用1x DPBS (-/-) 轻柔冲洗细胞两次。</li>
	<li>向6 cm培养皿中加入2.0 mL预热的胰蛋白酶-EDTA溶液，于37℃孵育细胞3 min 37 °C 在培养箱中。</li>
	<li>轻轻敲击培养皿以促进细胞脱落，或再孵育1-2分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于每皿5 mL无饲养层iPSC维持培养基中，加入ROCK抑制剂。将细胞悬液转移至15 mL或50 mL离心管中，轻轻吹打混匀，以确保细胞单分散。</li>
	<li>确定细胞数量 100 µL 使用自动细胞计数仪对细胞悬液进行计数，方法如前所述20. 转移相应体积至 15 × 106 每生物反应器管的细胞转移至50 mL管中。</li>
	<li>300 × g 离心细胞 g 3 分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，将细胞重悬于2 mL无饲养层iPSC维持培养基中，并加入ROCK抑制剂。</li>
	<li>用培养基将每支50 mL离心管补至18 mL（细胞接种密度为0.75 × 106 细胞/mL）。将细胞悬液分装至生物反应器管中（每管20 mL）。</li>
	<li>将试管放入生物反应器系统中。设置以下培养参数：2 秒旋转周期，60 rpm 旋转速度，无搅拌暂停 37 °C，以及5% CO2 无限期20.</li>
	<li>启动培养程序 通过 生物反应器显示屏</li>
	<li>第二天更换培养基。让聚集体在生物反应器管中静置约5分钟，然后小心吸除上清液。 
	注意：切勿让聚集体沉降超过10分钟，否则它们可能会相互粘附，形成非均质的聚集体悬浮液。建议在生物反应器管中保留约5 mL培养基。</li>
	<li>每管加入15 mL新鲜的无ROCK抑制剂的无饲养层iPSC维持培养基，在台式生物反应器中继续培养24小时。</li>
</ol>
3. 将hiPSCs分化为早期神经元（第0天）
<ol>
	<li>制备神经基础培养基（NBM）：将50% DMEM/F-12（含稳定化L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽）与50%神经基础培养基混合，加入0.5×无血清添加剂（50×）、0.5×基于Bottenstein N-1配方的无血清添加剂（100×）、0.5×稳定化L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5× MEM非必需氨基酸溶液（100×）、500 nM丙酮酸钠（100 mM）、50 nM 2-巯基乙醇（50 mM）、0.025%人胰岛素溶液以及5 U/mL青霉素-链霉素。 
	注意：NBM需在4 °C保存，最多可使用2周。</li>
	<li>通过向hiPSC培养物中添加多西环素（DOX）启动神经元分化。操作时，先让生物反应器管中的细胞聚集体沉降，小心吸除上清液，保留约5 mL液体在管中，随后加入35 mL神经诱导培养基（NIM），该培养基由NBM和2 µg/mL DOX组成。 
	注意：由于DOX对光敏感，建议操作时关闭光源。</li>
	<li>将管子重新放回台式生物反应器中，继续培养。</li>
	<li>按照步骤3.2所述方法，每天更换培养基，持续2天。 
	注意：悬浮培养4天后，可将细胞聚集体进行解离，并将早期神经元冷冻保存或直接重铺用于终末成熟。</li>
</ol>
4. 早期神经元（第2天）的冷冻保存
注意：冷冻保存并非分化过程所必需，也不起关键作用，但强烈推荐使用，因为可以大量制备早期神经元并储存，用于后续的成熟和分析。
<ol>
	<li>让类器官聚集体在生物反应器管中自然沉降，按前述方法吸除上清液。</li>
	<li>将聚集体转移至无菌的15 mL或50 mL离心管中，用1× DPBS (-/-) 轻柔冲洗聚集体2次。尽可能小心地吸除上清液，避免扰动聚集体。</li>
	<li>根据沉淀物大小加入2–5 mL预热的细胞解离酶，于37 °C水浴中孵育约10分钟。每隔2分钟轻柔重悬已沉降的聚集体，直至聚集体完全解离。 
	注意：孵育7–10分钟后应获得近乎均一的单细胞悬液。</li>
	<li>加入三倍体积的预热NBM培养基，轻柔重悬细胞，以确保细胞充分单分散。</li>
	<li>计数细胞数量，并将相应体积的细胞悬液转移至15 mL或50 mL离心管中用于冻存。 
	注意：建议冻存密度为每毫升冻存液含5–10 × 106 个细胞。</li>
	<li>在300 × g 条件下离心3分钟。</li>
	<li>吸除上清液，并用含10%二甲基亚砜（DMSO）的相应体积冻存液轻柔重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞悬液分装至适合冻存的冻存管中（每管1 mL）。</li>
	<li>立即将冻存管放入预冷的程序降温冻存盒（内含2-丙醇），于-80 °C过夜。次日将冻存管转移至-150 °C进行长期保存。 
	​注意：液体2-丙醇高度易燃，接触后可能造成眼部损伤。应远离热源，并佩戴防护手套和护目镜。</li>
</ol>
5. 单层培养中由hiPSC分化而来的神经元的成熟
<ol>
	<li>准备用于长期培养 hiPSC 来源神经元的多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被培养皿。
	<ol>
		<li>将多聚-L-鸟氨酸储存液用 1× DPBS (-/-) 稀释至 0.001%，在 4 °C 下包被过夜，或在 37 °C 下包被 4 小时。吸除多聚-L-鸟氨酸溶液，并用 1× DPBS (-/-) 洗涤一次。</li>
		<li>将层粘连蛋白溶液用 1× DPBS (-/-) 稀释至终浓度为 10 µg/mL，在 4 °C 下孵育过夜，或在 37 °C 下孵育 4 小时。 
		注意：建议包被步骤中每 cm2 使用 0.1–0.15 mL 溶液，所有相应的洗涤步骤中每 cm2 使用 0.2 mL。可使用其他包被基质，但应评估其对细胞贴附和成熟可能产生的影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解冻冻存细胞。将冻存管置于 37 °C 水浴中，轻轻摇动约 1 分钟，直至仅剩少量冻结的细胞悬液团块。</li>
	<li>将细胞悬液逐滴小心转移至已加入 10 mL 预热 NBM 的 15 mL 离心管中。用 1 mL NBM 冲洗冻存管，并将冲洗液一并转移至同一 15 mL 离心管中。</li>
	<li>在 300 × g 条件下离心 3 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，加入 1–2 mL 含 10 µM ROCK 抑制剂的 NIM 培养基。</li>
	<li>轻柔重悬细胞沉淀，并计数细胞数量。</li>
	<li>吸除包被培养皿中残留的层粘连蛋白溶液，以 1 × 105 个细胞/cm2 的接种密度将细胞接种于含 10 µM ROCK 抑制剂的 NIM 培养基中。</li>
	<li>24 小时后更换为不含 ROCK 抑制剂的 NIM 培养基。</li>
	<li>连续 4 天每天更换培养基。</li>
	<li>完成 NGN2 诱导的初始阶段后，去除 DOX，将细胞培养于 NBM 中，每周进行两次半量换液，直至达到所需的成熟阶段。 
	注意：建议将 iNGN2 神经元与星形胶质细胞共培养，以提高细胞存活率、贴附性、成熟度及电生理活性13,22。</li>
</ol>
6. 人诱导多能干细胞分化神经元的表征
注意：可通过以下技术评估向神经元衍生物的分化。
<ol>
	<li>免疫细胞化学与成像
	<ol>
		<li>吸弃hiPSC来源神经元的培养基，用含Ca²⁺的1×DPBS洗涤细胞一次2+ 和 Mg2+ (+/+). 
		注意：移液时需小心操作，建议沿孔板边缘进行，因为细胞可能极易从表面脱落。每平方厘米加入0.2 mL液体。2 建议所有洗涤步骤均使用1x DPBS（+/+），以确保细胞被完全覆盖。</li>
		<li>使用含有4%多聚甲醛的DPBS (+/+)固定液在室温（RT）下固定神经元细胞15分钟。每平方厘米面积加入0.1 mL固定液2 建议。 
		注意：DPBS 中的多聚甲醛（4%）是一种具有急性毒性和潜在致癌性的有害溶液，对皮肤有刺激性。应远离热源，佩戴防护手套和护目镜，避免吸入，并仅在通风良好的环境中使用。</li>
		<li>用 1× DPBS (+/+) 轻柔冲洗细胞 2 次，随后进行染色。 
		注意：固定后的细胞可在 DPBS (+/+) 中保存 4 °C 最长可保存1个月，之后进行进一步处理。</li>
		<li>吸弃样品中的 DPBS (+/+)。用含 1% BSA 和 0.2% Triton-X-100 的 1x DPBS (+/+) 在室温下孵育 60 分钟，以通透细胞并阻断非特异性结合位点。 
		注意：每平方厘米面积加入0.2 mL体积2 建议。</li>
		<li>去除上清液，并将细胞在过夜孵育于 4 °C，用染色缓冲液（含1% BSA的1×DPBS [+/+]）稀释相应的一抗（见 材料清单确保细胞完全被溶液覆盖。 
		注意：每平方厘米面积加入 0.1–0.15 mL 体积2 建议。</li>
		<li>吸去染色缓冲液，并用1× DPBS (+/+) 重悬细胞，洗涤3次。</li>
		<li>稀释相应的二抗（参见 材料表) 于染色缓冲液中按1:1,000的终浓度进行染色。</li>
		<li>在室温避光条件下，将细胞置于稀释的抗体溶液中孵育1小时。确保细胞完全被溶液覆盖。 
		注意：每平方厘米面积加入 0.1–0.15 mL 体积2 建议。</li>
		<li>吸去二抗溶液，用1× DPBS（+/+）将细胞冲洗2次。</li>
		<li>用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染，以 DPBS (+/+) 稀释后室温避光孵育 5 分钟。 
		注意：每平方厘米的工作体积为 0.1–0.15 mL2 建议。</li>
		<li>用 1× DPBS (+/+) 洗涤细胞 2 次。</li>
		<li>将细胞保存在 DPBS (+/+) 中 4 °C 直至成像。 
		注意：明场成像适用于追踪形态学变化和神经突生长。此外，可通过荧光显微镜评估特征性标志物的表达。未分化的hiPSCs表达OCT 3/4和NANOG，而β-III-微管蛋白（TUBB3）和微管相关蛋白2（MAP2）可作为神经元标志物用于可视化神经突和轴突。通过测量明场或荧光图像中的神经突长度，可进一步评估神经突网络。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过定量实时聚合酶链式反应（qPCR）进行基因表达分析
	<ol>
		<li>吸弃培养基，用1x DPBS (-/-) 洗涤细胞一次。 
		注意：每平方厘米加入0.2 mL体积2 建议。</li>
		<li>加入冷的RNA裂解缓冲液，用刮棒刮取细胞收集样本。</li>
		<li>使用合适的柱式试剂盒提取RNA，并通过紫外分光光度法测定RNA浓度。</li>
		<li>使用250 ng总RNA和合适的反转录试剂盒合成cDNA。</li>
		<li>配制分子信标qPCR反应体系，每反应加入2.5 ng cDNA，设两个复孔。使用适当的预混液及相应的引物探针组合20 （参见 材料表).</li>
		<li>运行qPCR，进行45个循环，引物退火温度设为 60 °C 20 秒。</li>
		<li>将相对基因表达水平归一化至内参基因GAPDH、HPRT1和GUSB的平均值，采用ΔΔCt法进行分析。23，以未分化的 hiPSCs 作为校准品。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

已有研究表明，异位表达神经元转录因子NGN2可在培养1周内加速人诱导多能干细胞（hiPSCs）神经元分化的早期阶段，并诱导其向神经元谱系定向分化12,13,20。本研究描述了一种利用台式生物反应器将基因编辑的BIONi010-C-13 hiPSCs分化为iNGN2神经元的详细实验方案。
CERO 3D 生物反应器是一种小体积生物反应器，配有四个用于专用管的插槽，每根管的最大容量为 50 mL。温度和 CO2 水平持续受控，且每个管的培养参数（如转速和时间）均可独立调节，使用户能够并行开展多种分化方案。内管壁上集成的挡板可在低剪切力条件下扰动培养基，并在受控旋转过程中维持 3D 细胞聚集体的悬浮状态。营养物质的有限供应以及增强的 3D 细胞间和细胞-细胞外基质（ECM）相互作用，可能显著影响细胞分化和行为24,25,26,27。
将细胞以悬浮状态培养为三维细胞聚集体可增强这些细胞间的相互作用，从而更紧密地模拟组织或器官的体内环境28。培养基的同步扰动由于机械摩擦作用可调控聚集体的大小，同时改善气体交换，并降低管内营养物质与代谢废物的浓度梯度，而聚集体内部仍可维持生理相关的浓度梯度29,30,31,32,33,34。尽管培养基更换仍需手动操作，但台式生物反应器相比静态培养瓶可显著降低人力投入和运行成本。此外，与完全自动化的搅拌罐式生物反应器相比，该生物反应器具有多项优势：其无搅拌桨的设计可减少聚集体表面的流体动力剪切应力，不仅提高了细胞存活率，还能限制剪切应力对敏感的诱导多能干细胞（iPSCs）的分化及功能产生的影响35,36,37,38。
垂直轮式生物反应器通过大型垂直搅拌器搅动细胞，而摇摆式生物反应器则使用连接在电机平台上的充气培养袋，这两类系统代表了替代性的三维悬浮培养平台。尽管这些系统在hiPSCs的培养中已得到广泛测试17,18,19,39,40，但其在神经分化策略中的适用性尚不明确，相关报道仅限于在搅拌罐式生物反应器中成功扩增哺乳动物和人类神经前体细胞41,42,43,44，且极少研究关注细胞成熟过程44,45。总体而言，自动化三维悬浮培养平台具备全自动、计算机控制的换液功能，从而减少了操作差异并最大限度降低了污染风险。此外，乳酸和葡萄糖浓度等营养参数可实现持续监测。然而，这类系统的建立通常需要较高的初期投入、充足的实验室空间以及专业人员的培训。台式生物反应器是一种紧凑且易于使用的悬浮细胞培养替代方案，但无法同时实现对营养物质的实时监测。
与大多数用于三维悬浮培养细胞的实验方案一样，初始聚集体的形成是一个关键步骤。hiPSCs 首先以贴壁单层形式培养，随后被解离为单细胞悬液并转移至三维培养环境。为尽量减少此阶段的细胞损失，需考虑多个因素。由于培养管内置有防波挡板，因此每管至少需要10 mL的培养体积，以确保培养基达到最佳扰动效果。从长期来看，培养体积不应低于该临界值。此外，强烈建议每10 mL培养体积以750万个细胞的起始接种密度，并在60 rpm的转速下进行培养，以快速形成稳定的细胞聚集体，但具体参数可能需根据不同的细胞系进行相应调整。
将hiPSCs转入悬浮培养后，应在24小时内形成细胞聚集体。首次换液尤为关键，因为此时聚集体较小，可能无法充分沉降。可适当延长聚集体沉降时间，但不应超过10分钟，否则聚集体可能开始发生团聚，并以异质方式生长。吸液过程中，应至少保留5 mL的最小培养体积，避免对培养基造成扰动。尽管如此，在培养初期仍会有部分细胞和聚集体损失。细胞计数结果显示，培养前两天细胞产量保持稳定，表明hiPSCs的高增殖能力可弥补初始的细胞损失。一旦进入悬浮培养状态，通过轻柔的培养操作和减少扰动，可获得大小均一的聚集体，并随时间推移持续生长。
神经元分化基于先前发表的方案进行，该方案依赖于多西环素诱导的NGN2过表达13，并对各个步骤进行了针对三维培养的优化。神经元转录因子NGN2在神经元分化中是一种已有充分描述的驱动因子，可显著加速神经元诱导过程11,13,46。传统方法依赖特定生长因子进行模式化诱导，通常需要数周至数月时间7,8,9，而NGN2的表达可在数天内诱导神经元细胞命运的转变。除了培养时间显著缩短外，该方案在初始悬浮培养阶段既不需要昂贵的生长因子，也不依赖包被基质，从而进一步降低了培养成本。
此外，在贴壁培养和悬浮培养条件下对NGN2诱导生成未成熟神经元的直接比较显示，使用台式生物反应器培养4天后，细胞数量增加了1.36倍20，同时生成100万个细胞所需的培养基体积预计可减少一半。因此，采用台式生物反应器生成iNGN2神经元可能具有优势，可在更短的操作时间和更低的成本下获得更高数量的细胞。与既往报道一致，早期即可观察到神经谱系的定向分化。在NGN2诱导2天后，经典的神经元标志物如TUBB3、MAP2和MAPT已出现显著表达，表明台式生物反应器适用于神经元诱导。按照本方案，可在4天培养期内从100万个hiPSCs获得约620万个未成熟iNGN2神经元。然而，产量可能因批次不同而有所差异，并受接种时悬浮培养体积的影响。
为了进一步提高产量，将培养时间延长了额外的3天；然而，尽管细胞聚集体变得更大，但也变得更加致密，无法有效地解离用于冻存或重新接种。尽管三维培养技术已取得进展，贴壁的二维神经元培养仍然是进行微电极阵列或钙成像等功能分析的金标准。因此，细胞单细胞化是获得均匀分布的神经元单层及致密神经突网络的重要前提。可采用更强的机械解离方法或剧烈的解离试剂以确保单细胞化，但这可能对细胞活力、生理状态及再贴附能力产生不利影响47,48。鉴于后续分析和成熟过程对单细胞的需求，悬浮培养4天后对聚集体进行解离，并将（第2天）iNGN2神经元进行冻存。冻存后复苏培养及对iNGN2神经元的表征结果证实，神经元培养物的成熟度逐步提高，并形成了致密的神经突网络。
本方案可获得大量iNGN2神经元，但仍需考虑若干局限性。与大多数悬浮培养平台类似，将hiPSCs从二维贴壁培养转移至三维环境的过程十分关键，且常伴随显著的细胞损失。在换液过程中，预计还会出现进一步明显的细胞和聚集体损失。与自动化平台相比，使用台式生物反应器会增加操作时间和污染风险，因为换液必须手动完成。除缺乏自动化外，台式生物反应器无法实时监测营养物质，且每管最大容量仅为50 mL，限制了该方案的放大潜力。最后需要指出的是，尽管NGN2可加速神经谱系的定向分化，但终末成熟所需时间并未缩短，仍需持续数周的长期培养。鉴于星形胶质细胞对神经元功能、贴附和存活具有重要作用49,50,51，应考虑采用共培养策略，该策略对于长期培养可能尤为必要。
综上所述，通过使用台式生物反应器，已成功将二维分化方案转化为三维环境，从而快速且可重复地生成iNGN2神经元。该方案可获得大量高质量的诱导多能干细胞来源的神经元，可作为复杂模型测试、高通量药物筛选和大规模毒性检测的起始材料。

神经系统疾病是全球致残的首要原因1六分之一的人受到影响，且发病率持续上升。这给社会及其医疗保健系统带来了巨大的经济负担。2010年对30个欧洲国家的评估估计，年度相关费用 &#8364;8000亿与精神和神经系统疾病相关2日益加重的社会经济负担对有效的治疗策略提出了迫切需求，尽管我们对疾病病理生理学的理解已显著加深，但向临床转化的效果往往不尽如人意。总体而言，仅有12%的药物能够进入临床试验，其中超过80%在后期阶段失败，主要原因是疗效不足或出现意外毒性。3,4原因多种多样，但动物实验在临床前阶段向人体试验转化的能力有限，这一问题日益凸显5人类 体外 细胞和组织模型可能弥合跨物种转化的鸿沟，而人源诱导性多能干细胞（hiPSC）技术的进步在这一领域具有巨大潜力。hiPSC在基础研究中被广泛应用，且与胚胎干细胞（hESCs）具有若干关键共性，例如近乎无限的自我更新能力，以及分化为三个胚层细胞的能力。6,&#160;同时避免了与胚胎破坏相关的伦理问题。
由人胚胎干细胞（hESCs）以及随后的人诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生神经元细胞标志着脑科学研究的一个里程碑。最初的分化方案基于应用生长因子以模拟胚胎发育过程中关键步骤，其中大多数方案涉及在悬浮或贴壁培养中进行双SMAD抑制7,8,9。尽管已成功生成成熟神经元，但这些方案仍存在若干缺陷，限制了其在药物开发中的广泛应用，例如所获得神经元的产量低、批次间差异大，以及因长期培养带来的大量工作负担。通过强制表达在神经发生中起关键作用的转录因子，尤其是神经源素（neurogenin, NGN）家族成员NGN2，已实现了技术改进，NGN2被证实为有效的驱动因子10。通过慢病毒介导在hiPSCs中异位表达NGN2，可显著加速神经分化的早期阶段，并在仅1周内诱导神经细胞命运的转变11。随后在与星形胶质细胞共培养体系中进行终末成熟，可获得高纯度、高产量且具有可重复特性的功能性神经元。进一步通过位点特异性基因编辑技术靶向腺相关病毒整合位点1（AAVS1）这一安全港基因座，构建了可稳定表达且可由多西环素诱导的NGN2表达盒hiPSC细胞系12,13，从而最大限度地减少了慢病毒递送可能带来的非预期副作用。
强力且高效的强力霉素诱导型神经原蛋白2（iNGN2）神经元分化在表型高通量药物筛选和毒性检测中具有巨大潜力10,14,15；过去十年中，生物工艺领域取得了显著进展，已采用生物反应器实现细胞扩增与分化的可扩展性16,17,18,19。然而，大多数分化方案均针对贴壁培养体系优化，向三维（3D）环境的转化通常需要进行关键性修改。近期已有报道，成功利用一种剪切应力降低的台式3D生物反应器进行hiPSCs的扩增，并可重复地分化为肝细胞、心肌细胞和神经元20。本文提供了利用相同台式3D生物反应器生成和表征iNGN2神经元的详细方案。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇 50 mM</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11528926</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Nunclon Delta 表面培养皿</td><td>Nunc</td><td>734-2040</td><td></td></tr><tr><td>抗β III微管蛋白抗体 [TU-20]（稀释比例 1:1,000）</td><td>Abcam&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>ab7751&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>应用生物系统公司&amp;nbsp;高容量cDNA反转录试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10400745</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓缩）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530536</td><td>无血清添加剂（50倍浓缩）</td></tr><tr><td>BIONi010-C-13 人诱导多能干细胞系</td><td>欧洲诱导多能干细胞库（EBiSC），BIONEER 作为储存者</td><td>SAMEA103988285</td><td>Bioneer 是 EBiSC 的储存机构，也是该 hiPSC 细胞系的所有者。</td></tr><tr><td>BioRender&amp;nbsp;</td><td>Biorender.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA 细胞培养级</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>12330023</td><td></td></tr><tr><td>CERO 3D 培养箱 &amp;和生物反应器</td><td>OLS OMNI生命科学</td><td>2800000</td><td></td></tr><tr><td>CEROtubes 细胞培养管 50 mL</td><td>OLS OMNI生命科学</td><td>2800005</td><td></td></tr><tr><td>Citavi 6</td><td>瑞士学术软件公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>干细胞</td><td>7930</td><td>含10% DMSO的冻存液</td></tr><tr><td>Cytofix 固定液</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>554655</td><td>含4%多聚甲醛的固定液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI（NUCBLUE 固定细胞染色剂）&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>12333553</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多西环素（DOX）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3447</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（DPBS -/-）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>含钙和镁的DPBS（DPBS +/+）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11580456</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-/-)</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12，含GlutaMAX添加剂</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core 细胞成像系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>35050-038</td><td>稳定化L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽</td></tr><tr><td>ImageJ 1.51v&amp;nbsp;</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人胰岛素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278l</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>默克</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant 分析仪</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 单克隆抗体（稀释比例 1:300）</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>13-1500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>基质胶 生长因子减少型，无酚红&amp;nbsp;</td><td>康宁生命科学&amp;nbsp;</td><td>356231</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学粘性膜试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10095714</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>干细胞</td><td>85850</td><td>无饲养层iPSC维持培养基&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-2 补充剂（100 倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>基于Bottenstein的无血清补充剂&amp;rsquo;s N-1 配方</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>11570556</td><td></td></tr><tr><td>尼康 Eclipse TS2</td><td>尼康仪器欧洲有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter-NC200</td><td>ChemoMetec A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 2021</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>破膜/洗涤缓冲液&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>引物检测 TUBB3(Hs00801390_s1)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>引物检测 GAPDH (Hs99999905_m1)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>引物探针组 GUSB (Hs99999908_m1)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>引物探针法 HPRT1 (Hs99999909_m1)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>引物探针法 MAP2 (Hs00258900_m1)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>引物探针法 MAPT (Hs00902194_m1)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>引物检测 POU5F1 (Hs04260367_gH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>0.01% 聚-L-鸟氨酸</td><td>默克</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro 试剂盒（50）- 套件</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td>基于柱法的RNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>RLT缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>细胞裂解缓冲液</td></tr><tr><td>丙酮酸钠 (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>12539059</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>11599686</td><td>细胞解离酶</td></tr><tr><td>TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>11380912</td><td>qPCR预混液</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 酶</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Via1-卡带</td><td>ChemoMetec A/S</td><td>941-0012</td><td></td></tr><tr><td>宽孔滤芯吸头</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10088880</td><td></td></tr><tr><td>X20 光学 96 孔快速透明反应板&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15206343</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐，Rho 激酶抑制剂（ROCK 抑制剂）</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr></tbody></table>

在三维悬浮生物反应器中生成人源神经原性因子2可诱导神经元

Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor

利用人诱导性多能干细胞（hiPSCs）获得神经谱系细胞是脑科学研究中的一个重要里程碑。自首次问世以来，相关实验方案不断得到优化，现已被广泛应用于科研与药物开发领域。然而，传统分化与成熟方案耗时极长，同时高质量hiPSCs及其神经衍生物的需求日益增长，这迫切要求将这些方案应用于大规模生产，并对其进行优化和标准化。本研究展示了一种快速且高效的实验方案，利用台式三维（3D）悬浮生物反应器，将经基因改造、可由多西环素诱导表达神经源素2（iNGN2）的hiPSCs分化为神经元。
简而言之，iNGN2-hiPSCs 的单细胞悬液在24小时内形成细胞团，通过添加多西环素诱导其向神经谱系分化。诱导2天后，将细胞团解离，细胞可进行冻存或重新接种以进行终末成熟。所生成的iNGN2神经元早期即表达经典的神经元标志物，并在重新接种后1周内形成复杂的神经突网络，表明神经元培养物的成熟度逐步提高。综上，本文提供了一套详细的分步实验方案，可在三维环境中快速生成hiPSC来源的神经元，该方法在疾病建模、表型高通量药物筛选以及大规模毒性测试中具有广阔的应用前景。

在初始步骤中，将贴壁培养的hiPSCs解离、单细胞化并转移至悬浮培养状态（图2）。细胞聚集体在24小时内形成，并持续增大。经过2天的转基因诱导后，早期神经元可被冷冻保存以用于后续实验。
悬浮培养初期持续的细胞增殖导致细胞数量增加，在诱导后第2天达到峰值（图3A、B）。随着细胞增殖，细胞聚集体开始增大。与第0天相比，第2天时聚集体直径增加约50%，第5天时几乎增加一倍（图3D）。尽管聚集体直径增大可能限制其内部营养物质的供应，但在分化第2天和第5天，细胞活力并未受到影响（图3C）。然而，若在悬浮状态下培养超过4天，则无法进一步提高细胞产量，因为聚集体对酶解单细胞化的抵抗性逐渐增强（图3B）。
冻存后，第2天的细胞被解冻并接种到多聚-L-鸟氨酸（PLO）-层粘连蛋白包被的培养皿中进行终末成熟。通常情况下，细胞在解冻后贴壁良好，并早期即开始延伸神经突。通过时间依赖性的基因表达谱分析以及对神经元标志物TUBB3和MAP2的免疫细胞化学染色，可确认细胞的神经元身份（图4A、B）。除了TUBB3和MAP2水平逐渐升高外，神经元培养物中微管相关蛋白tau的转录本（MAPT）也富集，该蛋白参与轴突的稳定；同时，多能性调控转录因子POU5F1的表达相应下降。此外，在解冻后的第一周内即形成致密的神经突网络（图4C）。这些形态学变化与转录谱特征共同表明神经元培养物的成熟程度逐步提高。
<img alt="显示时间线的神经元诱导示意图；生物反应器、培养、成熟阶段示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用台式生物反应器生成hiPSC来源的iNGN2神经元。 （A）分化流程的示意图，突出显示细胞培养的关键步骤。（B-F）明场图像显示（B）hiPSCs以及（C,D）在台式生物反应器中聚集体的形成。（E,F）iNGN2神经元在分化过程中延伸出神经突并发生形态学变化。比例尺 = 100 µm。缩写：BMM = 基底膜基质；iPSC-MM = iPSC维持培养基；PLO = 多聚-L-鸟氨酸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="5天内的细胞聚集过程；显微镜图像、产量、活力、聚集体大小图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：聚集形成与生长过程中的细胞产量与活力。（A）明场图像显示了在台式生物反应器中培养2天内聚集体的形成，以及随时间推移聚集体尺寸的增加。比例尺 = 500 µm。（B）细胞产量和（C）分化过程中的活力定量分析。柱状图表示四次独立实验的平均值 + 标准差（SD）。（D）聚集体直径（反映其大小）使用开源软件 ImageJ（版本 1.53）半自动测定。首先将明场图像转换为二值图像，然后使用分析颗粒工具进行进一步分析，应用以下参数：大小 &gt; 2,500 µm2，圆度 0.45–1，排除边缘，以及包含孔洞。水平线表示五次独立分化实验的平均值 ± 标准差。单个圆点代表每次独立分化实验的平均值，每个时间点至少分析20个聚集体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达图谱、荧光显微镜图像、神经突网络柱状图、细胞分化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：hiPSC来源的iNGN2神经元的表征。 神经元基因 TUBB3, MAP2 和 MAPT 以及多能干细胞相关基因 POU5F1 的时间依赖性基因表达谱。相对表达水平以参考基因 GAPDH, HPRT1 和 GUSB 进行归一化处理。未分化的hiPSCs（第-2天）被选为校准样本。几何符号表示四次独立分化实验的平均值 ± 标准差。（B）解冻后第7天（第-2天 + 7）iNGN2神经元的代表性图像，免疫荧光染色标记β-III微管蛋白（TUBB3，品红色）和微管相关蛋白2（MAP2，青色）。细胞核用DAPI复染。比例尺 = 100 µm。（C）解冻后神经元培养物明场图像中神经突网络的评估。使用ImageJ（版本1.53）在930.82 × 698.11 µm2 的区域内测定神经突总长度。在调整亮度和对比度后，图像被转换为8位图像并进行颜色反转。随后使用ImageJ插件“Skeletonize”对神经突进行骨架化，并使用“Analyze Skeleton”插件进行分析。神经突总长度除以感兴趣区域内的胞体数量，得到每个细胞的平均神经突长度。柱状图表示三次独立实验的平均值 + 标准差。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在台式3D悬浮生物反应器中生成人诱导性多能干细胞来源神经元的实验方案。

由人类诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生神经元谱系细胞标志着脑科学研究的一个里程碑。自首次报道以来……

利用生物反应器将诱导性多能干细胞（iPSC）培养方案从二维（2D）转化为三维（3D），可实现大量细胞的生产，适用于高通量筛选等大规模应用。该在生理化三维环境中进行的快速神经元分化方案，可增强起始细胞间的相互作用，在更短时间内获得高产量细胞，且批次间差异小，从而降低时间和成本。欧洲诱导性多能干细胞库正在采用类似方法，快速、低成本地生成多种谱系的分化细胞，包括其他脑细胞和心肌细胞。当人诱导性多能干细胞（human iPSC）培养物达到60%至80%融合度时，开始预培养。完全吸除人iPSC培养基，用1×DPBS轻柔冲洗细胞两次。向6厘米培养皿中加入2毫升预热的胰蛋白酶EDTA溶液，在37摄氏度培养箱中孵育3分钟。然后轻轻敲击培养皿，以促进细胞脱落；如果细胞仍未脱落，可再孵育一到两分钟。接着，在每个培养皿中加入 5 毫升含 ROCK 抑制剂的无饲养层 iPSC 维持培养基，重悬细胞。将细胞悬液转移至 15 毫升或 50 毫升离心管中，通过移液轻轻吹打混匀，以确保细胞充分单细胞化。使用自动细胞计数仪测定100微升细胞悬液中的细胞数量，并将所需体积的细胞悬液转移至50毫升离心管中。在300 ×g条件下离心3分钟。随后吸除上清液，并将细胞重悬于2毫升含ROCK抑制剂的无饲养层iPSC维持培养基中。向每个50毫升离心管中加入18毫升培养基。然后，将20毫升细胞悬液分装至每个生物反应器管中。将管子放入生物反应器系统，并设置培养参数以进行无限时长的培养。通过生物反应器显示屏启动预培养程序。若需在第二天更换培养基，先让聚集体在生物反应器管中静置约五分钟，然后小心吸除上清液。每管加入15毫升不含ROCK抑制剂的新鲜无饲养层iPSC维持培养基，并在台式生物反应器中继续培养24小时。为启动神经元分化，让细胞聚集体在生物反应器管中沉降，并小心吸除上清液，保留约5毫升上清液在管中。随后加入35毫升神经诱导培养基，该培养基由Neurobasal培养基和每毫升2微克的多西环素组成。将管子重新放回台式生物反应器中，继续培养。每天更换培养基一次，持续两天，操作如前所示。吸取上清液后，将细胞聚集体转移至无菌的15毫升或50毫升离心管中，用DPBS轻轻冲洗聚集体两次。小心尽可能吸除上清液，避免扰动细胞聚集体。根据沉淀物的大小，向其中加入2至5毫升预热的细胞解离酶，然后将细胞在37摄氏度水浴中孵育约10分钟。每2分钟轻轻重悬一次沉淀的细胞团块，直至团块完全解离。加入预热的Neurobasal培养基，体积为之前加入的细胞解离酶体积的3倍，并小心重悬细胞，以确保细胞充分单细胞化。确定细胞数量，并将相应体积的细胞悬液转移至15毫升或50毫升离心管中用于冻存。在300 ×g条件下离心3分钟。吸除上清液，并用含有10%二甲基亚砜的冻存液轻柔重悬细胞沉淀。将细胞悬液分装至适合冷冻保存的冻存管中。立即将冻存管放入预冷的、装有2-丙醇的程序降温冻存盒中，并将冻存盒置于-80摄氏度过夜。次日将冻存管转移至-150摄氏度进行长期保存。在人iPSC贴壁培养物被解离、单细胞化并转入悬浮培养后，24小时内形成细胞聚集体并持续生长。在转基因诱导两天后，早期神经元可被冷冻保存以用于后续成熟。观察到人iPSC在悬浮培养初期持续增殖，细胞数量在诱导两天后达到峰值。然而，悬浮培养超过四天并未提高细胞产量，因为细胞聚集体对酶解单细胞化的抵抗性逐渐增强。此外，与第0天相比，第2天聚集体直径增加了50%，第5天时几乎增加了一倍。尽管直径增大限制了营养物质向聚集体内部的供应，但在分化第2天和第5天，细胞的存活率并未受到影响。通过时间依赖性基因表达谱以及对神经元标志物 beta three tubulin 和微管相关蛋白（MAP2）的免疫化学染色，证实了冻存两天的细胞具有神经元细胞特性。此外，神经元培养物中富含微管相关蛋白 tau 转录本（MAPT），同时多能性调控转录因子 POU5F1 的表达相应下降。解冻后第一周内形成了致密的神经突网络，提示神经元培养物的成熟度逐渐增加。该方案为向大规模且完全自动化的生物反应器转化奠定了基础，后者在未来的大规模应用中可进一步显著提高细胞产量。神经基因素2（neurogenin 2）已证实，利用线性决定性转录因子加速分化的方法已被应用于多种不同细胞类型和疾病，以促进诱导多能干细胞（iPSC）的建模研究。

production-human-neurogenin-2-inducible-neurons-three-dimensional

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在三维悬浮生物反应器中产生人神经原蛋白2诱导神经元

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

本文描述了利用自组装三维支架培养人类神经前体细胞的方法。我们提供了一种从支架中释放细胞的方案，以便后续对细胞进行分析，例如通过流式细胞术。该方案可适用于其他细胞类型，以开展深入的机制性研究。...

三维自组装肽水凝胶中人类神经前体细胞的培养

多能性人类干细胞（hPSCs）的神经元分化方案通常耗时较长，且需要较高的细胞培养技术。本文中，我们改进了一种基于小分子的分化方法，将其应用于多孔板体系，从而能够以简单、快速且高效的方式在受控条件下生成人类神经元。...

在多孔板格式中快速高效地从人类多能干细胞生成神经元

本视频展示了将人胚胎干细胞（hESCs）分化为多巴胺能神经元的过程，以提供研究帕金森病的模型。将hESCs在微孔板中的神经诱导培养基中培养，形成三维神经球。随后在神经诱导培养基中继续培养，以促进其分化为多巴胺能前体神经元。最终神经元的成熟过程在培养小室中的气液界面条件下进行，从而形成由成熟多巴胺能神经元组成的三维类器官。...

由人胚胎干细胞生成多巴胺能神经元类器官

锥体神经元的树突棘是哺乳动物大脑皮层中大多数兴奋性突触的所在部位。本方法描述了对来源于诱导 多能干细胞的人类皮层锥体谷氨酸能神经元的树突棘形态进行三维定量分析。...

源自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘三维定量分析

直接神经元重编程生成的神经元可保持起始体细胞的年龄特征。本文介绍了一种基于单载体的方法，用于从成年人类供体获取的皮肤成纤维细胞中诱导生成神经元。...

由成人皮肤成纤维细胞简单高效地生成诱导神经元的高产率培养方法

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。...

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

本研究介绍并描述了两种特定人源神经类器官的培养方案 ，作为研究以下两个方面的相关且精确的模型：1）仅在人源神经类器官内研究人脑胶质母细胞瘤的发展；2）生成三维类器官以诱导多巴胺能神经元分化。...

人脑类器官在脑癌与神经退行性疾病研究中的应用

本方案提供了一种全面的流程，通过在组织培养芯片中由类球体自发组装延伸出强健的轴突束，从而构建人诱导多能干细胞来源的运动神经类器官。...

三维运动神经类器官的生成

由于缺乏足够的工具和方法，神经退行性疾病中神经元与胶质细胞之间的相互作用尚未被充分理解。在此，我们描述了从人多能干细胞获得诱导神经元、少突胶质前体细胞以及少突胶质细胞的优化方案，并举例说明这些方法在理解阿尔茨海默病中细胞类型特异性贡献方面的应用价值。...

由多能干细胞生成人神经元和少突胶质细胞以模拟神经元-少突胶质细胞相互作用

多能干细胞, 神经元, 少突胶质细胞, 细胞分化, 神经发育, 共培养, 神经退行性疾病, 人源细胞模型, 髓鞘形成, 神经胶质生物学

本文介绍了一种利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元和星形胶质细胞进行三维生物打印共培养的实验方案。该共培养模型在96孔或384孔板中的水凝胶支架内构建，打印后细胞存活率高，7天内可见明显的神经突生长，并表达两种细胞类型的成熟标志物。...

利用人iPSC来源的神经元-星形胶质细胞共培养体系进行三维生物打印以用于筛选应用

了解如何使用三维悬浮生物反应器从人诱导多能干细胞高效分化神经元。该方法可在生理环境中实现高细胞产量和快速神经分化，适用于大规模应用。

在三维悬浮生物反应器中生成人源神经原性因子2可诱导神经元

探索更多视频