使用参考试剂确认细胞因子释放测定法预测单克隆抗体安全性的稳健性

新药的安全性检测至关重要，该方案描述了如何使用经过验证的标准品来评估 CRS 平台的可重复性、稳健性和潜在局限性。该技术已在 11 个不同的实验室中使用这些试剂进行了验证，并且一项国际合作研究观察到了类似的反应模式，因此提高了协调性和可重复性方面的工作。该技术的应用扩展到改进新型治疗性抗体的 CRS 风险测试，也将有助于为潜在副作用的临床管理做好准备。

这项工作是为了提高可重复性和协调性，而视觉演示提高了可重复性的机会。首先将参比试剂安瓿瓶的内容物溶于一毫升无菌蒸馏水中，并静置 5 至 10 分钟的再水化。然后，在将抗体溶液转移到无菌加盖试管中之前，将其适当混合。

接下来，在无菌 PBS 中将每种重构的抗体和测试抗体稀释至 10 μg/mL。取无菌、未经 TC 处理的 U 形底聚丙烯 96 孔微量滴定板，向板的指定孔中加入 100 μL 所需的稀释抗体溶液。然后，在进行固相测定之前，将板在 4 摄氏度下孵育过夜。

将至少 30 毫升外周血采集到肝素化管中后，将其倒置数次，以确保血液样本与肝素钠正确混合。将 15 毫升全血样品放在单独的试管中，以备稍后在水相全血测定中使用。通过添加等体积的 PBS 或无血清 RPMI 1640 培养基来稀释剩余的 15 mL 全血。

将稀释的血液轻轻地铺在 50 mL 试管中的 15 mL 密度梯度培养基的顶部。使用 500 G 和室温下降低加速度的水平转子将管子离心 20 分钟，以将血液分离成不同的成分。离心后，密度梯度将分离为血浆的顶层，然后是一层含有 PBMC 的薄薄的血沉棕黄层和含有红细胞和多形核粒细胞（包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞）的底层。

小心去除上层血浆，然后去除下一层，以收获 PBMC。洗涤时，将收获的血沉棕黄层重悬于 10 毫升 PBS 或无血清 RPMI 1640 培养基中。将试管从 500 G 离心开始 10 分钟以沉淀细胞。

弃去上清液并再次重复洗涤。然后，将所得沉淀重悬于 2 mL 完全 RPMI 培养基中。使用血细胞计数器计数细胞，并在完全 RPMI 中将 PBMC 浓度调节至每毫升 100 万个细胞。

对于水性相全血细胞因子释放测定，取先前放置的全血样品，将 190 μL 样品添加到 96 孔 U 形底聚苯乙烯板的孔中，加入热处理抗体和参比试剂，在 PBS 中预稀释至 100 μg/mL，并将 10 μL 所需稀释抗体添加到含有 190 μL 全血的指定孔中。将板在 37 摄氏度的加湿培养箱中孵育 48 小时。对于固相 PBMC 细胞因子释放测定，获得先前制备的包被板。

使用多通道移液器，丢弃包被板中的抗体溶液。用 PBS 填充试剂储液槽后，用 200 μL PBS 洗涤板 3 次，以去除未结合的单克隆抗体。向每个孔中加入 200 微升先前制备的 PBMC 悬浮液。

将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育 48 小时。与对照和检测单克隆抗体孵育 48 小时后，将板以 400 G 离心 5 分钟。收集细胞条件培养基或血浆，而不会干扰细胞沉淀。

将收集的上清液或血浆在零下 20 摄氏度下冷冻。PBMC 固相测定结果表明，与匹配的同种型对照相比，阳性对照抗体诱导的细胞因子水平显著升高。还观察到，抗 CD28 超激动剂诱导的白细胞介素 2 或 IL-2 释放的倍数变化明显高于其匹配的同种型，而抗 CD3 和抗 CD52 在仍诱导 IL-2 表达的同时，导致较低的倍数变化。

在全血水相测定中，可检测细胞因子的水平相对低于固相测定，但其特征是对抗 CD52 刺激的敏感性更高。