Name: 阐明植物中2,4-二溴苯酚的代谢 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:25:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 了解植物愈伤组织培养技术如何用于鉴定2,4-二溴苯酚代谢物。该方法通过排除微生物干扰和简化基质效应，为研究作物中有机污染物的吸收行为与代谢机制提供了高效准确的实验手段。

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本研究由国家自然科学基金（21976160）和浙江省公益技术应用研究项目（LGF21B070006）资助。

1. 胡萝卜愈伤组织的分化
注意：此处使用的所有设备均需进行高压灭菌，并在经紫外线灭菌的超净工作台内进行所有操作。
<ol>
	<li>将均匀的胡萝卜种子（Daucus carota var. sativus）浸入去离子水中，在 4 °C 下春化处理 16 小时。</li>
	<li>在无菌条件下，用 75% 乙醇对春化后的种子表面消毒 20 分钟，然后用无菌去离子水冲洗三次。</li>
	<li>在无菌条件下，再用 20% H2O2 对种子消毒 20 分钟，并用灭菌的去离子水洗涤六次。</li>
	<li>将种子无菌播种于不含激素的 MS 培养基（pH 5.8，121 °C 高压灭菌 20 分钟）中，培养基含 1% 琼脂糖凝胶，于 26 °C、16 小时光照周期（350 µmol/m2s）条件下培养 15 天，使其无菌萌发。</li>
	<li>将幼苗的下胚轴和子叶切成约 0.5 cm 的小段，获得外植体。</li>
	<li>在无菌条件下，将外植体转移至培养皿中（每皿 2 至 4 个外植体），培养皿内含 15–20 mL 无菌 MS 培养基，并添加生长素类似物（2,4-二氯苯氧乙酸；1 mg/L）和细胞分裂素（6-苄氨基嘌呤；0.5 mg/L）。</li>
	<li>将外植体置于黑暗条件下，26 °C 培养 3–4 周，以诱导愈伤组织形成。</li>
	<li>使用无菌解剖刀和镊子分离初始外植体上形成的愈伤组织（直径约 1 cm）。 
	注意：新形成的愈伤组织呈白色至乳黄色，质地疏松，附着于初始外植体上。</li>
</ol>
2. 2,4-二溴苯酚处理
<ol>
	<li>将1 µg的2,4-二溴苯酚溶解于10 mL无菌液体MS培养基中（2,4-二溴苯酚的终浓度为100 ppb，pH 5.6–7.0）。</li>
	<li>在无菌条件下，将3 g新鲜胡萝卜愈伤组织（步骤1.8）加入含有已配制2,4-二溴苯酚溶液（来自步骤2.1）的玻璃烧瓶中。此组设为2,4-二溴苯酚处理组。 
	注：玻璃烧瓶已高压灭菌，并用封口膜密封。</li>
	<li>设置仅含2,4-二溴苯酚溶液（步骤2.1中配制）的培养基对照组，用于评估2,4-二溴苯酚的非生物降解情况。</li>
	<li>设置仅含胡萝卜愈伤组织（不含2,4-二溴苯酚溶液）的空白对照组，用于检测是否存在潜在污染。
	<ol>
		<li>制备胡萝卜空白对照组：仅将3 g新鲜采集的胡萝卜愈伤组织加入10 mL无菌MS培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将2,4-二溴苯酚处理组及培养基对照组、空白对照组置于培养箱中，于130 rpm、26 °C黑暗条件下振荡培养120小时。</li>
	<li>培养120小时后，从培养箱中取出玻璃烧瓶，收集2,4-二溴苯酚处理组及各对照组的样品。 
	注：所有样品均设三个重复。</li>
</ol>
3. 样品制备
<ol>
	<li>使用玻璃纤维滤膜（0.45 µm）通过过滤将愈伤组织从MS培养基中仔细分离，用于2,4-二溴苯酚处理组及对照组。用超纯水洗涤三次后收集愈伤组织。</li>
	<li>用液氮冷冻干燥收集的愈伤组织，随后使用高通量组织研磨仪在70 Hz条件下均质化处理0.2 g愈伤组织，持续3分钟。</li>
	<li>用玻璃微量注射器向均质化的愈伤组织中加入50 µL浓度为25 mg/L的替代物4-n-NP-d4，并涡旋振荡1分钟。</li>
	<li>将样品加入5 mL甲醇/水（1:1, v/v）混合液，在装有冰水的超声波清洗器（150 W，40 kHz）中超声提取30分钟，以提取2,4-二溴苯酚及其代谢物。</li>
	<li>在4 °C条件下以8,000 × g离心10分钟，用移液器收集上清液。
	<ol>
		<li>对愈伤组织样品重复提取三次，并合并提取液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将提取液以1 mL/min的流速通过亲水-亲脂平衡固相萃取（HLB SPE）小柱。 
	注：HLB SPE小柱已依次用6 mL甲醇和6 mL水预处理，以去除可能的干扰物质。</li>
	<li>用6 mL甲醇通过HLB SPE小柱洗脱目标分析物，然后在温和的氮气流下将所得洗脱液浓缩至1 mL，用于仪器分析。</li>
	<li>取10 µL最终洗脱液注入UPLC-Q-TOF-MS，用于分析2,4-二溴苯酚及其代谢物15。
	<ol>
		<li>仪器分析前，所有样品均需使用0.22 µm尼龙膜过滤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 仪器分析
注意：2,4-二溴苯酚及其代谢物的分析采用超高效液相色谱仪（UPLC）与配备电喷雾电离（ESI）源的micrOTOF-QII质谱仪联用进行，正负离子模式下分别检测。
<ol>
	<li>打开柱温箱门，通过将色谱柱入口连接至进样阀、色谱柱出口连接至质谱仪入口，安装超高效液相色谱（UPLC）柱。 
	注：采用C18色谱柱（50 mm × 2.1 mm；1.7 µm粒径）在40 °C条件下实现分析物的分离。</li>
	<li>将流动相A（超纯水）和流动相B（色谱级甲醇）通过将溶剂管A和B的末端分别插入相应的溶剂瓶中，连接至仪器。
	<ol>
		<li>将所有流动相（每种500 mL）经0.22 µm滤膜过滤，并超声处理超过30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在软件窗口中，点击 Instrument | Inlet Method 以编辑液相色谱的条件。
	<ol>
		<li>设置流动相B的梯度条件如下：流速1.0 mL/min；0–0.5 min，5%；0.5–3.5 min，5%至50%；3.5–6.5 min，50%至100%；6.5–7 min，100%；7–10 min，100%至5%。</li>
		<li>设置样品注入UPLC-Q-TOF-MS的进样速率为0.2 mL/min。 
		注：样品进样程序由全自动进样器控制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在软件窗口中，选择 MS Method，然后设置Q-TOF-MS的参数：干燥气体（N2）流速为8 L/min，温度为300–350 °C；毛细管电压为4,500 V；碰撞能量为5–45 V；全扫描范围为40–800 Da。</li>
	<li>按编号顺序将样品瓶放置于样品托盘的相应位置，并将样品托盘重新插入样品室。 
	注：保持样品托盘水平，并确保样品室门已关闭。</li>
	<li>在软件窗口中，选择 File | New 创建数据库，并为数据库命名。</li>
	<li>通过选择 MS File | Inlet file | Inject Volume，加载上述创建的样品程序。</li>
	<li>点击 File | Save，将数据库保存至项目的样品文件夹中。</li>
	<li>在软件主窗口中选择 Run | Start，然后在启动样品列表运行窗口中选择 Acquire Sample Data 并点击 OK，开始采集数据。 
	注：在数据采集过程中，可通过点击 Chromatogram | Real-time Update 查看实时色谱图。</li>
	<li>在软件中选择目标数据行，点击 Chromatogram 窗口，查看MS扫描色谱图，以处理数据。</li>
	<li>在 Chromatogram 窗口中，点击 Display | TIC | ScanWaveDS | Add trace | OK，获得子离子扫描质谱图。</li>
	<li>通过比较2,4-二溴苯酚处理组与对照组的色谱图，鉴定代谢物。</li>
	<li>根据保留时间、质荷比及碎片离子模式对代谢物候选物进行解析16,17。 
	注：代谢物候选物母离子的实验m/z值与其理论m/z值之间的质量误差应小于10 ppm。</li>
</ol>

<ol><li>Chakraborty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+investigation+on+plasticizers%2C+bisphenol+A%2C+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+and+heavy+metals+in+the+surface+soil+of+the+informal+electronic+waste+recycling+workshops+and+nearby+open+dumpsites+in+Indian+metropolitan+cities%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities.</a> Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).</li>
<li>Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence%2C+fate+and+environmental+risk+of+anionic+surfactants%2C+bisphenol+A%2C+perfluorinated+compounds+and+personal+care+products+in+sludge+stabilization+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments.</a> Science of the Total Environment. 711, 135048(2020).</li>
<li>Xu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+occurrence+of+bisphenol+A+and+thirteen+structural+analogs+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil.</a> Chemosphere. 277, 130232(2021).</li>
<li>Cai, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+nonylphenol+and+nonylphenol+monoethoxylate+in+soil+and+vegetables+from+vegetable+farms+in+the+Pearl+River+Delta%2C+South+China%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Environmental+Contamination+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China.</a> Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).</li>
<li>Wang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Migration+and+health+risks+of+nonylphenol+and+bisphenol+a+in+soil-winter+wheat+systems+with+long-term+reclaimed+water+irrigation%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).</li>
<li>Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isomer-specific+approach+to+endocrine-disrupting+nonylphenol+in+infant+food%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).</li>
<li>Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+metabolism+in+plants+and+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Pesticide metabolism in plants and microorganisms.</a> Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).</li>
<li>Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+callus+cultures+to+elucidate+the+metabolism+of+tebuconazole%2C+flurtamone%2C+fenhexamid%2C+and+metalaxyl-M+in+Brassica+napus+L.%2C+Glycine+max+%28L.%29+Merr.%2C+Zea+mays+L.%2C+and+Triticum+aestivum+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).</li>
<li>Macherius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolization+of+the+bacteriostatic+agent+triclosan+in+edible+plants+and+its+consequences+for+plant+uptake+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment.</a> Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).</li>
<li>Sun, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+metabolism+of+nonylphenol+in+plants%3A+Isomer+selectivity+involved+with+direct+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation.</a> Environmental Pollution. 270, 116064(2021).</li>
<li>Schymanski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry%3A+communicating+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).</li>
<li>Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Household+dust+as+a+repository+of+chemical+accumulation%3A+new+insights+from+a+comprehensive+high-resolution+mass+spectrometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study.</a> Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+PBDEs+and+brominated+phenolic+compounds+in+particulate+matters+emitted+during+recycling+of+waste+printed+circuit+boards+in+a+typical+e-waste+workshop+of+South+China%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China.</a> Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).</li>
<li>de Wit, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+brominated+flame+retardants+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">An overview of brominated flame retardants in the environment.</a> Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).</li>
<li>Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Uptake+and+Metabolism+of+e%2C4-Dibromophenol+in+Carrot%3A+In+Vitro+Enzymatic+Direct+Conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).</li>
<li>Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+framework+for+identifying+toxic+transformation+products+in+complex+environmental+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).</li>
<li>Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontarget+screening+with+high+resolution+mass+spectrometry+in+the+environment%3A+ready+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go.</a> Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).</li>
<li>Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplays+between+the+cell+wall+and+phytohormones+in+interaction+between+plants+and+necrotrophic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens.</a> Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+metabolic+pathways+of+2%2C4%2C6-tribromophenol+in+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants.</a> Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).</li>
<li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+of+tetrabromobisphenol+A+in+pumpkin%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin.</a> Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案旨在高效鉴定外源性物质在植物中的生物转化过程。该方案的关键步骤是植物愈伤组织的培养。其中最困难的部分是愈伤组织的诱导与维持，因为愈伤组织容易受到污染并进一步发育成植物组织。因此，必须确保所有使用的器械均经过高压灭菌，且所有操作均在无菌条件下进行。愈伤组织的诱导与维持应在黑暗条件下完成，以避免自养生长和过度发育。此外，添加至MS培养基中的植物激素种类和剂量对愈伤组织的分化至关重要，需根据植物物种的具体情况进行调整。植物激素过量会导致愈伤组织形成维管系统，而剂量不足则会限制其分化18。MS培养基及植物激素母液应现配现用。强烈建议在加入植物激素和无菌下胚轴之前，先对MS培养基进行高压灭菌处理。
完整植株中的叶绿素等色素在液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）检测中通常会带来干扰19,20。植物愈伤组织来源于无菌的下胚轴，不含叶绿素且呈透明状。这意味着植物愈伤组织培养可优化完整植物样品的基质效应，并提供一种简便高效的样品...

由于人类活动，越来越多的有机污染物被排放到环境中1,2，而土壤被认为是这些污染物的主要归宿之一3,4。土壤中的污染物可被植物吸收，并可能通过食物链传递至更高营养级的生物，或通过农作物的消费直接进入人体，从而导致非预期的暴露5,6。植物利用多种途径代谢外源性物质以实现解毒7；阐明外源性物质的代谢过程至关重要，因为这决定了污染物在植物体内的实际归趋。由于代谢产物可通过叶片（释放至大气）或根系排出，因此在暴露初期检测这些代谢产物有助于更全面地分析多种代谢物8。然而，利用完整植株开展的研究通常需要长期实验以及复杂的样品前处理流程，且易受多种因素影响。
因此，植物愈伤组织培养是研究外源物质在植物体内代谢的良好替代方法，可显著缩短处理时间。该方法能够排除微生物干扰和光化学降解，简化完整植株的基质效应，标准化培养条件，并减少实验工作量。植物愈伤组织培养已成功作为三氯生9、壬基酚10和戊唑醇8代谢研究的替代手段。这些研究表明，愈伤组织中的代谢模式与完整植株中的代谢模式相似。本研究提出一种无需复杂且耗时流程即可高效、准确鉴定植物中外源物质代谢物的方法。本文中，我们结合植物愈伤组织培养与高分辨质谱技术，用于分析信号强度较低的代谢物11,12。
为此，胡萝卜（Daucus carota var. sativus愈伤组织悬浮液在摇床中以130 rpm、26 °C的条件暴露于100 µg/L的2,4-二溴苯酚中，持续120小时。选择2,4-二溴苯酚是因其具有内分泌干扰活性13 在土壤中广泛分布14代谢物经提取后采用高分辨质谱进行分析。本方案可研究 在植株中 其他可电离有机化合物的代谢

<table><tbody><tr><td>2,4-二氯苯氧乙酸</td><td>WAKO</td><td>1 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>20% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10011218-500ML</td><td></td></tr><tr><td>4-&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-NP，&gt;99%</td><td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-n-NP-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Pointe-Claire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-苄氨基嘌呤</td><td>WAKO</td><td>0.5 mg/L</td><td></td></tr><tr><td>75% 乙醇</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>1269101-500ML</td><td></td></tr><tr><td>7890A-5975&amp;nbsp;气相色谱仪</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY 超高效&amp;nbsp;液相色谱仪</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>棕色玻璃小瓶</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人工气候培养箱</td><td>宁波东南实验设备有限公司</td><td>RDN-1000A-4</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>STIK</td><td>MJ-Series</td><td></td></tr><tr><td>C18 色谱柱</td><td>ACQUITY UPLC BEH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DB-5MS 毛细管柱</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40071190-4L</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>SCIENTZ&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高通量组织研磨仪</td><td>SCIENTZ&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicrOTOF-QII 质谱仪</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q 纯水系统</td><td>Millipore</td><td>MS1922801-4L</td><td></td></tr><tr><td>Murashige &amp; Skoog 培养基</td><td>HOPEBIO</td><td>HB8469-7</td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H109658-4L</td><td></td></tr><tr><td>氮吹仪&amp;nbsp;</td><td>奥盛</td><td>MD200-2</td><td></td></tr><tr><td>NP 异构体，&gt;99%</td><td>Dr. Ehrenstorfer GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 固相萃取柱</td><td>Waters</td><td>60 mg/3 mL</td><td></td></tr><tr><td>Research plus 移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>100-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>小手指胡萝卜种子（Daucus carota var. sativus）&amp;nbsp;</td><td>寿光种业有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱&amp;nbsp;</td><td>上海博迅实业有限公司</td><td>THZ-98AB</td><td></td></tr><tr><td>固相萃取装置</td><td>AUTO SCIENCE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>ZKI</td><td>UC-6</td><td></td></tr><tr><td>紫外灭菌超净工作台</td><td>AIRTECH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

阐明植物中2,4-二溴苯酚的代谢过程

Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants

由于土壤是环境中污染物的主要汇集地，农作物可能广泛暴露于有机污染物中。这会通过食用富集了污染物的食物，导致潜在的人体暴露风险。阐明外源性物质在农作物中的吸收与代谢过程，对于评估人类膳食暴露风险至关重要。然而，此类实验若使用完整植株，往往需要长期培养，并涉及复杂的样品制备流程，且易受多种因素干扰。植物愈伤组织培养结合高分辨质谱（HRMS）技术，可为植物中外源性物质代谢产物的准确、快速鉴定提供解决方案，该方法能够避免微生物或真菌微环境的干扰，缩短处理时间，并简化完整植株带来的基质效应。2,4-二溴苯酚作为一种典型的阻燃剂和内分泌干扰物，因其在土壤中广泛存在且可被植物吸收，被选为模型化合物。本研究中，愈伤组织由无菌种子诱导产生，并暴露于无菌的含2,4-二溴苯酚培养基中。结果显示，在培养120小时后，植物愈伤组织组织中鉴定出8种2,4-二溴苯酚的代谢产物。这表明2,4-二溴苯酚在&#160;植物愈伤组织中被迅速代谢。因此，植物愈伤组织培养平台是评估植物对外源性物质吸收与代谢的有效方法。

该实验方案的步骤如图1所示。按照该方案操作后，我们将2,4-二溴苯酚处理组的胡萝卜愈伤组织提取物色谱图与对照组进行比较，发现处理组中存在8个在对照组中未出现的独特色谱峰（图2）。这表明，在2,4-二溴苯酚处理的胡萝卜愈伤组织中，成功检测到8种2,4-二溴苯酚的代谢物（M562、M545、M661、M413、M339、M380、M424 和 M187）。此外，在2,4-二溴苯酚处理组的色谱图中未检测到母体化合物2,4-二溴苯酚的色谱峰（保留时间 = 0.85 min）（图2），表明在实验条件下，2,4-二溴苯酚在胡萝卜愈伤组织中被迅速代谢。
用于鉴定胡萝卜愈伤组织中2,4-二溴苯酚代谢物的色谱与质谱信息汇总于表1中。2,4-二溴苯酚在胡萝卜愈伤组织中孵育后，通过与葡萄糖（M562、M545、M661 和 M413）及氨基酸（M339、M380 和 M424）直接结合形成代谢物。例如...

本实验方案描述了一种在植物中鉴定2,4-二溴苯酚代谢物的简单且高效的方法。

作物可能广泛暴露于有机污染物中，因为土壤是环境中废弃污染物的主要汇集地。这带来了潜在的……

植物愈伤组织培养为准确、高效且快速地评价外源物质在植物中的代谢降解提供了一种解决方案。植物愈伤组织培养可排除微生物组或真菌的干扰以及光化学降解的影响，简化完整植株的基质效应，标准化培养条件，缩短处理时间，并减少实验工作量。本文提出的方法有助于深入了解不同有机污染物在作物中的吸收行为及代谢机制，对环境风险评估工作具有重要意义。首先，在紫外灭菌的超净工作台中对所有器械进行高压灭菌，并完成所有操作。用75%乙醇对春化处理的种子表面消毒20分钟，用无菌去离子水冲洗三次，再用20%过氧化氢消毒20分钟。用无菌去离子水将种子清洗六次后，将其接种于经高压灭菌、不含激素、pH 为 5.8、含 1% 琼脂凝胶的 MS（Murashige 和 Skoog）培养基上，在 26 摄氏度、16 小时光照/8 小时黑暗的条件下无菌萌发 15 天。种子萌发 15 天后，将幼苗的下胚轴和子叶切成约 0.5 厘米大小的小段，以获得外植体。将外植体接种于含有 15 至 20 毫升高压灭菌 MS 培养基的培养皿中，培养基中添加 Oxymon 和 Phycocyanin，在 26 摄氏度避光条件下培养三至四周，以诱导愈伤组织形成。使用无菌手术刀和镊子，分离初始外植体形成的直径约一厘米的愈伤组织。进行处理时，将2,4-二溴苯酚溶解于10毫升无菌液体MS（Murashige和Skoog）培养基中，然后将3克分离的胡萝卜愈伤组织加入制备好的2,4-二溴苯酚溶液中。按照文稿中所述方法制备空白对照的培养基后，将所有锥形瓶置于黑暗条件下培养。样品制备时，通过孔径为0.45微米的玻璃纤维滤膜过滤，小心地将愈伤组织从2,3-二溴苯酚处理组和对照组的锥形瓶中分离。收集前用超纯水洗涤愈伤组织三次。将所有收集的愈伤组织进行冷冻干燥，取0.2克干燥的愈伤组织，使用高通量组织研磨仪在70赫兹条件下研磨3分钟。用玻璃微量移液器向研磨后的愈伤组织中加入50微升氘代内标4-正壬基苯酚，涡旋振荡1分钟。向加标的愈伤组织中加入5毫升甲醇与水等比例混合的溶液，超声提取30分钟，以提取2,4-二溴苯酚及其代谢物。提取后，在4°C条件下以8,000 G离心10分钟，用移液器收集上清液。将提取物以1毫升/分钟的流速通过亲水-疏水平衡固相萃取（HLB-SPE）小柱。通过向HLB-SPE小柱中加入6毫升甲醇，对分析物进行稀释。然后在温和的氮气流下将所得洗脱液浓缩至1毫升，用于仪器分析。进行分析时，打开柱加热器门，通过将超高效液相色谱柱的入口端连接至进样阀，出口端连接至质谱仪的入口端，完成色谱柱的安装。将溶剂管A和B的末端插入相应的溶剂瓶中。按照编号顺序将样品瓶放置于样品盘的对应位置，并将样品盘重新插入样品室。在软件窗口中，点击“Instrument”（仪器），然后选择“Inlet Method”（进样方法）以编辑液相色谱的条件。选择质谱方法并设

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