通过鸡胚体内移植实现肾类器官的有效血管化

在体外培养的肾类器官仍处于未成熟状态，限制了其应用。而这种体内腔移植方法可诱导类器官血管化，并促进其成熟。该操作效率很高，可在一次实验中实现大量类器官的移植与分析。

在制备HIPSC来源的肾类器官并孵育受精的来航鸡鸡蛋后，在孵育第三天于蛋壳上开窗。在鸡蛋的尖端贴上一小片透明胶带，用解剖剪的尖端轻敲透明胶带中央，在蛋壳上打一个小孔。

接下来，将一个19号针头插入5毫升注射器，并以45度角插入蛋壳的孔中。从蛋内抽吸2至3毫升的白蛋白，使胚胎在蛋内下降。用第二块透明胶带封住小孔，然后在蛋的铅笔标记朝上的一侧贴上一大块透明胶带。

用解剖剪的尖端轻敲透明胶带中央的蛋壳，打出一个小孔。使用弯头解剖剪从此孔处剪出一个小型圆形窗口。通过此窗口观察以定位胚胎。

然后扩大窗口以优化对胚胎的操作通路。使用镊子移除可能掉落在胚胎表面的较大块卵壳碎片。对于较小的碎片，可用塑料移液管向胚胎表面滴加数滴含钙和镁的DPBS，然后将含有卵壳碎片的DPBS吸入移液管中。

使用塑料移液管向卵内加入三滴 DPBS，DPBS 中添加 0.5% 青霉素-链霉素。将卵放回培养箱之前，先用一大块透明胶带小心密封窗口，直至孵化第四天。使用弯头解剖剪将窗口处的胶带剪开。

将鸡蛋置于解剖显微镜下，用橡胶支架或蛋盒固定。此时鸡胚处于Hamburger-Hamilton 23至24期，侧卧于左侧，右侧朝向观察者。找到胚胎右侧的翼芽和肢芽，体腔的评估将在两个肢芽之间进行。

在右翼芽与后肢芽之间的区域，用两把解剖镊夹住卵黄膜、绒毛膜和羊膜，朝相反方向轻轻牵拉，依次在这些膜上制造开口。检查是否已无障碍通向体腔。用一把解剖镊轻轻夹住翼芽与肢芽之间体壁边缘，将其轻微向观察者方向牵拉。

体腔必须清晰可见。将一种钝头但细长的器械小心插入体腔内。使用硬脑膜剥离器，将半个类器官放置于尿囊上方的蛋内。

使用解剖镊子小心夹住体壁边缘，将其略微向观察者方向牵拉，以使体腔的开口可见。用钝头钨丝和显微手术刀柄轻柔地将类器官移向体壁开口，并穿过开口进入体腔。将类器官略向前（头侧）推动，使其固定于体腔内。

此时可在翼芽后方清晰观察到。使用塑料移液管向卵内加入三滴DPBS。将卵放回孵育箱前，先用一大块透明胶带小心密封窗口，直至孵育第12天。

使用弯头解剖剪从窗口处剪开胶带。将鸡蛋置于解剖显微镜下，并用橡胶支架固定。观察血管系统，寻找静脉；静脉可通过其略偏亮红色的颜色与动脉区分开来。

为了更好地进入血管，使用弯头解剖剪小心地剪开以扩大窗口。选定静脉后，将微毛细玻璃针的尖端以0至20度的角度插入静脉。通过轻轻左右移动针尖，确认针头已进入静脉。

轻轻而稳定地向注射系统吹气，以注入扁豆凝集素。将胚胎放回培养箱中孵育10分钟，使其循环。将胚胎置于实验台上的橡胶支架中。

然后，用弯头解剖剪剪开包裹胚胎的膜。用带孔的勺子将胚胎从蛋中舀出，并立即用剪刀将其头部剪除。在解剖显微镜下，将胚胎的躯体放入培养皿中。

将胚胎背侧朝上置于培养皿中，并展开其四肢。用镊子沿胚胎的纵轴小心切开腹壁。在胚胎内找到类器官。

类器官最常附着于右肝叶，位置通常在肝叶尖端或颅侧，紧邻肋骨下方。因此，建议首先检查这些部位。一旦找到类器官，即用显微剪刀在其周围剪切，将其从胚胎中取出。

将类器官置于解剖显微镜下的培养皿中，其不可避免附着的鸡组织一并放置。使用双刃不锈钢剃须刀片尽可能去除鸡组织。未移植肾类器官与移植后肾类器官的免疫荧光图像均显示存在肾小球和肾小管结构。

在未移植的类器官中，存在一些人类内皮细胞。在移植后的类器官中，可见贯穿整个类器官的灌注血管网络。方框区域的放大图像显示了在移植类器官中可区分的三种内皮细胞类型：灌注的人类内皮细胞、未灌注的人类内皮细胞以及灌注的鸡源性内皮细胞。

在未移植的类器官中，内皮细胞围绕肾小球结构，但并未侵入其中。然而，在移植后的类器官中，肾小球结构由灌注的毛细血管实现血管化。可根据实验目的，采用不同技术对移植后的类器官进行分析。

与未移植对照组进行直接比较，可以深入了解血管化和成熟过程。