Name: 孤立大鼠心脏长期心室颤动模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 了解使用Langendorff装置建立大鼠长期心室颤动模型的方法。该技术简单经济、可重复且稳定，适用于心脏电生理学和心脏手术中灌注下心室颤动停搏的研究。

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本工作在中国人民解放军总医院第一医学中心心血管外科和中国人民解放军总医院实验动物中心的支持下完成。

本研究所使用的全部实验操作和方案均经中国人民解放军总医院动物护理与使用委员会审查并批准。
1. 准备兰格多夫装置
<ol>
	<li>配制 Krebs-Henseleit (K-H) 缓冲液。配制 K-H 缓冲液时，将以下成分加入蒸馏水中：118.0 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO4、1.2 mM NaH2PO4、1.8 mM CaCl2、25.0 mM NaHCO3、11.1 mM 葡萄糖和 0.5 mM EDTA。</li>
	<li>准备改良的 Langendorff 灌流系统。
	<ol>
		<li>用 95% O2 + 5% CO2 混合气体持续通入盛有 K-H 缓冲液的烧瓶，压力维持在约 80 mmHg。将灌流管的一端插入 K-H 缓冲液中，中间部分穿过水浴，另一端连接一支钝头 20 G 针头。</li>
		<li>将针头悬挂在金属支架上。调节水浴温度，使灌流系统末端流出的 K-H 缓冲液温度保持在 37.0 °C ± 1.0 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备硬件和软件
<ol>
	<li>硬件
	<ol>
		<li>使用生理信号记录仪对所有模拟信号进行数字化和记录。使用两根不锈钢针状电极记录双极心电图（ECG），并使用另外两根不锈钢针状电极进行电刺激。</li>
		<li>将四根电极的一端连接至生理信号记录仪，另一端置于装置连接后心脏所在位置附近。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>软件
	<ol>
		<li>使用笔记本电脑软件自动识别、调节并记录双极心电图（ECG）和血流动力学参数。这些参数包括左心室压力差（LVPD），即左心室发展压（LVDP）与左心室舒张末期压（LVEDP）之差，以及心率（HR）。</li>
		<li>将电刺激器参数设置为30 Hz交流电，低电压组使用2 V，高电压组使用6 V。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 准备离体心脏
<ol>
	<li>准备动物。
	<ol>
		<li>在腹腔注射0.05 mg/kg布托啡诺和1,000 IU/kg肝素钠后，使用2%异氟烷麻醉Sprague-Dawley（SD）大鼠。确保大鼠对脚趾夹捏无反应。</li>
		<li>将大鼠转移至小型动物手术平台，使其呈仰卧位，并用75%乙醇对胸部进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切除心脏。
	<ol>
		<li>在进行颈部解剖和气管插管并将大鼠连接至呼吸机后，用有齿镊提起剑突处的皮肤，使用组织剪在皮肤上做一条3 cm的横向切口。将皮肤和肋骨切口向两侧腋窝呈V形延伸。</li>
		<li>用组织镊将胸骨向上翻起，充分暴露心脏和肺。</li>
		<li>使用两把弯镊钝性分离并游离胸腺。夹住胸腺组织，并将其向两侧推开，以暴露主动脉及其分支。</li>
		<li>使用弯镊钝性分离主动脉与肺动脉，便于后续使用眼科剪切除心脏，并在心脏取出后进行悬挂。 
		注意：对于初次操作此步骤者，可省略步骤3.2.4。</li>
		<li>通过钝性分离将头臂干与周围组织分开。然后用弯镊夹住头臂干，以协助心脏的取出。迅速在头臂干与左颈总动脉之间剪断主动脉。心脏一旦被移除，大鼠即死亡。</li>
		<li>剪除多余组织，并立即将心脏浸入盛有0–4 °C K-H缓冲液的培养皿中，以冲洗并排出残留血液。 
		注意：建议在头臂干与左颈总动脉之间切断主动脉，因为保留该分支有助于识别主动脉并估计插管深度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>悬挂心脏。
	<ol>
		<li>将心脏转移至第二个培养皿中，辨认主动脉。使用两把眼科镊提起主动脉，并将钝头针插入Langendorff装置中。</li>
		<li>调整主动脉插入深度至适当位置。由助手用0号缝合线打结固定。然后打开灌流流量调节器。 
		注意：在整个操作过程中需注意避免气泡进入心脏。此外，从切断主动脉到开始灌流的时间不应超过2分钟。</li>
		<li>将连接至压力传感器的小型改良乳胶球囊插入左心房，并将球囊经二尖瓣推入左心室。向球囊内注入蒸馏水，使舒张末期压力达到5–10 mmHg。</li>
		<li>将心电图（ECG）和电刺激电极连接至心脏。然后将心脏置于夹套式玻璃腔室中，维持内部温度为37.0 °C ± 1.0 °C。 
		&#8203;注意：采用以下排除标准：心率&#60;250次/分钟；冠状动脉流量（mL/min）&#60;10 mL/min 或 &#62;25 mL/min。心电图及电刺激电极的连接位置见图1A，夹套式玻璃腔室见图1B。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 心脏灌注与电刺激（图2）
<ol>
	<li>平衡阶段（0-30 分钟）
	<ol>
		<li>开始灌注，并维持温度在约 37 °C，直至心脏自发搏动；随后让心脏平衡 20 分钟。</li>
		<li>调节水浴温度，使夹套玻璃腔室内的温度维持在约 30 °C。 
		注：整个降温过程应持续约 10 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电刺激阶段（30-120 分钟）
	<ol>
		<li>当温度达到目标值后，启动笔记本电脑软件中的电刺激开关。 
		注：电刺激开始时的双极心电图和左心室压力（LVP）如图 3A所示。</li>
		<li>若动物属于持续电刺激长期心室颤动（VF）组，则进行 90 分钟电刺激；若动物属于诱发自发长期心室颤动组，则进行 5 分钟电刺激，随后关闭电刺激，并允许心脏进入 90 分钟的自发长期心室颤动状态，如图 3B所示。 
		注：对于电刺激后 90 分钟内未出现自发心室颤动的心脏，应关闭电刺激，因其不符合纳入标准。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复温、除颤与搏动阶段（120-180 分钟）
	<ol>
		<li>在持续 90 分钟的心室颤动后，使用电极给予 0.1 J 的直流电除颤，如图 3C所示。</li>
		<li>同时调节水浴温度，使夹套玻璃腔室内的温度缓慢上升至约 37 °C。继续升温过程约 10 分钟。</li>
		<li>除颤后，让心脏搏动 60 分钟，然后通过在约 37 °C 下缓慢灌注 10% KCl 停止心脏搏动。取出心脏进行进一步分析。 
		&#8203;注：除颤后未能恢复搏动的心脏不符合纳入标准。此外，重要的是在降温前（20 分钟）、除颤后（120 分钟）以及实验结束时（180 分钟）收集冠状动脉流出液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）检测及组织学分析
<ol>
	<li>CK-MB 检测
	<ol>
		<li>使用自动生化分析仪和商用 CK-MB 检测试剂盒测定收集的冠状动脉灌流液中 CK-MB 的水平8。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织学分析
	<ol>
		<li>用缓冲的 10% 甲醛固定心脏，脱水后将组织包埋于石蜡中。</li>
		<li>使用切片机将石蜡包埋的心脏组织切成 5 µm 的切片，将切片贴附于载玻片上，然后用苏木精和伊红染色9。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案建立了一种尚未见报道的长期心室颤动大鼠离体心脏动物模型。此外，本研究比较了不同的电刺激条件。该研究为心脏手术期间心室颤动停搏相关研究提供了模型基础。
模型的成功率是一个非常重要的指标，与人员、时间和经济成本密切相关。在心室颤动（VF）模型中，成功率包括能否在心脏中成功诱发心室颤动，以及除颤后心脏能否恢复正常的节律性搏动。此外，还需考虑心脏功能恢复率和心肌损伤程度。为了满足心脏手术研究的需求，该模型要求心脏在低温条件下维持心室颤动达1-2小时；因此，在本实验方案中，心室颤动持续时间为90分钟。
建议使用低电压对心脏功能和心肌损伤影响较小。因此，本研究比较了使用低电压与高电压诱导大鼠心脏发生心室颤动（VF）的成功率，以及持续电刺激与5分钟电刺激诱导VF的成功率。每组建立了六个符合条件的VF模型。LI组共测试了16只大鼠，模型成功率为37.50%；而LC组仅测试了7只大鼠，成功率为85.71%。此外，本研究中LC组与LI组在心率（HR）、左心室舒张压（LVPD）恢复率及肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平方面均无显著差异。...

心脏手术通常进行 通过 开胸手术，通过阻断主动脉并灌注心脏停跳液使心脏停搏。再次心脏手术可能比初次手术更具挑战性，并发症和死亡率更高1,2,3此外，传统的正中胸骨切开术可能损伤胸骨后方的桥血管、升主动脉、右心室及其他重要结构。由于结缔组织分离导致的大量出血、胸骨切口感染以及胸骨切开术后胸骨骨髓炎均为可能的并发症。广泛的解剖操作会增加重要心脏结构发生损伤和出血的风险。
随着微创心脏外科手术的发展，切口越来越小，有时难以实现心脏停搏。在心室颤动（VF）状态下进行再次心脏手术4,5是安全且可行的，并可能提供更好的心肌保护。因此，本方案介绍了在微创体外循环手术中采用VF心脏停搏的方法。心脏在发生心室颤动时失去有效收缩功能，因此手术过程中无需缝合和阻断升主动脉，从而简化了操作步骤。然而，即使心脏持续灌注，长时间的心室颤动仍可能对心脏造成损害。
随着该方法的广泛应用，如何在心室颤动（VF）期间保护心脏的问题日益凸显。这需要利用长期心室颤动动物模型开展广泛而深入的研究。过去，该领域的研究主要采用大型动物6,7，并需要外科医生、麻醉科医师、灌注师及其他研究人员之间的密切合作。此类研究耗时过长，样本量通常较小，且研究重点多集中于心脏功能，而对机制和分子层面的评估较少。迄今为止，尚无研究报道建立长期心室颤动模型的详细实验方案。
因此，本方案提供了利用朗根多夫装置建立长期心室颤动大鼠模型所需的详细步骤。该方案简单、经济、可重复且稳定。

<table><tbody><tr><td>0 号不可吸收缝线</td><td>Ethicon, Inc.</td><td></td><td>离体心脏制备</td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; + 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>北京北洋联合气体有限公司&amp;nbsp;</td><td></td><td>K-H 缓冲液</td></tr><tr><td>AcqKnowledge 软件</td><td>BIOPAC Systems Inc.</td><td>版本 4.2.1</td><td>软件</td></tr><tr><td>全自动生化分析仪</td><td>深圳雷杜生命科学股份有限公司</td><td>Chemray 800</td><td>CK-MB 检测</td></tr><tr><td>BIOPAC 研究系统</td><td>BIOPAC Systems Inc.</td><td>MP150</td><td>硬件</td></tr><tr><td>钝头针头（20 G，TWLB）</td><td>天津汉康医药有限公司</td><td>H-113AP-S</td><td>改良 Langendorff 灌流系统</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10005861</td><td>K-H 缓冲液</td></tr><tr><td>CK-MB 检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>长春汇力生物技术有限公司</td><td>C060</td><td>CK-MB 检测</td></tr><tr><td>弯镊</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司</td><td></td><td>离体心脏制备</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10009717</td><td>K-H 缓冲液</td></tr><tr><td>电刺激器</td><td>BIOPAC Systems Inc.</td><td>STEMISOC</td><td>硬件</td></tr><tr><td>滤器</td><td>天津汉康医药有限公司</td><td>H-113AP-S</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>63005518</td><td>K-H 缓冲液</td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>天津生物化学制药有限公司</td><td>H120200505</td><td>离体心脏制备</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>瑞沃德生命科技有限公司</td><td>21082201</td><td>离体心脏制备</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>20025118</td><td>K-H 缓冲液</td></tr><tr><td>针状电极</td><td>BIOPAC Systems Inc.</td><td>EL452</td><td>硬件</td></tr><tr><td>眼科钳</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司</td><td></td><td>离体心脏制备</td></tr><tr><td>眼科镊</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司</td><td></td><td>离体心脏制备</td></tr><tr><td>眼科剪</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司</td><td></td><td>离体心脏制备</td></tr><tr><td>灌流管</td><td>天津汉康医药有限公司</td><td>H-113AP-S</td><td>改良 Langendorff 灌流系统</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10016318</td><td>K-H 缓冲液</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10018960</td><td>K-H 缓冲液</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10019318</td><td>K-H 缓冲液</td></tr><tr><td>二水合磷酸二氢钠</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>20040718</td><td>K-H 缓冲液</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) 大鼠</td><td>北京斯贝福生物技术有限公司</td><td>雄性，300–350 g</td><td>离体心脏制备</td></tr><tr><td>温度计</td><td>江苏晶创电子有限公司</td><td>GSP-6</td><td>改良 Langendorff 灌流系统</td></tr><tr><td>组织镊</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司</td><td></td><td>离体心脏制备</td></tr><tr><td>组织剪</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司</td><td></td><td>离体心脏制备</td></tr><tr><td>有齿镊</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司</td><td></td><td>离体心脏制备</td></tr><tr><td>呼吸机</td><td>成都仪器厂</td><td>DKX-150</td><td>离体心脏制备</td></tr><tr><td>水浴锅1</td><td>宁波新芝生物科技股份有限公司</td><td>SC-15</td><td>改良 Langendorff 灌流系统</td></tr><tr><td>水浴锅2</td><td>上海一恒科技仪器有限公司</td><td>DK-8D</td><td>改良 Langendorff 灌流系统</td></tr></tbody></table>

一种离体大鼠心脏长期心室颤动模型

A Model of Long-Term Ventricular Fibrillation in Isolated Rat Hearts

心室颤动（VF）是一种致命性心律失常，在心脏病患者中发病率较高，但灌注条件下发生的心室颤动性停搏在心脏外科领域却是一种被忽视的术中停搏方法。随着心脏外科技术的不断进步，对灌注状态下长期心室颤动研究的需求日益增加。然而，目前该领域尚缺乏简单、可靠且可重复的慢性心室颤动动物模型。本方案通过交流电（AC）对心外膜进行电刺激，诱导长期心室颤动。采用不同条件诱导VF，包括使用低电压或高电压持续刺激以诱导长期VF，以及使用低电压或高电压刺激5分钟以诱导自发性长期VF。比较了不同条件下VF诱导的成功率、心肌损伤程度以及心脏功能恢复情况。结果显示，持续低电压刺激可成功诱导长期VF，而低电压刺激5分钟可诱导出伴有轻度心肌损伤且心脏功能恢复率较高的自发性长期VF。然而，低电压持续刺激的长期VF模型具有更高的成功率。高电压刺激虽然VF诱导率更高，但除颤成功率较低，心脏功能恢复差，并伴有严重的心肌损伤。基于上述结果，推荐采用持续低电压心外膜交流电刺激，因其具有高成功率、稳定性好、可靠性高、可重复性强、对心脏功能影响小以及心肌损伤轻微等优点。

实验共使用了57只大鼠，其中30只符合纳入标准。纳入的动物被分为五组，每组6只：对照组（C组）、低电压持续刺激诱导的长期VF组（LC组）、高电压持续刺激诱导的长期VF组（HC组）、低电压诱发的自发性长期VF组（LI组）和高电压诱发的自发性长期VF组（HI组）。各组的实验流程如图2所示。
VF 模型的成功率 
VF 的发生率、除颤成功率以及 VF 模型的成功率如表 1所示。LC 组和 HC 组接受持续电刺激，因此 VF 诱发成功率达到 100%，但 HC 组的除颤成功率较低。LI 组和 HI 组在电刺激 5 分钟后关闭刺激，两组 VF 发生率不同，但与 LC 组和 HC 组相比，VF 发生率均较低。尽管使用较高电压的组 VF 发生率更高，但其除颤成功率相应降低。LC 组和 LI 组的除颤成功率均较好，但总体而言，LC 组的模型成功率最高，而 LI 组的模型成功率较低。
血流动力学变...

本方案介绍了一种通过低电压交流电持续刺激诱导大鼠心脏长期心室颤动的模型。该模型成功率高，稳定、可靠且可重复，对心脏功能影响小，仅引起轻度心肌损伤。

心室颤动（VF）是一种在心脏病患者中发病率较高的致命性心律失常，但灌注条件下发生的VF停搏是一种被忽视的方法……

本方案详细阐述了利用朗根多夫装置建立长期心室颤动大鼠模型的必要性。该方法填补了小型动物模型中长期心室颤动研究的空白。该技术操作简便、经济、可重复且稳定。该技术可用于灌注条件下心室颤动性停搏的研究，此类研究在心脏外科手术和操作的某些临床场景中进行。首先，通过在蒸馏水中加入118毫摩尔氯化钠、4.7毫摩尔氯化钾、1.2毫摩尔氯化镁、1.2毫摩尔磷酸二氢钠、1.8毫摩尔氯化钙、25毫摩尔碳酸氢钠、11.1毫摩尔葡萄糖和0.5毫摩尔EDTA，配制Krebs-Henseleit（KH）缓冲液。然后准备改良的Langendorff灌注系统。持续用95%氧气和5%二氧化碳的混合气体对装有KH缓冲液的烧瓶进行通气，气体压力约为80毫米汞柱。将灌流管的一端放入KH缓冲液中，中间部分穿过水浴，另一端连接一支钝头20号针头。将针头悬挂在金属支架上后，调节水浴温度，使灌流系统末端流出的KH缓冲液温度为37摄氏度。使用生理信号记录仪对所有模拟信号进行数字化和记录。使用两个不锈钢针状电极记录双极心电图（ECG），另两个不锈钢针状电极用于电刺激。将这四个电极的一端连接至生理信号记录仪，另一端置于装置连接后心脏所在位置的附近区域。接下来，使用笔记本电脑软件自动识别、调整并记录双极心电图和血流动力学参数。将电刺激器参数设置为30赫兹交流电，其中低电压组接受2伏电压，高电压组接受6伏电压。在麻醉大鼠经颈部解剖和气管插管后连接呼吸机的情况下，用有齿镊提起剑突处的皮肤，并用组织剪在皮肤上做一个3厘米长的横向切口。以 V 字形向两侧腋窝方向延长皮肤和肋部切口。采用钝性分离法将头臂干从周围组织中分离出来。然后用弯钳夹住头臂干，以便于取出心脏。立即将心脏浸入含有KH缓冲液、0至4摄氏度的培养皿中，以冲洗并排出残留血液。将心脏转移至第二个培养皿中。剪除多余组织，并识别主动脉。使用两把眼科镊子提起主动脉，并将主动脉插入Langendorff装置的钝针中。然后在助手的协助下，用0号缝合线打结固定。打开灌流流量调节器。将球囊经二尖瓣推入左心室。用蒸馏水充盈球囊，使舒张末期压力达到5至10毫米汞柱。将心电图导联和电刺激电极连接到心脏。将心脏置于维持在 37 摄氏度的夹套玻璃腔室中央。让心脏在腔室内平衡 20 分钟。然后调节水浴温度，使夹套玻璃腔室内的温度保持在 30 摄氏度。当温度达到设定值后，启动笔记本电脑软件中的电刺激开关。如果动物属于持续刺激的长期心室颤动（VF）组，则持续进行90分钟的电刺激。在90分钟心室颤动后，使用电极给予0.1焦耳的直流电除颤。同时调节水浴温度，使夹套玻璃室内的温度在10分钟内缓慢升至37摄氏度。除颤后，让心脏跳动60分钟，然后以约37摄氏度的10%氯化钾溶液缓慢灌注，停止心脏跳动。取出心脏用于肌酸激酶（CK-MB）检测及组织学分析。此处展示了VF的发生率、除颤成功率以及VF模型的成

a-model-of-long-term-ventricular-fibrillation-in-isolated-rat-hearts

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

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从代谢综合征相关射血分数保留型心力衰竭大鼠模型中分离心房心肌细胞

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改良的大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型

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使用31P 核磁共振波谱法评估离体小鼠心脏功能与能量代谢

了解使用Langendorff装置建立大鼠长期心室颤动模型的方法。该技术简单经济、可重复且稳定，适用于心脏电生理学和心脏手术中灌注下心室颤动停搏的研究。

一种离体大鼠心脏长期心室颤动模型

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