Name: 使用基于光学的系统对水凝胶嵌入的完整小鼠肌纤维进行高通量收缩测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学习基于光学的高通量收缩测量方法，用于评估水凝胶嵌入的小鼠骨骼肌纤维功能。该技术支持基因突变研究和肌肉疾病药物筛选，为肌肉生物学和再生医学提供高效研究工具。

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作者感谢 Sylvia Bogaards、Sanna Luijcx、Valentijn Jansen、Michiel Helmes 和 Emmy Manders 在本实验方案开发过程中提供的专业技术支持。本研究得到了肌肉萎缩症协会（Muscular Dystrophy Association，资助号 MDA603238，授予 T.J.K）、荷兰心血管联盟（Dutch Cardiovascular Alliance，人才奖授予 T.J.K）以及澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC，澳大利亚；基金号 APP1121651，授予 M.Y）的资助。

对于 离体 收缩性研究中所用的死后组织来自荷兰VU大学为其他获批研究项目而实施安乐死的动物，以及繁殖过剩的动物，相关操作均依据荷兰动物研究法，并符合欧洲理事会指令（2010/63/EU）的规定。
1. 材料准备
<ol>
	<li>准备用于吹打的移液器（在超净工作台中存放于70%乙醇中，直至使用）。剪去两个P1,000枪头的末端以形成不同大小的孔径；确保孔径刚好足够肌肉通过，且不会堵塞移液器。将剪过的末端通过火焰灼烧，使其边缘光滑。</li>
	<li>按其他地方所述方法准备Sylgard培养皿32，并提前用70%乙醇灭菌，用于在分离过程中固定足部和肌肉。 
	注意：Sylgard培养皿在用去离子水和70%乙醇彻底清洗后可重复使用。</li>
	<li>在分离操作前，预先配制以下溶液：解剖液、纤维蛋白培养液和肌肉消化液（见表1）。 
	注意：肌肉消化液应使用0.22 µm滤器过滤除菌。所有配制好的溶液在使用前需在标准细胞培养孵箱中于&#160;37 °C 和 5% CO2 条件下平衡至少30分钟。</li>
	<li>肌肉消化完成后，配制以下溶液用于浇铸水凝胶：细胞混合液和基质混合液（见表2）。将细胞混合液与基质混合液按1:1比例混合，得到终浓度为2.5 mg/mL的纤维蛋白。 
	&#8203;注意：基质应在冰上配制，并使用预冷的移液器枪头，以防止基底膜基质过早聚合。此处使用的凝血酶与纤维蛋白原比例为1:10（每毫克纤维蛋白原对应的单位数），已优化至聚合时间为30分钟。若凝胶在30分钟内即发生聚合，应降低凝血酶浓度。详见讨论部分。</li>
</ol>
2. FDB 肌肉解剖
<ol>
	<li>通过颈椎脱位处死小鼠。用70%酒精对后肢进行消毒。</li>
	<li>在踝关节上方切断下后肢。沿足背侧向脚趾方向切开皮肤。 
	注意：在踝关节处切断下后肢，以避免损伤下肢肌肉和胫骨，以防后续需要使用这些组织。</li>
	<li>小心地将皮肤向脚趾方向剥离，注意不要损伤肌肉。足底屈肌（FDB）是足部腹侧最表层的肌肉。</li>
	<li>将解剖好的足部置于盛有10 mL预热至37 °C解剖液的Sylgard培养皿中。通过仍附着在脚趾上的皮肤将足部固定，同时将下肢在踝关节远端固定。</li>
	<li>小心去除肌肉表面的结缔组织。在足跟处切断肌腱，并通过肌腱将肌肉提起。</li>
	<li>沿肌肉侧面及下方穿过结缔组织进行切割，持续操作直至暴露出脚趾的肌腱。</li>
	<li>当三条肌腱的约一半长度被暴露后，切断肌腱，将肌肉从足部分离。可选步骤：切除第四条外侧肌腱及其相连的肌纤维。</li>
	<li>清除肌肉上的结缔组织，并将其转移至含有预热解剖液的离心管中。</li>
</ol>
3. FDB 肌肉消化
<ol>
	<li>根据表1配制肌肉消化液。</li>
	<li>使用血清移液管将FDB肌肉转移至肌肉消化液中，在37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中孵育80分钟。 
	注意：消化时间应根据每批胶原酶进行优化。当肌肉开始松散并显得肿胀时，表明消化完成。消化时间的优化方法参见讨论部分。</li>
	<li>消化完成后，将肌肉转移至含有3 mL解剖液的15 mL离心管中，孵育30分钟后进行吹打分散。</li>
</ol>
4. FDB 肌肉的吹打分散与重力沉降
<ol>
	<li>使用先前准备好的吹打尖端（步骤 1.1），通过移液器对肌肉进行吹打，从最大尺寸逐步吹打至最小尺寸。如果此步骤耗时超过 5 分钟，需将肌肉放入培养箱中孵育 5 分钟，使其休息。</li>
	<li>持续吹打直至大部分肌纤维已从肌腱上分离，且肌腱能够通过 P200 吸头。随后去除肌腱。</li>
	<li>将分离的 FDB 肌纤维加入含有 10 mL 解剖培养基的 15 mL 离心管中，并在培养箱中静置 20 分钟，使纤维沉淀。观察形成的沉淀物。</li>
	<li>可选步骤：移除顶部 10 mL 培养基，并重复步骤 4.3。此步骤有助于去除多余的碎片及相关的单核细胞。</li>
</ol>
5. FDB 肌纤维包埋
<ol>
	<li>小心移除纤维沉淀上方的全部培养基。每块FDB肌肉用875 µL细胞混合液重悬细胞（置于冰上）。 
	注意：一块FDB肌肉可获得足够用于24孔板中七个孔的纤维。此密度可根据实验需求进行调整。以下凝胶体积（250 µL）已针对24孔板规格优化，但可根据其他规格相应缩放。</li>
	<li>将125 µL细胞混合液分装至单个微量离心管中。</li>
	<li>每次处理一个孔，向一份细胞悬液中加入125 µL基质混合液，并通过轻柔吹打混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>立即将最终混合液转移至孔中。 
	注意：务必将混合液移入孔的中央位置。对每个孔重复步骤5.3和步骤5.4。</li>
	<li>将凝胶在培养箱中孵育30–45分钟以固化。凝胶固化后，小心向各孔中加入培养基。 
	注意：快速移液可能导致水凝胶从孔壁脱落。自此步骤起，纤维即可进行刺激和检测。然而，根据我们的经验，让纤维在培养条件下适应24小时，可能有助于改善其收缩能力。</li>
	<li>对于较长时间的培养，每2天更换一半培养基。具体操作为：移除一半原有培养基，并加入等量的新鲜培养基。</li>
</ol>
6. 基于光学的收缩力测量
<ol>
	<li>打开基于光学的收缩力测量系统（参见 材料表），荧光灯、电细胞刺激器和计算机。将电刺激器设置为 1.0 Hz, 10.0 V，以及一个 脉冲持续时间 的 5.00 ms 刺激分离的肌纤维。</li>
	<li>将培养板插入测量系统中。将起搏器连接至起搏插件，并将其插入培养板。</li>
	<li>打开程序 IonWizard，然后通过点击打开一个新文件 文件 （屏幕左上角）| 新.</li>
	<li>检查程序是否位于正确的实验上， 骨骼肌肌节，通过点击 新建 | 收集实验要更换实验，请点击 理想的实验，然后按压 添加. 对于 骨骼肌肌节 实验，应用以下设置： Sarc 20倍，平均线数，单次FFT，采样率250 Hz，以及一个 采集时间 的 10 s. 
	注意：实验设置应在实验开始前完成。可根据实验需求对设置进行调整。</li>
	<li>调节测量系统的温度至 25 °C. 点击 开放细胞查找器 工具栏下方，等待新界面弹出。在该界面的右上角，选择 板型 和 活性孔. 
	注意：测量在 25 °C 下进行，以减缓快缩型 FDB 肌纤维的收缩速度，从而避免对收缩事件采样不足。</li>
	<li>通过调节使纤维进入焦点 对焦滑块. 或者，使用 W 键和 S 键 用于此聚焦功能。</li>
	<li>启动起搏以开始电刺激。观察到纤维现在开始抽搐。 
	注意：若未观察到纤维抽搐，请确保所有导线均已连接，并且起搏器完全浸入溶液中。若仍无反应，可能是由于消化过度或在吹打过程中造成过度损伤，导致纤维失去应答能力。</li>
	<li>将测量区域对准纤维的一端，使肌节呈垂直方向。确保肌节处于清晰对焦状态。当肌节对焦准确时，工具栏中会显示一个单一峰。在收缩过程中，随着肌节缩短，该峰会向右移动。 
	注意：实验开始前可调整紫色测量区域。为确保准确测量，应包含约20个肌节。若收缩过程中该峰值形状发生变化，可能表明肌节在收缩期间被遮挡或失焦，从而引入噪声。</li>
	<li>点击开始实验 开始 在工具栏中。按下 Q 按开始键以启动测量，并等待程序记录10次收缩瞬变。若有超过四次瞬变显示无噪声，按确认键接受该次测量结果 Z 关键。如果瞬态信号噪声过大，通过按下按键拒绝该测量 X 关键</li>
	<li>每种条件下测量 10 至 20 根纤维。保留先前已测量纤维的位置。</li>
	<li>可选：添加化合物，此后可在该时间点重新测量纤维。</li>
	<li>当实验结束后，按下 停止 单击底部工具栏中的按钮以关闭细胞查找窗口。保存文件，然后开始创建新文件。</li>
	<li>要分析数据，请打开程序 &#34;Cytosolver 桌面版&#34;. 点击 导入，选择要分析的文件。</li>
	<li>程序完成分析后，观察蓝色、红色和灰色峰。蓝色峰为程序接受的瞬态信号，红色峰为程序拒绝的瞬态信号，灰色峰为用户拒绝的瞬态信号。 
	注意：拒斥标准可在分析软件中进行调整。通常，若数值超过最大导数限制，则予以拒斥；瞬时信号则根据曲线拟合的R值进行拒斥2 值 &#60;0.95.</li>
	<li>点击 输出. 勾选以下选项： 平均瞬态数据 和 导出至 Excel.</li>
	<li>实验结束后，关闭所有设备。取出培养皿并妥善处理。使用去离子水和70%乙醇清洁起搏电极。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文详细描述了一种对FDB肌纤维进行酶法分离并以三维培养方式进行培养的实验方案，随后利用基于光学的收缩力测量系统对培养的肌纤维进行收缩功能检测。该方案具有多项优势：1）可从单块肌肉中快速、简便地分离出大量完整肌纤维；2）可将肌纤维包埋于可调节的水凝胶基质中；3）可利用基于光学的系统实现高通量的收缩力测量；4）可在干预处理后对同一肌纤维进行多次重复测量。单根活体肌纤维的分离可获得仍保持收缩功能的成熟肌细胞。由于从小鼠FDB肌肉获得的肌纤维相对较小，因此在分离过程中易于操作，并能维持其直线形态，有利于后续的收缩功能检测。尽管该系统最初主要用于心肌细胞收缩的研究，但骨骼肌纤维具有相同的收缩装置，且肌节排列模式清晰可辨，因此同样适用于该系统的测量。29将单细胞收缩力测量与活细胞成像相结合 离体 肌肉纤维培养是一种强大的工具，可用于评估成熟肌肉纤维在电刺激下的健康状况和功能。 
使用分离的肌纤维的一个局限性在于缺乏施加于纤维的外部力（即被动牵拉），这会导致静息状态下的肌节长度较实际存在的要短 体内尽管2.4–2.5 µm的肌节长度可确保最佳的力产生，但静息状态下的肌节长度可能存在显著差异33。尽管 在体 FDB肌纤维的静息肌节长度尚未见报道，我们未发表的数据提示其平均长度为2.2 µm。本研究结果显示，FDB肌纤维在体外培养24小时后去负荷状态下的平均静息肌节长度约为1.95 µm图3）。尽管这种较低的静息肌节长度会导致较低的力产生，但约1.95 µm的长度仍应能够产生 &gt;最大力的90%34因此，这些肌节长度足以确定不同基因模型之间或药物处理后纤维功能的差异。此外，与游离的二维培养纤维相比，将纤维包埋在水凝胶中可提供更多的黏附位点，从而限制随时间推移发生的进一步肌节缩短。
该肌纤维分离方案的一个优势在于使用了一种易于解剖的快缩肌，其肌纤维相对较小，与其他肌肉（如趾长伸肌，EDL）相比更适合作为实验材料。由于体积较小，这种肌肉在通过吹打进行分离时更为合适，从而降低了因移液或缠绕导致肌纤维损伤的风险。FDB 肌肉的细胞外基质可被胶原酶轻松地进行酶解，从而在短时间内分离出数百根肌纤维。然而，过度消化会导致肌纤维损伤。当在吹打过程中肌肉几乎立即解体，或在细胞接种过程中有大量细胞体积出现过度收缩时，即可判断发生了过度消化。为防止肌肉过度消化，需针对每批胶原酶优化消化时间。为此，应同时平行消化两块 FDB 肌肉，两者之间消化时间相差 5 分钟。选择能获得最多活性肌纤维的消化时间。该优化过程应重复进行第二次，同样保持 5 分钟的消化时间间隔。最终，以获得最多活性肌纤维的消化时间作为当前批次胶原酶的最佳消化时间。另一种减少胶原酶批次间差异的方法是直接计算原液中每毫升的活性单位，然后将后续批次的胶原酶重新配制为相同的活性浓度。最后，不同小鼠品系之间的消化时间可能也需要优化，例如在研究表现出细胞外基质沉积增加的老年或疾病动物模型时35,36。
移液存活的分离肌纤维的可能性为在不同培养条件下培养FDB肌纤维提供了机会。其中一种选择是将这些纤维培养在水凝胶中，以模拟天然组织的培养环境。该包埋方案可确保纤维在进行收缩力测量时保持原位，并已优化以允许纤维在凝胶固化前沉降至培养板底部。然而，该方案可能需要根据凝血酶和纤维蛋白原储备液的差异进行调整。如果凝血酶活性过高，凝胶会过早固化，导致纤维悬浮在显微镜焦平面以上的较高位置。若发生此情况，则需调整凝血酶与纤维蛋白原的比例。可通过在凝血酶浓度逐步降低的条件下接种纤维，并记录聚合所需时间来进行测试。通常情况下，聚合不应快于30分钟。然而，凝血酶浓度过低也可能影响聚合过程。另一种确保纤维位于正确焦平面的方法是先采用二维培养方案接种纤维，待其贴附于培养板后，再在纤维上方覆盖一层水凝胶。但应注意，从纤维上移除培养基可能会引发过度收缩，因为它们对干燥非常敏感。此外，尚不明确水凝胶是否能完全牢固地附着于培养板，其可能更容易脱落。因此，该包埋程序更适用于维持纤维的存活状态并使其稳定定位，以便进行收缩力测量。
本方案的使用可实现对成熟肌纤维在体外（ex vivo）的收缩动力学进行研究，适用于健康小鼠以及携带肌肉疾病相关基因突变的小鼠。同样，该方法可用于检测培养条件或添加化合物对肌纤维功能的影响。通过基于光学的系统获得的收缩数据可反映活体单根肌纤维的收缩能力，这种能力的变化可与肌纤维的健康状态相关联。然而，仅凭这些数据尚不足以确定这些变化是发生在肌动蛋白-肌球蛋白横桥形成阶段，还是肌肉收缩过程中的钙释放阶段。尽管本方案未描述钙信号的测量方法，但该系统同样能够测量收缩肌细胞中基于Fura的钙瞬变29。该系统的一个局限性在于趾长伸肌（FDB）仅包含快缩型IIa/IIx肌纤维，目前尚未有关于含有慢缩型I型纤维且尺寸相当的肌肉的报道37，因此无法利用该方法研究不同肌纤维类型特异性的功能差异。本文所提出的方案未来可能被改进用于其他肌肉（如EDL或比目鱼肌），以研究肌纤维类型的差异。但由于这些肌肉尺寸更大，本方案需进一步优化。较长的肌纤维在重力沉降步骤中容易缠绕，并在移液操作时发生破裂，导致收获率降低。由于不适用于移液操作，较长的肌纤维也较难适用于凝胶包埋技术。这些纤维仍可在二维培养体系中进行检测，但由于其尺寸较大，在收缩过程中可能发生更明显的移动，从而影响信噪比。该系统的另一局限性是无法在进行收缩测量的同时开展力学测量，而其他完整的肌纤维制备方法可实现此类力学测量28。然而，这一限制可通过估算肌纤维产生的力来克服。若已知肌纤维在收缩和松弛状态下的形态以及基质的杨氏模量，则可估算其产生的力25。尽管如此，这种基于光学的系统仍为研究肌肉收缩功能提供了一种操作简便、高通量的方法，并为研究遗传性肌肉疾病及治疗干预手段开辟了多种新的可能性。

技术进步 体外 细胞培养技术在严格控制的条件下利用哺乳动物组织，为研究组织再生能力、病理生理细胞机制以及后续治疗策略开辟了新的可能性1,2,3的使用 体外 肌肉研究领域内，培养系统已得到充分确立4,5。通常情况下， 体外-利用肌源性前体细胞分化得到的未成熟肌管2,6,7,8尽管在分化方案上已取得进展，能够生成更成熟的肌纤维9，它们的不成熟性仍然限制了研究结果向临床的转化 体内 设置1,10肌肉生物学领域的一个核心问题是肌肉无法 体外-分化形成的肌管，以充分模拟天然肌肉组织中复杂的细胞内结构、细胞信号传导过程及细胞外相互作用，并重要的是，重现肌肉纤维产生的收缩力1,2,10,11,12此外，成肌细胞在分化过程中不协调的收缩常常导致其自发从培养皿上脱落，从而使得对收缩功能的评估变得困难。 体外 分化的肌管难以处理，且局限于定性或半定量评估8,11,12,13这些局限性通常需要定期 体内 涉及动物的实验，特别是以肌肉收缩力为主要实验结果的实验1.
一种替代培养的方法 体外-分化的肌管是 离体 分离成熟肌纤维的培养1,14. 在期间 离体 培养，将发育成熟的肌肉组织从体内切除，随后进行单细胞分离，并在实验室条件下进行培养1,14分离的成熟肌纤维保持了其在天然组织中所观察到的复杂细胞结构14,15，并且该方法为在定义明确且可控的培养环境中进行直接干预（如基因操作和药物筛选）提供了可能。关于骨骼肌纤维分离的最早报道之一 离体 培养技术可追溯到20世纪30年代；然而，该方案获得的可存活纤维产量较低16随着分离步骤和培养条件的持续优化，现可显著提高存活且具有功能的肌纤维数量14,15,17,18,19一种改进的培养条件是在培养皿上包被细胞外基质蛋白，以促进分离的肌纤维在培养皿上的贴附。15,18,20通常使用层粘连蛋白包被，因为层粘连蛋白是肌肉细胞外基质中最丰富的成分之一20,21优化分离步骤并结合培养皿的包被处理，使肌肉研究领域能够在体外短期培养中维持分离的活性肌纤维，且其细胞结构完整并保留收缩功能1,15,18,22.
在肌肉研究领域，测量肌肉力量和收缩能力最常规的方法是将单个肌纤维固定在长度驱动电机和力传感器之间23,24。通常，用于此类电机驱动装置的肌纤维是从速冻或新鲜组织中分离得到，随后进行透化处理或&#34;去膜&#34;处理，从而允许外源性钙离子激活，通过调节不同浓度的钙离子来诱导肌纤维收缩24。尽管该方法是肌纤维收缩功能测量的金标准，但每次仅能测量一根肌纤维，使得该技术成为一种费力且耗时的过程25。此外，肌纤维的分离和去膜操作会破坏兴奋-收缩耦联过程中涉及的多种结构（即钙离子从肌浆网释放及随后的再摄取），因而无法研究舒张动力学以及可能影响该过程的疾病状态26,27。一种替代去膜肌纤维制备的方法是采用机械解剖法分离完整的肌纤维，从而可在电刺激激活下测量其收缩力28；然而，该方法技术难度高且极为耗时，导致通量较低。最后，在去膜和完整肌纤维制备中，肌细胞在收缩测量期间完全脱离了细胞外环境24，因而无法研究细胞外基质成分或刚度对肌纤维收缩的影响24。因此，亟需开发新的替代方法，以实现对完整肌纤维的高通量收缩能力检测，同时重建肌纤维与细胞外基质之间的连接。
最近，一种基于光学的高通量肌纤维收缩力测量新方法被开发出来29。该光学系统通过高速成像测量肌节的周期性，以评估收缩过程中的肌节长度。在此系统中，细胞在培养皿中保持固定，而光学装置移动，从而最大限度地减少对多个细胞进行测量之间所需的时间29。采用这种高通量光学方法的一个主要优势在于，它能够建立类似于天然组织的培养条件。一种用于模拟天然体内（in vivo）条件的方法是将细胞包埋于水凝胶中30。通常，水凝胶是一种能够维持其体积和形状的粘弹性材料，兼具固体和液体材料的特性31。其固相部分由相互交联的聚合物链构成，形成类似网状的结构30,31。水凝胶的材料特性可被调节，以模拟肌肉组织中的基质沉积30,31。因此，将高通量光学系统与包埋于水凝胶中的细胞相结合，为研究细胞外基质组成和力学特性对肌纤维功能的影响开辟了新的可能性。
本文的总体目标是：1）描述酶法分离和 离体 在模拟天然组织环境的条件下培养肌纤维，并通过高通量方法评估肌纤维收缩力。我们详细描述了一种通过酶消化法简便分离大量趾短屈肌（flexor digitorum brevis, FDB）单根肌纤维的方法。此外，我们介绍了一种将分离的肌纤维包埋于纤维蛋白基水凝胶中的技术，以模拟肌肉的天然微环境，提高肌纤维的存活率和收缩功能。随后，我们阐述了一种高通量检测活体肌纤维收缩的方法。 体外 使用这一新近开发的系统. 该包埋方法的另一个优势是在肌肉纤维收缩过程中将其固定，从而可能提高这些测量结果的信噪比。该凝胶包埋法适用于单一聚合物和复合凝胶封装程序，有助于评估细胞外基质成分对肌纤维收缩力的影响。

<table><tbody><tr><td>牛肺抑肽酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AAJ63039MC</td><td>100 mM 的 PBS 储备液可保存于 -20 &amp;deg;C.&amp;nbsp; 使用0.22 μm滤膜对储备液进行除菌 &amp;micro;m滤器</td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>沃辛顿</td><td>77336</td><td>10% (w/v) 储备液可在 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C. 称量胶原酶应在安全柜中进行，因为吸入该物质具有危险性。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆纤维蛋白原</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50-176-5054</td><td>20 mg/mL 的 PBS 储备液可在 -80 保存 &amp;deg;C. 使用 0.22 μm 滤膜过滤灭菌储备液 &amp;micro;m 滤膜</td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free 低生长因子基底膜基质</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1413201</td><td>4 mg/mL 储备液用 MEM 配制，于 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Gibco MEM 高糖 + 丙酮酸钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR 基底膜基质</td><td>康宁</td><td>CB-40230</td><td>4 mg/mL 储备液用 MEM 配制，于 -20 ℃ 保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>血清替代物2（50倍浓缩）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9388</td><td></td></tr><tr><td>凝血酶，牛血浆</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AAJ63383EXP</td><td>125 U/mL 的 PBS 储存液可在 -20℃ 保存 &amp;deg;C. 使用0.22 μm滤膜过滤灭菌储备液 &amp;micro;m 滤膜</td></tr><tr><td>氨甲环酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AC228042500</td><td>80 mM 的 PBS 储存液可保存于 -20 &amp;deg;C.&amp;nbsp; 使用0.22 μm滤膜对储备液进行除菌 &amp;micro;m 滤膜</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24孔电刺激仪</td><td>IonOptix</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>超细邦剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>MultiCell Cytocypher</td><td>IonOptix</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S3</td><td>IonOptix</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>MyoPacer</td><td>IonOptix</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅酮弹性体，基础组分 &amp;和固化剂&amp;nbsp;</td><td>道康宁&amp;nbsp;</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>Vannas弹簧剪 - 25 mm刃口</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CytoSolver</td><td>IonOptix</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard</td><td>IonOptix</td><td>N/a</td><td></td></tr></tbody></table>

基于光学系统的水凝胶包埋完整小鼠肌纤维高通量收缩力测量

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

体外细胞培养是评估细胞过程和测试治疗策略的有力工具。对于骨骼肌而言，最常用的方法包括将成肌祖细胞分化为未成熟的肌管细胞，或对分离的单个肌纤维进行短期离体培养。离体培养相较于体外培养的一个关键优势在于能够保留复杂的细胞结构和收缩特性。本文详细描述了一种从小鼠分离完整趾短屈肌纤维并进行后续离体培养的实验方案。在该方案中，肌纤维被包埋于基于纤维蛋白和基底膜基质的水凝胶中，以固定纤维并维持其收缩功能。随后，我们介绍了利用基于光学的高通量收缩力检测系统来评估肌纤维收缩功能的方法。通过电刺激诱导包埋的肌纤维产生收缩，再利用基于光学的定量技术评估其功能特性，如肌节缩短程度和收缩速度。将肌纤维培养与该&#160;系统相结合，可实现对药物制剂对收缩功能影响的高通量检测，并可用于遗传性肌肉疾病的离体研究。最后，该方案还可经适当调整，用于通过活细胞显微镜研究肌纤维中的动态细胞过程。

使用本方案，分离并包埋了单根FDB肌纤维于水凝胶中。肌组织解剖步骤的概览如图所示。 图1. 暴露带有完整肌腱的趾长伸肌（FDB），并从筋膜上分离。保留肌肉的肌腱作为固定点，可在分离过程中最大限度地减少对肌纤维的潜在损伤。可修剪掉多余的结缔组织，以减少碎片和非目标细胞类型的生长。当肌肉被充分切除并清理后，使用胶原酶进行酶解消化，并通过吹打释放单根肌纤维，随后将分离的细胞包埋于水凝胶中。FDB肌纤维的分离可获得相对较短的肌纤维，具有易于操作的优势。由于其尺寸适中，FDB肌纤维可安全地通过移液操作，不易因缠绕而受损，且易于包埋于水凝胶中。由于单根肌纤维在培养板上的贴附能力较差，将其包埋于水凝胶中可确保在细胞培养及收缩力测量过程中纤维保持固定。此外，在纤维蛋白凝胶中添加基底膜基质可促进肌纤维与基质之间的相互作用，模拟天然微环境 体内 环境。分离的单个肌纤维可在分离后于体外培养中进行操作并维持数天。在 图2图中显示了嵌入水凝胶基质中的分离FDB肌纤维示例。健康的肌纤维可见明显的肌节结构，并呈伸展笔直状态（蓝色箭头），而弯曲的肌纤维通常已受损或失去活性（黄色箭头），应排除在测量之外。过度收缩的肌纤维在基质中表现为深色团块状物（红色箭头）。若分离操作成功，健康肌纤维的比例应约为75%。过度收缩肌纤维比例较高通常表明在分离过程中造成了损伤。肌纤维膜的损伤可能由肌肉消化过度或吹打过程中对纤维造成机械损伤所致。吹打损伤主要发生在肌肉消化不足、难以充分解离的情况下。
通过基于光学的高通量收缩测量系统对肌纤维的收缩功能和活性进行评估。该系统可输出多个参数，如肌节长度、肌节缩短百分比、收缩速度和舒张速度。利用该收缩测量系统，可针对每根肌纤维单独测量其肌节收缩情况。图3展示了使用该测量系统测得的肌纤维收缩示例。从单次收缩瞬变曲线中可获得以下参数：基线时的肌节长度、收缩持续时间、最大收缩时的肌节长度以及舒张持续时间（图3A）。这些参数可用于计算肌节缩短百分比、收缩速度和舒张速度。如有需要，还可根据持续时间和绝对缩短值计算平均速度。有效的收缩测量曲线表现为一条平直的基线，随后下降至峰值，再恢复至基线水平（图3A）。噪声、肌节聚焦不清或纤维异常移动均可能影响测量瞬变曲线（图3B、C），此类测量数据可手动剔除，或由分析程序自动排除。在本方法中，肌节的清晰可视化对于收缩测量至关重要；因此，任何降低肌节可见性的因素均可能引入噪声。例如，若收缩过程中肌节在焦平面外发生移动，便可能出现此问题。对于一系列收缩在速度或深度上存在差异的测量数据，也应从数据集中剔除。
利用该系统获得的单根肌纤维收缩数据可用于比较不同的培养条件。系统的有效性如图4所示。在此，我们测量了FDB肌纤维在二维（层粘连蛋白包被的培养板）和三维（纤维蛋白水凝胶）培养条件下的收缩情况。在三维培养中获得的有效测量数据比例更高，因为将肌纤维包埋于凝胶中可防止侧向移动及其他运动伪影对测量结果的干扰（图4A）。与二维培养的肌纤维相比，将肌纤维包埋于凝胶中对肌节缩短程度或最大收缩速度均无显著影响（图4B）。为了说明不同基质对FDB肌纤维收缩的影响，我们还比较了该纤维蛋白水凝胶与纯基底膜基质（4 mg/mL）的作用（图4C）。在纯基底膜基质中观察到的收缩能力降低，可能是由于凝胶刚度较高或细胞-基质相互作用增强所致。我们还测试了高达7 mg/mL的纤维蛋白浓度，结果显示对收缩速度和缩短程度均无显著影响（未发表数据）。使用这种基于纤维蛋白的水凝胶可最大程度减少对收缩参数的干扰。
<img alt="小鼠肌腱提取方法；逐步实验；解剖示意图；解剖学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65103/65103fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：FDB肌肉解剖步骤概览。（A）在踝关节上方切断后肢（红色虚线），以及（B）沿足背蓝色虚线切开并去除皮肤。（C）通过踝关节和脚趾处的皮肤将足部固定在板上。（D）显微镜下观察暴露的肌肉及其周围结缔组织。筋膜呈白色不透明层，血管穿行其中。（E）将筋膜从肌肉上剥离，并沿红色虚线切断肌腱。（F）通过抬起并在肌肉下方及侧方进行切割，将FDB肌肉从下方组织分离。（G）当脚趾肌腱清晰可见时，沿红色虚线将FDB肌肉完全切下。（H）FDB肌肉由肌腱固定，可沿红色虚线切除第四外侧肌腱及其纤维。此时可修剪多余筋膜。（I）清洁后，将FDB肌肉转移至胶原酶溶液中。比例尺 = （D-I）2 mm。缩写：FDB = 趾短屈肌。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肌肉纤维分析显微镜图像；标注了健康、扭曲和过度收缩的纤维。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65103/65103fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：FDB 肌肉纤维在水凝胶中培养 24 小时后的显微图像。 蓝色箭头：存活良好的 FDB 肌肉纤维示例。黄色箭头：扭曲的 FDB 肌肉纤维示例。扭曲的肌肉纤维可能活力降低且收缩功能受损，因此应排除在测量之外。红色箭头：过度收缩的 FDB 肌肉纤维示例。过度收缩可能因吹打过于剧烈引起，也可能由胶原酶消化过度或使用未预平衡的培养基导致。比例尺 = 100 µm。缩写：FDB = 趾短屈肌。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电生理学分析、神经元活动中的瞬态吸收、三个对比图、数据" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65103/65103fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：使用基于光学的高通量收缩力检测系统测得的肌纤维收缩瞬变示例。 （A）正常收缩瞬变的示例。该瞬变数据来源于底部工具栏中紫色方框所圈定的肌节区域。该瞬变包含以下组成部分：基础状态下的肌节长度（绿色）、收缩持续时间（蓝色）、最大收缩时的肌节长度（紫色）以及舒张持续时间（红色）。收缩速度和收缩百分比等参数均由这些数值计算得出。（B）收缩瞬变不足的示例。当肌节信号因噪声干扰而未能被检测到时，会出现此类测量结果（见红色箭头所示）。（C）存在运动伪影的收缩瞬变示例（见绿色箭头所示）。当肌肉纤维在收缩过程中移出焦点范围时，即会产生运动伪影。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="2D与3D条件下的排斥率和收缩速度；Matrigel/纤维蛋白中的肌节缩短。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65103/65103fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：使用基于光学的高通量收缩力检测系统比较2D与3D培养条件及不同水凝胶时获得的代表性数据。（A）通过数据分析程序在2D培养和3D培养中检测到的可接受与被排斥的收缩测量值百分比，基于30次测量结果。（B）来自三只小鼠、经24小时培养后分离的2D培养与3D培养肌纤维的最大收缩速度比较。（C）来自三只小鼠、经24小时培养后分离的2D培养与3D培养肌纤维的肌节缩短程度比较。（D）来自三只小鼠、经24小时培养后分离的嵌入纯基底膜基质（Matrigel）和纤维蛋白水凝胶中的肌纤维的最大收缩速度比较。（E）来自三只小鼠、经24小时培养后分离的嵌入纯基底膜基质（Matrigel）和纤维蛋白水凝胶中的肌纤维的肌节缩短程度比较。数据采用Student's t检验进行分析，以均值±标准差表示。每个数据点代表一条肌纤维。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：用于解剖肌肉的解剖培养基、用于培养分离肌纤维的纤维蛋白培养基，以及用于酶解分离肌肉的肌肉消化培养基的成分。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103_JoVE%20Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：用于制备水凝胶的细胞混合物及基质混合物的组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65103/65103_JoVE%20Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

可通过定量分离的肌纤维的收缩能力来评估骨骼肌功能，传统方法通常采用费力且通量较低的技术。本文介绍一种基于光学的高通量方法，用于定量水凝胶包埋肌纤维的收缩能力。该方法适用于药物筛选和治疗开发。

体外细胞培养是评估细胞过程和测试治疗策略的有力工具。对于骨骼肌而言，最常用的方法……

本方案可用于评估基因突变对肌纤维功能的影响，此外还可用于旨在改善肌肉健康的药物筛选研究。该技术可在相对较短的时间内分离并测量大量肌纤维的收缩功能，且无需高级培训。可以通过改变水凝胶的组成，以验证环境信号对健康和病变肌肉的影响。该实验步骤中最困难的部分是肌肉的初始解剖。如果操作不够谨慎，可能会造成肌肉损伤，从而导致肌纤维活力下降。本实验操作将由本实验室的研究技术员 Leander Vonk 和博士生 Osman Esen 演示。首先，在已处死小鼠的踝关节上方切断其后肢下部。然后，从足背侧向脚趾方向在皮肤上做一切口。小心地向脚趾方向剥离皮肤，注意不要损伤肌肉。将解剖好的足部置于含有10毫升预热至37摄氏度的解剖液的密封培养皿中。通过仍附着在脚趾上的皮肤将足部固定。在踝关节远端固定小腿，仔细剥离肌肉表面的结缔组织。在足跟处切断肌腱并抬起肌肉。沿肌肉侧面及下方切开结缔组织，直至暴露脚趾的肌腱。当三条肌腱有一半长度暴露时，切断肌腱。将肌肉从足部分离，并固定趾短屈肌（FDB）的肌腱。清除肌肉上残留的任何结缔组织。将洁净的肌肉组织转移至含有预热解离液的离心管中。使用血清移液管将短收肌转移至含有肌肉消化液的离心管中。将组织置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育80分钟。将肌肉转移至含有3毫升解离培养基的15毫升离心管中。使用预先准备好的吹打枪头，从最大号到最小号依次吹打肌肉，持续吹打直至肌纤维从肌腱上分离。可用P200枪头移除肌腱。将解离的肌纤维转移至含有10毫升解离培养基的15毫升离心管中。在培养箱中孵育20分钟，使纤维沉降形成沉淀。小心地用移液器吸除纤维沉淀上方的所有培养基。在冰上，将每份肌肉的细胞用 875 微升细胞混合液重悬。向含有 125 微升细胞悬液等分试样的离心管中加入 125 微升基质细胞混合液。轻轻吹打混匀，避免产生气泡。立即将最终混合物转移至孔板中。在显微镜下检查肌纤维的活力。将凝胶置于培养箱中孵育30至45分钟，以促进凝固。操作完成后，小心向每个孔中加入 500 µL 培养基。打开基于光学的收缩力测量系统、荧光灯、细胞电刺激器和计算机。将电刺激器设置为 1.0 Hz、10 伏特，脉冲持续时间为 5 毫秒，以刺激分离的肌纤维。将培养板插入测量系统中。将起搏器连接到插入物上，并将其插入培养板中。打开 IonWizard 程序。单击“确定”。点击“文件”图标，然后选择“新建”以打开一个新文件。选择“采集实验”以检查程序是否处于正确的实验骨骼肌节上。如需更改实验，点击目标实验，然后按“添加”。设置参数为 SARC 20X，平均扫描线，单次 FFT，采样率为 250 赫兹，采集时间为 10 秒。将测量系统温度调整至 25 摄氏度。点击打开细胞查找器，弹出新窗口。选择培养板类型和活性孔。通过调节焦距滑块使纤维聚焦。启动 pacing 以施加电刺激，并观察纤维的收缩情况。保持肌节处于焦点位置，确保测量区域固定在纤维末端，使肌节呈垂直方向排列。当肌节聚焦清晰时，工具栏中将显示一个单一峰，该峰会随着收缩向右移动。在测量系统上对纤维进行测量。单击“开始”以启动实验。按下 Q 键开始测量 10 次收缩瞬变。如果有超过四次瞬变看起来无噪声，则按下 Z 键确认测量结果。如果瞬时信号噪声过大，则舍弃该次测量。实验结束后，按“停止”以关闭细胞查找窗口。保存文件并创建新文件。打开程序 CytoSolver 桌面版，然后点击“导入”并选择要分析的文件。分析完成后，识别蓝色、红色和灰色峰。点击“导出”。选择标题为“平均值到瞬态数据”的框，并导出至 Excel。由于三维纤维蛋白水凝胶可防止侧向移动及其他影响因素，因此在该条件下获得了更高比例的可用收缩性肌肉测量数据。纤维包埋对最大收缩速度或肌节缩短程度均无显著影响。在纯基底膜基质中观察到收缩减弱，这可能是由于凝胶硬度增加或细胞与基质相互作用增强所致。类似地，与纤维蛋白水凝胶相比，基底膜包埋也减少了肌节的缩短。需要注意的是，分离的肌纤维非常脆弱，在移液过程中应格外小心，避免对其造成损伤。分离完成后，还可进行免疫染色、蛋白质和RNA提取等方法。该技术的发展为以高通量方式研究成熟肌纤维功能开辟了新的可能性。

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