使用基于光学的系统对水凝胶嵌入的完整小鼠肌纤维进行高通量收缩测量

该协议可用于评估基因突变对肌纤维功能的影响。此外，它还可用于旨在改善肌肉健康的药物筛选研究。该技术可用于在相对较短的时间内分离和测量大量肌肉纤维的收缩力，而无需高级训练。

水凝胶的成分可以改变，以证明环境线索对健康和患病肌肉的影响。手术中最具挑战性的部分是肌肉的初始解剖。如果不采取足够的护理，肌肉损伤会导致肌肉纤维的活力下降。

演示该程序的将是研究技术员Leander Vonk和我实验室的博士候选人Osman Esen。首先在脚踝上方切割安乐死小鼠的小后腿。在脚背侧的皮肤上向脚趾切开一个切口。

小心地将皮肤剥离到脚趾，注意不要损伤肌肉。将解剖的脚放入装有 10 毫升预热解剖培养基的密封保护盘中，温度为 37 摄氏度。将脚穿过仍然附着在脚趾上的皮肤。

将小腿别在脚踝之外，小心地切除肌肉顶部的结缔组织。切掉脚跟的肌腱，抬起肌肉。通过结缔组织在肌肉旁边和下方切开，直到脚趾肌腱暴露出来。

当三根肌腱长度的一半暴露出来时，切断肌腱。从脚上释放肌肉并固定FDB肌肉的肌腱。从肌肉中去除任何剩余的结缔组织。

将干净的肌肉组织转移到含有预热解剖培养基的管中。使用血清移液管将短肌转移到含有肌肉消化培养基的管中。将组织置于37摄氏度的培养箱中，在5%二氧化碳下放置80分钟。

将肌肉转移到含有三毫升解剖培养基的15毫升管中。使用准备好的研磨尖端，从最大到最小移液肌肉并继续研磨，直到肌肉纤维从肌腱上脱落。肌腱可以用P200尖端去除。

将解离的肌纤维转移到含有10毫升解剖培养基的15毫升管中。让纤维在培养箱中沉淀 20 分钟，直到形成颗粒。小心地从纤维颗粒顶部移取所有培养基。

在冰上，将细胞重悬于每块肌肉875微升的细胞混合物中。将 125 微升基质细胞混合物加入含有 125 微升细胞悬等分试样的管中。通过轻柔移液混合，避免形成气泡。

立即将最终混合物转移到孔中。在显微镜下检查肌肉纤维的活力。将凝胶置于培养箱中30至45分钟以促进凝固。

完成后，小心地将500微升培养基加入每个孔中。打开基于光学的收缩测量系统、荧光灯、电电池起搏器和计算机。将电刺激器设置为 1.0 伏的 10 赫兹，脉冲持续时间为 5 毫秒，以刺激孤立的肌肉纤维。

将板插入测量系统。将起搏器连接到插入物并将其插入培养板中。打开程序离子向导。

单击"确定"。通过单击打开一个新文件 文件 图标，然后单击新建。选择"收集实验"以检查程序是否位于正确的实验骨骼肌节上。若要更改实验，请单击所需的实验，然后按"添加"。

应用设置 SARC 20X、平均线、单 FFT、250 赫兹采样率和 10 秒的采集时间。将测量系统温度更改为 25 摄氏度。单击打开的单元格查找器以创建新的屏幕弹出窗口。

选择板类型和活性孔。通过调整对焦滑块来聚焦光纤。使起搏能够诱导电刺激并观察纤维抽搐。

保持肌节聚焦，确保测量区域固定在纤维端，使肌节垂直运行。当肌节聚焦时，工具栏中可以看到一个峰值，该峰值将在收缩时向右移动。测量系统上的光纤。

单击"开始"开始实验。按 Q 键开始测量 10 个收缩瞬变。如果四个以上的瞬变看起来没有噪声，请按Z键接受测量。

如果瞬变包含过多噪声，请拒绝测量。实验结束后，按停止关闭细胞查找器窗口。保存文件并创建一个新文件。

打开程序CytoSolver桌面，然后单击导入并选择要分析的文件。分析完成后，确定蓝色、红色和灰色峰。单击导出。

选中标题为"平均到瞬态数据"的框并导出到Excel。在3D纤维蛋白水凝胶中获得了更高百分比的可用收缩肌测量，因为它可以防止横向运动和其他影响因素。纤维包埋对最大收缩速度或肌节缩短无显著影响。

观察到纯基底基质收缩减少可能是由于凝胶硬度或细胞基质相互作用增加。同样，与纤维蛋白水凝胶相比，基底基质包埋也减少了肌节缩短。重要的是要记住，分离的肌肉纤维非常脆弱，在移液过程中应格外小心不要损坏它们。

分离程序后，还可以进行免疫染色，蛋白质和RNA分离等方法。该技术的发展为以高通量方式研究成熟肌纤维功能开辟了新的可能性。