Name: 测量体外分化的离体小鼠脂肪组织和原代前脂肪细胞的脂肪分解率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学习使用小鼠离体脂肪组织和原代前脂肪细胞测量脂肪分解率的方法。该方案采用连续采样和酶学检测技术，可精确比较基础与刺激条件下的脂解速率，为代谢疾病研究提供可靠的实验手段。

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本工作获得了美国国立卫生研究院资助 R01DK126944 对 S.M.R. 的支持。

所有动物的使用均经康奈尔大学威尔康奈尔医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 缓冲液和收集板的准备
<ol>
	<li>通过将 5 g 牛血清白蛋白（BSA）溶解于 100 mL 无酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中配制 5% BSA 溶液。轻轻搅拌使 BSA 溶解（避免震荡，因其不利于溶解）。待 BSA 完全溶解后，使用 0.2 µm 滤器过滤除菌。将配制好的 BSA 培养基于 4 °C 保存，最长可保存 1 个月。</li>
	<li>配制对照组和刺激组的工作浓度培养基。对照组培养基：含溶剂对照的 5% BSA 培养基。刺激组培养基：含 0.5 µM CL-316,243 的 5% BSA 培养基。每次实验均需新鲜配制刺激组培养基。</li>
	<li>将待用培养基预热至 37 °C。标记一块 96 孔板用于收集培养基。</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>按照以下说明进行细胞培养。所有细胞操作均应在无菌通风橱中进行，以尽量减少外部污染。
	<ol>
		<li>分离并诱导原代前脂肪细胞分化，方法见文献73,74。
		<ol>
			<li>将原代前脂肪细胞以高密度接种，例如在24孔板中每孔接种1 × 105个细胞，每孔加入1 mL培养基（含15%胎牛血清（FBS）和1×青霉素-链霉素-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基）。</li>
			<li>待细胞达到100%融合后，使用含5 µM地塞米松、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 µg/mL胰岛素和1 µM噻唑烷二酮（TZD）的培养基诱导分化3天。随后更换为含1 µg/mL胰岛素的培养基继续培养至少3天，以促进脂滴形成。24孔板中每孔使用1 mL培养基。</li>
			<li>每隔2至3天更换一次含胰岛素的培养基（每孔1 mL）。细胞可在含胰岛素的培养基中维持培养长达2周。本实验仅使用分化率超过90%且各组间分化程度相近的细胞培养物，因为分化率降低可能被误判为脂解速率下降。</li>
			<li>在测定脂解作用前24小时，将细胞转移至无胰岛素培养基中培养。 
			注：培养基中的胰岛素可维持脂滴稳定，但同时会抑制脂解作用。在无胰岛素条件下孵育24小时，可在不减少脂滴体积的前提下实现充分的脂解激活。在某些实验体系中，可能需要缩短或延长无胰岛素培养时间。</li>
			</ol>
		</li>
		<li>用DPBS洗涤细胞一次，以去除培养基中残留的血清。 
		注：本方案不包括血清饥饿处理，因其可能激活脂解作用。是否采用血清饥饿处理可由研究人员自行决定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下说明进行离体（ex vivo）培养。
	<ol>
		<li>准备一块6孔板，每只小鼠每种组织对应一个孔。向每个待用孔中加入4 mL室温DMEM培养基。 
		注：收集用培养基中无需添加BSA。</li>
		<li>为脂解实验准备一块48孔板，每个重复对应一个孔。向每个待用孔中加入400 µL室温DMEM培养基。每只小鼠每种组织设置2至4个对照孔和2至4个刺激孔。</li>
		<li>在麻醉状态下通过颈椎脱位处死小鼠，并辅以双侧气胸等二次确认方法。本实验使用一只32克、7月龄的雌性C57BL/6J小鼠，喂养45%高脂饮食持续4个月。 
		注：本方案同样适用于雄性小鼠以及其他品系、饮食条件和年龄的小鼠。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒腹部，使用剪刀在腹部皮肤中央做一小（约1 cm）侧向切口，用拇指和食指捏住切口两侧将皮肤分开，并将下腹部皮肤翻折，暴露后部皮下脂肪组织。定位并移除腹股沟淋巴结，使用镊子钝性分离位于腹股沟淋巴结后方的腹股沟脂肪组织。</li>
		<li>为收集性腺脂肪组织，需在腹膜上做一侧向和一纵向切口，以进入腹腔。用镊子夹住性腺脂肪垫，沿子宫（或雄性小鼠的附睾）剪开，以完整取出性腺脂肪组织。将收集的脂肪组织置于6孔板中。</li>
		<li>将组织从孔中取出，放置于硅胶垫上，用剪刀剪成5至7 mg的小块。</li>
		<li>为每个检测孔称取25至30 mg（即5或6块）组织，并放入48孔检测板中。称重前用洁净纸巾轻拭组织以去除多余液体。组织取出后重新称量称重舟，并记录残留物重量。每次更换样品前应清洁称重舟，必要时重新归零。每种组织应使用新的称重舟。</li>
		<li>待所有组织样本称重完毕后，将48孔检测板置于37 °C、10% CO2培养箱中孵育15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脂解作用检测
<ol>
	<li>进行培养基收集。在无菌通风橱中进行培养基转移及后续样品收集，以尽量减少外来污染风险。
	<ol>
		<li>在 t = 0 时，移除培养基并加入 400 µL 每孔加入对照或刺激培养基，并将检测板放入 37 °C，10% CO₂2 培养箱。对于 离体 组织培养，使用移液器小心移除培养基；切勿使用抽吸法。 
		注意：或者，另准备一块含有对照和刺激培养基的培养板，并将组织转移至其中。</li>
		<li>在 t = 1、2、3 和 4 h 时，收集 200 µL 培养基，更换为 200 µL 加入适量的对照或刺激培养基，将检测板放回培养箱中孵育。将收集板置于 4 °C为确定BSA培养基对游离脂肪酸的缓冲能力，需在24小时时增加一次样品采集。 
		注意：实验可在此处暂停，收集的培养基可保存于 -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 游离脂肪酸比色测定法
<ol>
	<li>将试剂 warming 至室温，并用一瓶溶剂 A 溶解一瓶显色试剂 A，用一瓶溶剂 B 溶解一瓶显色试剂 B。自复溶之日起，这些试剂最好在 1 周内使用完毕，复溶 1 个月后应弃用。</li>
	<li>解冻样品并混匀。</li>
	<li>建立游离脂肪酸（FFA）标准曲线。标准溶液浓度为 1 mM。配制标准曲线时，使用以下体积的试剂：25 µL、20 µL、15 µL、10 µL、10 µL（1:2 稀释）、10 µL（1:4 稀释）、10 µL（1:8 稀释），以及 10 µL 水以获得最大检测范围。对于较低 FFA 水平，可使用 10 µL 的 1 mM、0.8 mM、0.6 mM、0.4 mM、0.2 mM、0.1 mM 和 0.05 mM 标准品，可能更为适用。</li>
	<li>将标准品和样品移取至 96 孔检测板中。推荐样品体积为 10 µL。同时设置三个孔，加入与样品等体积的 BSA 培养基，用于背景校正。 
	注意：若样品浓度超出标准曲线范围，请重复实验，并将样品体积调整为 2–25 µL。</li>
	<li>向每孔加入 150 µL 试剂 A 并混匀。避免产生气泡。如有气泡，可用细针头刺破。将检测板在 37 °C 下孵育 5 分钟。</li>
	<li>在 550 nm 波长下测定吸光度，以 660 nm 为参考波长（读数 A）。</li>
	<li>向每孔加入 75 µL 试剂 B 并混匀。避免产生气泡。如有气泡，可用细针头刺破。将检测板在 37 °C 下孵育 5 分钟。</li>
	<li>再次在 550 nm 波长下测定吸光度，以 660 nm 为参考波长（读数 B）。</li>
</ol>
5. 甘油比色测定法
<ol>
	<li>用 36 mL 超纯水重悬游离甘油检测试剂，并平衡至室温。这些试剂最好在几周内使用完毕，重悬后 2 个月应弃用。</li>
	<li>解冻样品并混匀。</li>
	<li>通过将甘油标准溶液进行 7 个梯度的 2 倍系列稀释，并设置水空白对照，建立甘油标准曲线。 
	注意：标准曲线在 25 µL 的 2.8 mM 甘油浓度范围内呈相对线性，更高浓度时不再呈线性。</li>
	<li>将 25 µL 的标准品和样品分别加入 96 孔检测板中。设置三个含 BSA 培养基的孔用于背景校正。</li>
	<li>向每孔加入 175 µL 游离甘油检测试剂并混匀。避免产生气泡，如有气泡可用细针头刺破。将检测板在 37 °C 孵育 5 分钟。</li>
	<li>在 540 nm 波长下读取检测板的吸光度。</li>
</ol>
6. 脂解速率的计算
<ol>
	<li>从光密度（OD）值开始。对于甘油，使用 A540 直接读取OD值。根据以下公式计算FFA测定的OD值： 
	OD = （读数 B：A550 - A660) - （读数 A：A550 - A660)</li>
	<li>使用标准曲线计算所收集样品中的游离脂肪酸（FFA）和甘油含量。以标准品的光密度（OD）值为纵坐标（y轴），以相对于样品体积的标准品浓度为横坐标（x轴）（即各孔中标准品的浓度） 20 µL 1 mM FFA 标准品在一块板上的 10 µL 样品的浓度等于 2 mM）。拟合线性趋势线： 
	y = mx + b</li>
	<li>目视检查标准曲线，剔除超出检测线性范围的任何数据点。使用以下公式计算样品浓度： 
	样品浓度：x = (OD - b) ÷ m</li>
	<li>调整并重新检测超出线性检测范围的样本。为获得最终样本浓度，需从样本浓度中减去仅含BSA培养基的背景孔浓度。</li>
	<li>根据以下公式计算每个时间点各样品中游离脂肪酸和甘油的生成摩尔数： 
	<img alt="分子量计算，公式 Mn=Cn×Vt+ΣCkVs，化学分析方法" src="/files/ftp_upload/65106/65106eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
	其中 Cn = 时间点的浓度 t = n; Vt = 孔中的总体积； Vs = 样本采集量；以及 Mn = 时间 t 时生成的摩尔数 t = n （当浓度单位为 mM、体积单位为 mL 时，输出结果为 µMol). 
	例如，在不同时间点： 
	M1 = C1 × Vt 
	M4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3) Vs 
	或 
	M4 = C4 × Vt + C3 × Vs + C2 × Vs + C1 ×Vs</li>
	<li>通过将每个样本的数值除以其组织重量（单位：克），归一化至组织重量，以获得单位为 µmol/g对于培养的细胞，数值表示为 µmol/well确保各孔之间的细胞数量和分化效率具有可比性。 
	注意：增殖或分化效率的差异将使结果的解释复杂化，并需要采用其他归一化方法（例如，以蛋白质含量为基准进行归一化；参见讨论部分）。</li>
	<li>计算斜率 µmol/g 为每个样本分别绘制产物量（y轴）随时间（x轴）的变化曲线。
	<ol>
		<li>在电子表格中，可使用 =SLOPE(已知_y值, 已知_x值) 函数完成此操作。在新单元格中输入“=SLOPE”，然后使用光标选中样品甘油或游离脂肪酸（FFA）的数值 µmol/g，然后突出显示相应的时间值）。</li>
		<li>验证数据的线性关系。R2 R² 值是快速判断样品线性程度的一种方法。在电子表格中，可使用 =RSQ(known_ys,known_xs) 函数实现，操作方式与步骤 6.7.1 中所述相同，但初始输入为 =RSQ。确保 R2 值为 &gt; 0.98；较低的数值表明偏离线性。这可能是由于测量/取样误差或线性丧失所致。
		<ol>
			<li>测试线性的另一种方法是对每个样本进行线性回归并绘制残差图。在统计分析软件中，创建一个XY表格，每个时间点对应一个单一的Y值。选择 分析 &gt; 简单线性回归 并选中该复选框 残差图 撞击前 好的残差图将显示为一张新图表。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用游离脂肪酸（FFA）和甘油的生成速率（即斜率[(µmol/g对每个样本以单个数据点进行统计分析，并在比较不同脂肪分解条件时绘制相应数值。若比较不同基因型间的脂肪分解速率，则每只动物使用两到三个样本作为技术重复，取其平均值作为该动物的一个数据点，从而使样本量等于动物数量。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在此，我们提供一种用于测定脂肪细胞脂解速率的基本实验方案 离体 脂肪组织。为了定量测定脂解作用，重要的是在脂解的线性相内测量其速率。我们采用连续取样技术，即在固定时间间隔收集大部分培养基并补充新鲜培养基。这种半保守方法可不断添加具有游离脂肪酸缓冲能力的新鲜牛血清白蛋白（BSA），延缓反馈抑制，从而延长线性脂解的持续时间。该实验设计旨在模拟脂肪组织的血管化环境。 体内，可提供新鲜的白蛋白以结合释放的游离脂肪酸75. 本方案已优化用于检测小鼠中的脂解作用 离体 白色脂肪组织和腹股沟脂肪组织原代前脂肪细胞分化 体外该方案有望经过优化后适用于棕色和米色脂肪组织库，以及来自其他生物体和具有高脂肪生成潜能的永生化细胞系的脂肪组织。在收集脂肪组织之前，该方案对小鼠的年龄、性别和饮食具有灵活性。 离体 检测方法。某些操作（如禁食）可能影响基础脂解速率，而其他干预措施（如饮食诱导的肥胖）也会影响刺激性脂解的速率。
该方案需针对每个实验系统进行优化，具体取决于脂肪分...

过量的营养物质以甘油三酯的形式储存在白色脂肪组织中，这些甘油三酯位于脂滴的中性脂质核心内。甘油三酯储存随后被动员利用 通过 脂解作用，即脂肪组织中的甘油三酯在脂肪组织甘油三酯脂肪酶（ATGL）、激素敏感性脂肪酶（HSL）和单酰甘油脂肪酶（MGL）的作用下，逐步水解其脂肪酸侧链，最终释放出游离脂肪酸（FFAs）和甘油骨架的过程1,2脂解作用由脂肪组织中的儿茶酚胺信号通路激活。交感神经末梢局部释放儿茶酚胺，与脂肪细胞质膜上的β-肾上腺素能受体结合。配体结合后，这些G蛋白偶联受体（GPCRs）激活腺苷酸环化酶。 通过 Gαs随后，cAMP 激活蛋白激酶 A（PKA），导致 ATGL 和 HSL 的表达上调。PKA 对 perilipin-1 的磷酸化引起 ABHD5（亦称为 CGI-58）的解离，后者可结合并共激活 ATGL。3PKA 直接磷酸化 HSL，促进其从胞质溶胶转位至脂滴，在脂滴上与磷酸化的 perilipin-1 相互作用，进一步增强其脂肪酶活性4,5,6,7参与脂解的第三种脂肪酶MGL似乎不受儿茶酚胺信号通路的调控8重要的是，脂肪细胞中的甘油三酯合成由甘油脂质合成途径介导，该途径不涉及单酰基甘油作为中间产物；相反，甘油-3-磷酸酰基转移酶催化生成溶血磷脂酸，后者与另一分子脂肪酰基辅酶A结合形成磷脂酸，再异构化为二酰基甘油，最终合成甘油三酯（图1)9,10,11.
<img alt="脂肪分解与甘油酯合成通路示意图，包含TG、DG、MG及酶促反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65106/65106fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：脂肪分解与甘油酯合成通路。上部：脂肪分解通路；红色标注的酶：脂肪组织甘油三酯脂肪酶（ATGL）、激素敏感性脂肪酶（HSL）和单甘油酯脂肪酶（MGL）。下部：甘油酯合成通路；绿色标注的酶：二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）、磷脂酸磷酸酶（PAP）、溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAT，也称为LPAATs）和甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）。脂类：甘油三酯（TG）、二酰基甘油（DG）、单酰基甘油（MG）、游离脂肪酸（FFA）、脂肪酰基辅酶A（FA-CoA）、溶血磷脂酸（LPA）和磷脂酸（PA）。其他代谢物：无机磷酸盐（Pi）和甘油-3-磷酸（G3P）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65106/65106fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
细胞外腺苷是通过G蛋白偶联受体调控脂解的另一个重要调节因子s- 和 Gi-偶联的GPCR影响腺苷酸环化酶活性。脂肪细胞中主要的腺苷受体ADORA1通过激活G蛋白抑制腺苷酸环化酶，从而抑制脂解作用。i12表达水平较低，主要存在于棕色脂肪细胞中，ADORA2A 激活脂解作用 通过 Gs 信号转导13ADORA1 影响基础脂解作用以及对肾上腺素能激动剂的反应。通过添加腺苷脱氨酶以中和腺苷，以及使用 ADORA1 特异性激动剂苯基异丙基腺苷，可调控腺苷对脂解作用的影响。14,15激素激活Gq-偶联的GPCR也可影响脂解作用 通过 磷脂酶C和蛋白激酶C的激活16,17,18,19炎症信号还会影响脂肪分解速率。LPS（及其他内毒素）通过激活TLR4，进而激活ERK，促使perilipin-1和HSL磷酸化，从而提高脂肪分解速率。20TNF-α 还可激活脂解作用 通过 ERK 和 NF-κB 的激活，以及磷酸二酯酶 PDE-3B 和 CIDEC 的转录下调21,22,23. IL-6 还与脂肪细胞脂解作用增强相关，尤其是在肠系膜脂肪组织中，其释放的游离脂肪酸会影响肝脂肪变性和糖异生24,25,26.
进食状态下，胰岛素抑制脂解作用。AKT 磷酸化并激活 PDE-3B，从而抑制 cAMP 信号传导，防止 PKA 激活27。胰岛素还可转录下调 ATGL 的表达28。肥胖通过多种机制促进儿茶酚胺抵抗，其中包括脂肪细胞中 β-肾上腺素能受体的下调29,30,31,32,33。脂肪细胞表达全部三种 β-肾上腺素能受体（β-1、β-2 和 β-3）。尽管 β-1 和 β-2 肾上腺素能受体广泛表达，但在小鼠中，β-3 肾上腺素能受体主要在脂肪细胞中表达34,35。Adrb3 的表达在脂肪生成过程中由 C/EBPα 诱导36。β-3 肾上腺素能受体在成熟脂肪细胞中高表达。β-1 和 β-2 肾上腺素能受体的激活具有自我限制性，这是由于 β-arrestin 介导的反馈抑制作用37。β-3 肾上腺素能受体的反馈抑制则由其他信号通路介导，这些通路可降低 Adrb3 的表达水平33,38,39。
多种化合物可用于激活脂肪细胞的脂解作用。儿茶酚胺是脂解作用的主要生理性激活剂。去甲肾上腺素（或称去甲肾上腺素）和肾上腺素（或称肾上腺素）可激活全部三种β-肾上腺素能受体。40去甲肾上腺素和肾上腺素也影响脂解作用 通过 α-肾上腺素能受体信号通路的激活41常用的β-肾上腺素能受体激动剂包括非选择性β-肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素，以及β-3肾上腺素能受体激动剂CL-316,243和米拉贝隆42由于脂肪细胞主要表达β-3肾上腺素能受体，本文以CL-316,243为例。该化合物对β-3肾上腺素能受体具有特异性，因此也可作为脂肪细胞儿茶酚胺信号通路的相对特异性激活剂，并且可安全使用 体内请注意，常用浓度为 10 µM 细胞培养中CL-316,243的浓度比~高几个数量级0.1 µM 达到最大反应所需的剂量33福斯科林（Forskolin）可绕过肾上腺素能受体，直接激活腺苷酸环化酶及下游的脂解信号通路。除福斯科林外，还存在多种其他脂解激活剂和抑制剂。在选择用于刺激脂解的化合物时，应在实验设计中仔细考虑其受体特异性及下游信号通路。
白色脂肪组织中脂解作用的速率是影响耐寒性以及禁食或运动期间营养物质可利用性的重要代谢因素43,44,45,46本实验方案的目的是测量脂肪细胞和脂肪组织中的脂解速率，这将有助于理解脂肪细胞代谢及其对不同小鼠模型代谢表型的影响。为了定量脂解速率，我们检测培养基中脂解产物的生成量（即游离脂肪酸和甘油）。该方法基于脂肪细胞将脂解产物释放到培养基中的过程。由于白色脂肪细胞表达的甘油激酶水平较低，甘油的重摄取速率很低47相反，也应考虑非脂解代谢途径产生的游离脂肪酸和甘油。脂肪细胞似乎表达一种对甘油-3-磷酸具有活性的磷酸酶，能够利用来自葡萄糖的甘油-3-磷酸生成甘油48,49,50糖酵解是白色脂肪细胞中用于游离脂肪酸再酯化的甘油-3-磷酸的来源。当葡萄糖水平受限时，甘油酮生成需要其他三碳来源，如乳酸和丙酮酸。51脂肪分解释放的游离脂肪酸（FFAs）在细胞内的转运途径及其代谢去向尚不明确；脂肪分解产生的FFAs必须先转化为脂肪酰辅酶A（fatty acyl-CoA），才能进行再酯化或β-氧化。现有证据表明，脂肪分解释放的FFAs可能先从细胞中释放出去，随后被重新摄取并转化为脂肪酰辅酶A52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62游离脂肪酸（FFAs）可被白蛋白在细胞外螯合。重要的是，若长链游离脂肪酸未被白蛋白螯合，则已知会通过负反馈抑制脂解作用。63,64,65,66,67因此，在脂解测定过程中优化培养基对游离脂肪酸的缓冲能力至关重要。本文所述方法与先前发表的用于测定脂肪细胞脂解速率的方法类似。 离体 小鼠和人类的脂肪组织15,68,69,70,71该方案通过连续取样进行区别；通过实施连续取样，我们能够在内部验证脂解作用是否处于线性阶段，并利用多次测量值计算脂解速率，从而减少测量误差，提高最终计算结果的可信度。连续取样的缺点是实验需要更多时间和试剂；然而，较长的实验时间可降低测量误差对速率估计标准误的影响。此外，该方案同时测定游离脂肪酸（FFA）和甘油的释放量，并考察FFA与甘油释放的比值，目标是达到3:1的比值，这与完全脂解后脂解产物完全释放至培养基中的预期相符。72.

<table><tbody><tr><td>24孔组织培养处理板</td><td>Corning Inc</td><td>3527</td><td>必须经过组织培养处理，适用于脂肪细胞分化</td></tr><tr><td>48孔平底带盖板</td><td>Corning Inc</td><td>353078</td><td>可使用组织培养处理板</td></tr><tr><td>6孔平底带盖板</td><td>Corning Inc</td><td>353046</td><td>可使用组织培养处理板</td></tr><tr><td>96孔PCR板</td><td>USA sceintific</td><td>1402-9100</td><td>任何0.2 mL锥形PCR板均可使用&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>无游离脂肪酸的BSA（如A8806）也常被使用。BSA中不应含有可检测的游离脂肪酸，且不同批次BSA的差异可能影响脂解速率的观测结果</td></tr><tr><td>CL-316,243</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5976</td><td>CAS #: 138908-40-4，也可从其他供应商获取</td></tr><tr><td>CO2培养箱</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVH</td><td>脂肪组织培养时CO2浓度理想设置为10%，但5% CO2也可使用</td></tr><tr><td>DMEM低糖培养基，不含酚红</td><td>Thermofischer</td><td>11054020</td><td>任何不含酚红的培养基均可使用，如DMEM/F12、RPMI，但应具备挥发性缓冲能力，即含有碳酸氢盐</td></tr><tr><td>无游离脂肪酸牛血清白蛋白</td><td>Equitech-Bio, Inc,&amp;nbsp;</td><td>BAH66</td><td></td></tr><tr><td>游离甘油检测试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>甘油标准溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7793&amp;nbsp;</td><td>也可通过将甘油稀释至所需浓度自行配制</td></tr><tr><td>HR系列NEFA标准溶液</td><td>Fujifilm</td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>HR系列NEFA-HR (2) 显色试剂A</td><td>Fujifilm</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>HR系列NEFA-HR (2) 显色试剂B</td><td>Fujifilm</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>HR系列NEFA-HR (2) 溶剂A&amp;nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>HR系列NEFA-HR (2) 溶剂B&amp;nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>微生物培养箱</td><td>Fischer Scientific</td><td>S28668</td><td>任何可在37°C下运行的培养箱均可使用</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>269620</td><td>任何光学透明、平底的96孔板均可使用</td></tr><tr><td>硅胶实验室台面垫</td><td>VWR</td><td>76045-300</td><td>也可使用玻璃板。不推荐使用吸水性表面</td></tr><tr><td>分光光度计/微孔板读板仪</td><td>Molecular devices</td><td>SpectraMax i3x&amp;nbsp;</td><td>任何可在540 nm、550 nm和660 nm波长下读数的微孔板读板仪均可使用</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810531</td><td></td></tr><tr><td>WypAll X70擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>41200</td><td>任何高质量的纸巾均可使用</td></tr></tbody></table>

测量脂解速率 离体 小鼠脂肪组织及分化后的原代前脂肪细胞 体外

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

脂肪细胞以脂滴中的甘油三酯形式储存能量。这种能量可以被动员利用。 通过 脂解作用，即脂肪酸侧链从甘油骨架上依次断裂，从而释放出游离脂肪酸和甘油。由于白色脂肪细胞中甘油激酶表达水平较低，甘油的再摄取速率可忽略不计，而脂肪酸的再摄取则取决于培养基成分（如白蛋白）对脂肪酸的结合能力。通过比色法检测培养基中甘油和脂肪酸的释放量，可定量测定脂解速率。通过在多个时间点测量这些指标，可高置信度地确定脂解的线性速率。本文提供了一种详细测定脂解作用的实验方案 体外 分化后的脂肪细胞和 离体 小鼠的脂肪组织。该方案也可针对其他前脂肪细胞系或其他生物体的脂肪组织进行优化；文中讨论了相关注意事项及优化参数。本方案旨在用于确定和比较不同小鼠模型及处理之间的脂肪细胞脂解速率。

我们测定了基础状态和刺激状态下的脂解速率 体外 分化后的脂肪细胞。通过使用诱导剂处理汇合的细胞，将来自腹股沟白色脂肪组织的原代前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞。 5 µM 地塞米松，0.5 mM IBMX 1 µg/mL 胰岛素，以及 1 µM 曲格列酮处理4天，随后再进行3天的额外处理 1 µg/mL 胰岛素。在进行脂解实验前，细胞在不含胰岛素的培养基中孵育24小时。在时间=0小时时，细胞用PBS洗涤一次，然后加入含2% BSA且不含酚红的DMEM，培养基中或含有 10 µM CL-316,243 或对照溶剂被加入至12孔板的每孔中。在给药后1 h、2 h、3 h和4 h，收集50%的培养基，并更换为含2% BSA的酚红-free DMEM。检测所收集培养基中的游离脂肪酸（FFA）和甘油水平，并计算各时间点分泌至培养基中的FFA和甘油的摩尔数。图2A，B）。游离脂肪酸和甘油的生成在4小时测定中呈线性，其R2 0.98 及以上。4 小时的游离脂肪酸（FFA）水平略低，表明脂解速率可能正在减缓；然而，无论是否包...

脂肪细胞中的甘油三酯脂肪分解是一种重要的代谢过程，可释放出游离脂肪酸和甘油。本文提供了一种详细的实验方案，用于检测脂肪细胞的基础脂肪分解和刺激诱导的脂肪分解。 离体 小鼠脂肪组织

脂肪细胞以脂滴中的甘油三酯形式储存能量。这种能量可通过脂解作用释放，其中脂肪酸侧链被……

本方案详细描述了在培养的脂肪细胞或离体脂肪组织中测定脂肪细胞脂解速率的方法，可用于比较不同小鼠模型或处理之间的脂解速率。本方案采用连续取样法，可内部验证脂解测定处于线性阶段，从而降低测量误差。经过优化后，本方案也可用于测定棕色脂肪组织、其他生物来源的脂肪组织或脂肪生成细胞系中的脂解作用。离体组织必须切成大小和形状一致的小块，以便培养基中的牛血清白蛋白（BSA）能够结合释放出的游离脂肪酸。首先，通过将五克牛血清白蛋白（BSA）溶解于100毫升不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中来配制5% BSA培养基。轻轻搅拌溶液以溶解BSA。然后制备对照和刺激培养基的工作浓度。使用前将培养基预热至 37 °C。标记一个 96 孔板用于收集培养基。在无菌通风柜内，对100%融合的原代前脂肪细胞进行分离和诱导分化。每两到三天更换一次含有胰岛素的培养基，每孔维持1毫升的培养液体积。本研究仅使用分化率高于90%且各组间分化率相近的细胞培养物。然后在无胰岛素培养基中培养细胞24小时，再检测脂解作用。用DPBS洗涤细胞一次，以去除培养基中残留的血清。准备一块48孔板，每孔用于一个重复样本。将 400 微升室温 DMEM 加入每个待用孔中。每只小鼠每种组织设置两到四个对照孔和两到四个刺激孔。准备一个六孔板，每只小鼠每种待收集的组织各使用一孔，并在每个待用孔中加入 4 毫升室温 DMEM。将收集的性腺脂肪组织放入六孔板中。从孔中取出组织，置于硅胶垫上，用剪刀将其切成5至7毫克的组织块。用洁净的毛巾吸干组织上的液体，去除任何培养基。然后为每个检测孔称取25至30毫克（相当于五到六个组织块）的组织，并将其放入先前准备好的48孔检测板中。取出组织后，称量称重船的重量，并记录残留物的重量。在样品之间用洁净的称量纸，并根据需要重新撕取。每份组织使用新的称量纸。所有组织样品称重完成后，将48孔检测板置于37摄氏度、10%二氧化碳的培养箱中孵育15分钟。在无菌通风橱中进行培养基收集。在零时间点，移除培养基后，每孔加入 400 微升对照或刺激性培养基，并将检测板置于 37 摄氏度、10% 二氧化碳的培养箱中。对于离体组织培养，使用移液器小心移除培养基，避免施加吸力。在1小时、2小时、3小时和4小时时间点，收集200微升培养基，补充200微升相应的对照或刺激培养基，并将检测板放回培养箱中。将收集的样品板置于4摄氏度保存。随后解冻并混匀样品。将试剂升温至室温，用一瓶溶剂A溶解一瓶显色试剂A，用一瓶溶剂B溶解一瓶显色试剂B。在建立游离脂肪酸（FFA）标准曲线后，将标准品和样品加入96孔检测板中。推荐每孔加样量为10微升。每孔加入150微升试剂A，混匀。将检测板在37摄氏度孵育5分钟。在550纳米和660纳米处读取检测板的吸光度，并将此记为读数A。向每孔中加入75微升试剂B并混匀。将检测板在37摄氏度孵育

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

测量体外分化的离体小鼠脂肪组织和原代前脂肪细胞的脂肪分解率

脂肪组织（AT）可影响机体全身的稳态，因此了解脂肪细胞分化与功能的分子机制具有重要意义。本文提供了一种实验方案，通过分析脂肪细胞的稳态、分化过程以及缺氧暴露（作为诱导脂肪细胞凋亡的模型），以深入理解这些生物学过程。...

通过分化与凋亡稳态调节成年生物体脂肪细胞数量的机制

本实验方案描述了测定正常饮食（NCD）或高脂饮食（HFD）±辣椒素喂养的野生型小鼠腹股沟脂肪垫基础状态及佛司可林刺激下脂解作用的方法。以甘油释放量作为脂解作用的指标，从腹股沟脂肪组织脂肪垫中进行测定。...

腹股沟脂肪垫中基础及佛司可林刺激脂解作用的测定

本文提供了三种简便且易于操作的检测方法，用于评估小鼠的脂质代谢。...

评估小鼠全身脂质处理能力

前脂肪细胞从小鼠肩胛间棕色脂肪组织的基质血管组分中分离获得，并分化为能够积累脂滴、表达分子标志物并呈现成熟棕色脂肪细胞线粒体形态的细胞。这些细胞进一步通过免疫荧光和透射电子显微镜进行分析。...

从新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管组分中分化与成像棕色脂肪细胞

本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

本文介绍了一种从人皮下脂肪组织中分离、培养和表型鉴定微血管内皮细胞（hSATMVECs）的实验方案。此外，还描述了一种hSATMVECs与脂肪细胞相互作用的实验模型。...

研究人类皮下脂肪组织中脂肪内皮细胞与脂肪细胞的相互作用

成熟脂肪细胞的尺寸和脆弱性限制了可用于其研究和分离的技术与工具。本文介绍了一种分离成熟小鼠脂肪细胞的方案，该方案可轻松适用于不同的脂肪组织库和小鼠饮食模型。...

从瘦型与肥胖型小鼠中分离和培养原代小鼠脂肪细胞

一个 离体 高脂饮食诱导脂肪组织炎症的小鼠模型

本实验方案描述了一种分离和培养小鼠耳蜗柯蒂器官（可选择性保留或去除螺旋缘和螺旋神经节神经元）的方法。我们还展示了通过电穿孔技术在柯蒂器官外植体中表达外源报告基因的方法。...

小鼠耳蜗柯蒂氏器的原代培养与质粒电穿孔转染

输卵管（FT）被认为是浆液性卵巢癌（SOC）的另一个起源部位。本方案描述了一种用于分离和培养输卵管上皮细胞的新型方法。 离体 输卵管上皮细胞的培养。该系统可重现 体内...

离体 原代人输卵管上皮细胞的培养

学习使用小鼠离体脂肪组织和原代前脂肪细胞测量脂肪分解率的方法。该方案采用连续采样和酶学检测技术，可精确比较基础与刺激条件下的脂解速率，为代谢疾病研究提供可靠的实验手段。

测量脂解速率离体小鼠脂肪组织及分化后的原代前脂肪细胞体外

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测量脂解速率 离体 小鼠脂肪组织及分化后的原代前脂肪细胞 体外

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