Name: EpCAM和细胞角蛋白在正常人和小鼠血液和骨髓中表达上皮细胞的证据 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 了解利用流式细胞术和免疫荧光显微镜技术从健康个体血液和骨髓中分离上皮细胞的可重复方法。该方法使用Krt1-14;mTmG转基因小鼠模型，为发育生物学和再生医学研究提供重要技术支持。

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Josh Monts，核心设施流式细胞仪技术员，Hormel 研究所
Todd Schuster，核心设施经理，Hormel 研究所
Derek Gordon，统计学家，罗格斯大学
我们感谢新墨西哥州圣达菲市Clarus Editorial Services的Karen Klein提供的编辑协助。
本工作部分得到了美国国立卫生研究院下属国立关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所颁发的R21 AR075281号基金以及明尼苏达大学研究、艺术与学术副校长办公室研究资助与奖励计划（提案号#324240）的支持。我们衷心感谢荷美尔研究所（The Hormel Institute）提供的支持。

所有动物实验方案均经明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）和联邦指南的要求。新鲜的人类血液和骨髓样本从商业来源购买。公司根据经批准的机构审查委员会（IRB）协议，从HIV、乙型肝炎、丙型肝炎病毒检测阴性且经过COVID-19筛查的供者采集样本。所有样本在运输前均已去标识化并匿名化处理。由于这些样本为商业获取，无需额外的IRB批准。
1. 溶液的配制
注意：所有溶液必须在生物安全柜内的无菌环境中配制。操作人血和骨髓样本时，需取得生物安全二级（BSL2）认证。
<ol>
	<li>通过向 500 mL 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中加入 1 mL 的庆大霉素和 5 mL 的胎牛血清（FBS），制备骨髓收获液。</li>
	<li>通过向 500 mL 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中加入 50 mL 的胎牛血清（FBS），制备染色缓冲液。</li>
	<li>将 10 mL 的 10x 裂解缓冲液与 90 mL 的无菌水混合，制备 1x 裂解缓冲液。</li>
</ol>
2. 准备超净台
<ol>
	<li>打开通风橱，运行数分钟以确保气流正常。</li>
	<li>准备好进行骨髓采集所需的所有材料。将这些物品放入通风橱内，并用70%乙醇喷洒，以维持无菌环境。每次将手伸入通风橱前，均需用乙醇喷洒双手。</li>
	<li>将已灭菌的托盘放入通风橱内，连同已灭菌的剪刀、组装好的手术刀、镊子以及弯头止血钳一起置于盛有70%乙醇的小杯中，以保持其无菌状态。</li>
	<li>向一支50 mL离心管中加入10 mL骨髓采集液，并标记为“四肢”。另取一支50 mL离心管标记为“骨髓”。</li>
	<li>用注射器抽取10 mL骨髓采集液，然后安装一支26 G针头。</li>
</ol>
3. 小鼠骨髓的采集
<ol>
	<li>使用 CO2 窒息法处死小鼠。通过检查心跳消失以及捏脚趾无反应来确认死亡。可采用颈椎脱位作为确保完全安乐死的辅助手段。</li>
	<li>将小鼠放入 500 mL 容器中，并加入足量碘液以覆盖小鼠一半身体。轻轻摇晃并旋转容器，确保充分浸润。用去离子水冲洗。再进行一次碘液清洗，随后按相同步骤进行两次 70% 乙醇清洗。</li>
	<li>将小鼠置于超净台内，仰面放置于托盘上。抓住后肢并向两侧拉开，直至感觉到“咔哒”声；此步骤旨在使后肢与脊柱分离。</li>
	<li>在小鼠腹股沟区域附近的皮肤上做一约 1 cm 的切口。将闭合的剪刀插入切口，然后在皮下张开剪刀，以分离皮肤与腹膜。</li>
	<li>围绕大腿部位环形剪开皮肤，再沿腿部向下剪开皮肤，以暴露肌肉和骨骼。</li>
	<li>在髋关节周围剪断以取下后肢，注意不要剪断股骨。将取下的肢体放入标记为“Limbs”的离心管中。当两条后肢均被取下后，将小鼠尸体放入尸体袋，并置于冰箱冷冻保存。 
	注意：切割前应先触摸到髋骨，以此引导剪刀方向，避免剪断股骨，因为大部分骨髓来源于股骨。</li>
	<li>使用剪刀沿其中一条肢体开始剪除肌肉、组织和脂肪，剪切方向应与骨骼平行。然后使用解剖刀，以垂直于骨骼的方向刮除残留的脂肪或肌肉组织。</li>
	<li>待骨骼彻底清理后，在膝关节处分离股骨与胫骨。使用解剖刀在股骨和胫骨两端无明显骨髓可见的部位进行切割。</li>
	<li>将准备好的注射器和针头插入骨骼中。若遇到阻力，可再剪去少许骨端，直至无阻力为止。
	<ol>
		<li>手持骨骼置于标记为“Bone Marrow”的离心管上方，将骨髓收获液通过骨骼推注，以冲洗骨髓进入离心管。在骨骼另一端重复此操作，以获取剩余骨髓，直至骨骼呈现全白色或空心状。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对所有剩余骨骼和肢体重复步骤 7–9；所有骨髓均冲洗至同一锥形离心管中。</li>
	<li>使用一个空的 10 mL 注射器和 20 G 针头，通过将骨髓在注射器内反复抽吸 5–10 次，以打散管中的骨髓团块。</li>
	<li>在洁净的 50 mL 离心管上安装无菌 40 µm 滤膜，并用 1 mL 骨髓收获液冲洗滤膜。随后将骨髓悬液过滤，以去除任何残留团块。将此离心管标记为“Filtered Bone Marrow”。</li>
	<li>将过滤后的骨髓置于冰箱冷藏或冰上保存，直至使用。应在收获当天使用。若当天未使用，应使用冷冻保护剂（如二甲基亚砜，DMSO）将细胞冷冻保存。 
	警告：实验产生的所有废弃物应妥善处置于生物危害废物容器中。所有锐器应放入贴有适当标签的生物危害锐器容器中。</li>
</ol>
4. 骨髓红细胞裂解
<ol>
	<li>将骨髓细胞在室温下以 170 × g 离心 10 分钟。吸除上清液并弃去。用 10 mL 1× 红细胞裂解缓冲液重悬细胞，孵育 4 分钟。</li>
	<li>加入 30 mL 达尔伯克氏磷酸盐缓冲液（DPBS）以终止裂解缓冲液的反应。在室温下以 170 × g 离心 8 分钟。吸除上清液并弃去。用 10–20 mL 染色缓冲液重悬细胞。</li>
</ol>
5. 细胞计数
<ol>
	<li>取 500 μl 细胞与 9.5 mL 骨髓采集液混合，制备成 1:20 的稀释液。 
	注意：此稀释液用于细胞计数，无需保持无菌。</li>
	<li>从 1:20 稀释液中吸取 200 µL 细胞，加入 200 µL 台盼蓝溶液中，并充分混匀。</li>
	<li>将混合液加入血细胞计数板，在两侧分别计数活细胞和死细胞。根据下表（见补充文件 1）及以下公式计算原始细胞悬液浓度： 
	每毫升细胞数： 
	<img alt="细胞计数公式；活细胞浓度计算；生物学实验方程。" src="/files/ftp_upload/65118/65118eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1"> 
	总细胞数： 
	<img alt="细胞总数计算公式；包含细胞浓度与体积分析变量的示意图。" src="/files/ftp_upload/65118/65118eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 2"></li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 170 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞，然后根据抗体稀释的厂家建议，重悬为每 1 mL 含 10 × 106 个细胞的浓度（即每 100 µL 含 1 × 106 个细胞）。</li>
	<li>进行流式细胞术分析（步骤 8）。</li>
</ol>
6. 小鼠血液采集
<ol>
	<li>使用 CO2 气体或颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>使用连接在涂有 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）的 1 mL 注射器上的 26 G 针头，以 45° 角进行心脏采血。</li>
	<li>离心血液并重悬于培养基或染色缓冲液中。 
	注意：在完成红细胞裂解和细胞计数后，细胞将被离心并重悬于染色缓冲液中至最终浓度。</li>
	<li>进行红细胞裂解（步骤 4）。</li>
	<li>进行细胞计数（步骤 5）。</li>
	<li>进行流式细胞术分析（步骤 8）。</li>
</ol>
7. 处理人血液和骨髓样本
<ol>
	<li>在穿戴个人防护装备的情况下，于BSL2认证的生物安全柜内进行所有操作。</li>
	<li>前一晚采集样本并进行红细胞裂解。确保样本在运输前已去标识化和匿名化，并将单个核细胞样本置于冰中过夜运送。</li>
	<li>样本到达后，在4 °C条件下以170 × g离心10分钟。 
	注意：这些为BSL2级别样本，必须遵循当地相关操作规范。</li>
	<li>用培养基或染色缓冲液重悬细胞。 
	注意：细胞计数后，应使用染色缓冲液将细胞离心并重悬至最终浓度。</li>
	<li>进行细胞计数（步骤5）。</li>
	<li>进行流式细胞术分析（步骤8）。</li>
</ol>
8. 流式细胞术
<ol>
	<li>染色
	<ol>
		<li>根据所使用的染色方案，将细胞分装至分别标记的离心管中，包括补偿对照（未染色对照、同型对照、单染对照以及荧光减一对照[FMOs]）。剩余细胞可冷冻保存或用于荧光激活细胞分选。染色方案示例及所用抗体稀释比例见表1。 
		注意：每新增一种荧光染料，必须添加该荧光染料单独染色的对照，以及与其他现有荧光染料组合的FMO对照。同型对照可用于阻断非特异性染色。每种新使用的抗体均应通过样品滴定以确定最佳稀释比例。</li>
		<li>按照生产商推荐的稀释比例加入抗体，并通过轻弹管底充分混匀。抗体浓度通常以每100 µL溶液含1 × 106个细胞为标准。抗体及对照的稀释方案见表1。抗体偶联有荧光染料，需避光保存。 
		注意：建议使用偶联藻红蛋白（PE）的EpCAM抗体，以便检测低丰度细胞群（如表1所示，每百万细胞滴定使用3–5 µL）。PE-CD49f用作单染PE对照（每百万细胞20 µL），因为该细胞群比PE-EpCAM更丰富，更易于用于补偿调节。</li>
		<li>在4 °C避光孵育30分钟。</li>
		<li>孵育结束后，将离心管转移回BSL2生物安全柜，向每管中加入1 mL染色缓冲液。</li>
		<li>随后，在4 °C下以170 × g离心5–10分钟。</li>
		<li>离心后，将盖好盖子的细胞管转移回BSL2生物安全柜，吸除上清液。每次更换离心管时务必更换移液器吸头，以防交叉污染。</li>
		<li>用1 mL染色缓冲液重悬细胞沉淀，并轻弹管底混匀。</li>
		<li>重复步骤8.1.4–8.1.7，再洗涤细胞两次。 
		注意：重悬时请勿使用移液器吹打，以免造成细胞损失。</li>
		<li>流式细胞术检测前，最终用500 µL染色缓冲液重悬细胞。根据生产商建议加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或死细胞鉴别染料。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞仪
	<ol>
		<li>仪器设置完成后，使用对照样本和FMO样本设定补偿和门控参数。使用Hank's平衡盐溶液（HBSS）作为鞘液，以维持脆弱细胞的活性；若无HBSS，可使用PBS替代。 
		注意：材料表中列出了所用流式细胞仪型号及分析软件。</li>
		<li>依次加载样本，分别采集50,000、100,000、500,000和一百万个事件的数据。样本管在使用前应始终置于冰上或冷藏保存。 
		注意：采集时可设定时间限制，以确保样本活性。</li>
		<li>将细胞收集至含10% FBS的3 mL RPMI培养基中，使用15 mL离心管。</li>
		<li>若需对EpCAM+细胞进行免疫荧光染色，可使用流式细胞仪将800至1,000个细胞分选至8孔玻片的每个孔中。</li>
		<li>将EpCAM-细胞群分选至单独的玻片上，作为免疫荧光染色时的阴性对照。 
		注意：也可将细胞分选至含FBS的15 mL离心管中，再通过细胞离心涂片机或移液器将细胞沉积到玻片上，防止细胞破裂。</li>
		<li>用50%甲醇/50%丙酮混合液在-20 °C固定玻片10分钟。免疫荧光染色前，将玻片保存在-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术分析
	<ol>
		<li>打开已授权的流式细胞术分析软件。</li>
		<li>加载从流式细胞仪获取的含对照和样本的流式细胞术标准（FCS）文件。</li>
		<li>点击创建组，使用关键词将样本和对照归入同一组。 
		注意：在流式细胞术分析软件中使用“未染色对照”进行门控，如图3所示。</li>
		<li>双击未染色对照样本，打开未设门的散点图。</li>
		<li>将图的Y轴设为SSC-A，X轴设为FSC-A（侧向散射面积对前向散射面积），以反映细胞大小和内部复杂性。</li>
		<li>点击左上方面板中的多边形工具，在细胞群周围绘制门控区域。注意排除边缘细胞，因其多为碎片。将此门命名为“细胞”，如图3A所示。</li>
		<li>完成细胞门控后，双击多边形区域内任意位置，在新窗口中打开另一张图。</li>
		<li>将新图的Y轴设为SSC-A，X轴设为SSC-W，用于区分单细胞与双联体。点击多边形工具，在单细胞区域绘制矩形门控。将此门命名为“单细胞”，如图3B所示。</li>
		<li>完成单细胞门控后，双击多边形区域内任意位置，在新窗口中打开另一张图。</li>
		<li>将Y轴设为FSC-A，X轴设为DAPI-A（或所用的其他死细胞鉴别染料信号）。</li>
		<li>在图左侧DAPI阴性细胞周围绘制多边形门控区域。将此门命名为“活细胞”，如图3C所示。</li>
		<li>完成活细胞门控后，双击多边形区域内任意位置，在新窗口中打开另一张图。</li>
		<li>将Y轴设为SSC-A，X轴设为EpCAM-PE（或用于识别EpCAM细胞的其他荧光染料）。图左侧细胞为EpCAM阴性；若右侧出现细胞，则为EpCAM阳性。</li>
		<li>利用EpCAM-PE图绘制多边形门控，排除左侧细胞，仅包含右侧空白区域。将多边形内右侧空白区域标记为“EpCAM”，如图3D所示。 
		注意：此为未染色对照，理论上不应出现EpCAM表达。应利用该对照确定哪些细胞为EpCAM阳性。至此，补偿门控策略已完成，所有图形可关闭。</li>
		<li>在工作区页面中，选中“细胞”、“单细胞”、“活细胞”和“EpCAM”组成的未染色对照门控路径，右键选择复制分析至组。此操作将门控策略复制至此前创建组内的所有其他样本。若最初未创建组，可点击左上角的创建组进行创建。</li>
		<li>逐一检查组内各样本，确认先前绘制的多边形门控是否适用于所有样本和对照。此步骤可获得细胞百分比及细胞数量。</li>
		<li>点击“工作区”上方左上角的布局编辑器按钮L，随后可通过布局编辑器对图形进行排列和导出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光试剂准备
	<ol>
		<li>通过混合1 g牛血清白蛋白（BSA）、2 g脱脂奶粉、10 mL 10x Tris缓冲盐溶液（TBS）、100 µL Tween和90 mL蒸馏水，配制抗体稀释液。</li>
		<li>通过混合50 mL 20x TBS、950 mL蒸馏水和200 µL Tween，配制TBST溶液。</li>
		<li>将1 mL正常马血清（NHS）与9 mL抗体稀释液（步骤8.4.1）混合，配制10% NHS溶液。</li>
		<li>将1 mL 10% NHS溶液与9 mL TBST混合，配制1% NHS溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光染色
	<ol>
		<li>从-20 °C取出玻片，使其恢复至室温。</li>
		<li>用蒸馏水洗涤玻片三次，每次5分钟。</li>
		<li>在含10% NHS的抗体稀释液（步骤8.4.3）中，室温封闭1小时。</li>
		<li>将一抗（广谱细胞角蛋白抗体）用含1% NHS的TBST溶液（步骤8.4.4）按1:750比例稀释。将玻片置于稀释后的一抗中，4 °C孵育过夜。</li>
		<li>次日，用1x洗涤缓冲液（PBS或TBST）洗涤玻片三次，每次5分钟。</li>
		<li>将二抗用含1% NHS的TBST溶液（步骤8.4.4）按1:1,000比例稀释。将玻片置于稀释后的二抗中，室温孵育1小时。</li>
		<li>用1x洗涤缓冲液洗涤玻片三次，每次5分钟。使用含DAPI的硬封片剂封片。用棉签轻轻滚动盖玻片，排出下方气泡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

不存在已知的利益冲突。

文献中有一些证据表明骨髓中存在上皮细胞。以往的研究通常在疾病和损伤的背景下探讨上皮细胞的作用，例如在肝脏、肺、胃肠道（GI）道、胸腺和皮肤中的作用14,15,16,17。然而，关于健康个体骨髓中这些上皮细胞的存在情况，目前了解甚少。本文旨在建立一种可重复的方法，用于识别和分离正常血液与骨髓中的上皮细胞。该方法将推动该领域进一步明确：在无疾病状态下，上皮细胞为何存在于血液和骨髓中，以及它们发挥何种作用；这些细胞可能参与正常组织的维持，或在损伤时被激活。骨髓是干细胞的储存库；然而，这些上皮细胞的谱系尚不明确。最近一篇论文讨论了胸腺中来源于骨髓的上皮细胞，这些细胞最初表达EpCAM和造血标志物CD45，但在损伤后随着时间推移逐渐失去CD45的表达15。我们实验室的研究也证实，在无损伤的情况下，健康个体的血液和骨髓中存在CD45+ EpCAM+细胞12。然而，这些细胞的具体功能仍有待确定。
需要一种可重复的方法来检测健康骨髓中的上皮细胞。所描述的方法将有助于进一步表征这些细胞在正常状态下的特征。该方法中有若干关键步骤以确保可重复性。其中最关键的步骤之一是在从鼠类采集骨髓时，维持超净台内的无菌环境。若从多只小鼠采集样本，应为每只小鼠更换新的针头和注射器，以避免样本间的交叉污染。这也能确保样本清洁，不含可能影响实验结果的任何污染物。此外，每增加一只小鼠，应相应增加准备好的注射器数量以及标记好的锥形管数量。另一个重要步骤是冲洗骨骼，直至骨骼呈现干净的白色，以确保绝大多数骨髓细胞已被清除；在更纯净的样本中，检测到稀有细胞的概率更高。本研究对红细胞裂解步骤进行了优化：测试了多种裂解缓冲液，以筛选出能够持续保持高细胞活力的试剂，因为在原有步骤中几乎有一半的细胞会在此过程中丢失。在其他实验条件下，可能需要对不同的试剂和孵育时间进行优化，以获得更佳结果。
该方案最主要的局限性在于使用流式细胞术检测稀有细胞群。如前所述，加入对照样本并逐步增加计数有助于提高分析的特异性和准确性。另一局限性是必须预先确定目标细胞群的合适标记物。因此，需要事先了解关键标记物、适用于流式细胞术的抗体，以及与目标物种相容的抗体。
这些方法相较于现有技术具有改进之处，因其能够在单细胞水平进行分析，且成本仅为现有自动CTC分离仪和单细胞RNA测序技术的一小部分。此外，流式细胞术更易于获得。与先前报道的磁珠分离方法相比，FACS能保持更高的细胞存活率。最后，这些技术能够实现细胞的分离，以便进行后续分析，如批量RNA测序、单细胞RNA测序或细胞培养。

上皮细胞存在于人体与外界环境之间的物理屏障中，能够识别并响应其微环境的变化1。这些细胞具有可增殖的干细胞生态位，能够更新组织并修复损伤2。本实验室研究皮肤毛囊中的干细胞；皮肤是研究上皮组织和干细胞增殖的理想模型，因其易于观察且细胞持续更新。上皮性癌症是最常见的癌症类型，可能是因为皮肤等上皮组织作为抵御环境致癌物的第一道防线，导致细胞更新速率高、上皮细胞增殖频繁3。皮肤表皮（最外层保护结构）主要由角质形成细胞构成，这些细胞表达不同类型的角蛋白，以提供结构支持4。上皮性癌症患者常在其血液和骨髓中出现表达角蛋白的上皮细胞。液体活检是一种非侵入性方法，可用于检测和监测不同体液中的这些上皮细胞5。循环中的上皮细胞，也称为循环肿瘤细胞（CTCs），存在于外周血中，可作为癌症预后的生物标志物，并指导个体化治疗方案。CTCs 还可用于评估疾病进展、治疗效果以及患者的总体生存情况5,6。
上皮细胞黏附分子（EpCAM）是临床用于循环肿瘤细胞（CTCs）的标志物，可识别癌症患者中来源于上皮组织的肿瘤。EpCAM 在细胞黏附、迁移、信号传导、增殖和分化中发挥重要作用。6要将循环上皮细胞归类为循环肿瘤细胞（CTC），该细胞必须表达细胞角蛋白8、18和19，且不表达白细胞共同标记物CD45。6循环肿瘤细胞通常通过先使用磁性微珠耗尽CD45，再利用免疫荧光显微镜检测EpCAM和细胞角蛋白19来进行鉴定。7检测CTCs的主要局限在于其稀有性；CTCs占血液中所有细胞的比例不足0.01%。&#160;仅有极少数能在循环中存活并到达远端器官8,9,10在设计用于分离和鉴定这些稀有细胞的实验与技术时，必须充分考虑其稀有性。目前，仅有一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的自动化单细胞分选仪用于循环肿瘤细胞（CTCs）的鉴定，该仪器以EpCAM作为生物标志物。其他方法包括磁珠分离法、流式细胞术，或上述方法的联合使用。目前亟需开发具有更高灵敏度和特异性的新技术，以实现对稀有CTCs的高效检测11.
流式细胞术是检测血液、骨髓及其他组织样本中稀有细胞群体的首选方法。这些稀有细胞可能包括干细胞、循环内皮细胞、循环肿瘤细胞（CTCs）以及残留病灶细胞。流式细胞术能够对每种细胞类型进行定量测量，并分选这些细胞以供进一步检测7,9。通过增量计数来确保对这些稀有细胞的准确评估。利用设门（gating）策略排除特定细胞进入后续分析，可提高细胞分析的特异性。流式细胞术的局限性在于分析大样本所需的时间较长，且无法对细胞身份提供直观的形态学确认。为克服这一局限，对分选后的细胞进行了免疫荧光显微镜检测，以确认其细胞身份。
此前，本实验室已证实，在小鼠中，骨髓细胞会被招募并参与皮肤肿瘤的形成12。这些来源于骨髓的细胞对广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin）和表皮细胞角蛋白呈阳性。为了进一步阐明上皮干细胞、骨髓来源细胞以及表达细胞角蛋白的细胞在肿瘤进展中的作用，我们检测了正常小鼠和人血液及骨髓样本中EpCAM+的细胞角蛋白阳性细胞。与大多数实验一样，该方法经过多次迭代优化而建立。此前，我们曾利用转基因小鼠并结合逐步计数的方法，检测骨髓中表达K14GFP的细胞12。随着计数细胞数量的增加，最终能够识别出稀有细胞的代表性群体，如代表性结果部分的图1所示。之所以在正常血液和骨髓中探究上皮细胞，其依据来自关于循环肿瘤细胞（CTC）的早期文献，其中显示正常健康供者体内存在背景水平的EpCAM+细胞13。如前所述，EpCAM的表征通常以CD45的去除作为起始步骤。但本研究省略了该步骤，因为某些造血细胞出于尚不明确的原因会表达EpCAM和细胞角蛋白，需进一步研究。因此，细胞根据是否表达EpCAM进行分选，而不考虑其细胞谱系，随后进行细胞角蛋白的免疫染色。下述方案及图2所示工作流程描述了一种技术，该技术结合流式细胞术（含补偿和对照设置）、统计学方法以及免疫荧光成像，用于分离和鉴定这些稀有的上皮细胞群体。

<table><tbody><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>用于过滤骨髓中的大块细胞团块</td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td>用于流式细胞术的试管</td></tr><tr><td>500 mL 带盖广口瓶</td><td>Nalgene</td><td>11-823-32</td><td>用于清洗小鼠</td></tr><tr><td>190 proof 乙醇</td><td>Decon laboratories Inc</td><td>2801</td><td>用去离子水稀释至 70%</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>稀释比例：1:1000</td></tr><tr><td>Brightline 血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-10</td><td>用于计数活细胞</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td>抗体稀释液的组分</td></tr><tr><td>经鉴定的胎牛血清 (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>染色缓冲液和收获液的组分</td></tr><tr><td>Curity 纱布海绵</td><td>Covidien</td><td>2187</td><td>用于在收获四肢和骨髓时保持操作区域清洁</td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Miltex</td><td>18-784</td><td>收获过程中使用</td></tr><tr><td>广谱细胞角蛋白抗体</td><td>Dako</td><td>Z0622</td><td>稀释比例：1:750 *现已停产</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS 1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144 500mL</td><td>用于终止红细胞裂解反应</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td>使用浓度为 0.5 M&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td>收获液的组分</td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液 (HBSS 1x)</td><td>Gibco</td><td>14175-095 500mL</td><td>收获液和染色缓冲液的组分</td></tr><tr><td>Luer-Lok 接头 10 mL 注射器</td><td>Becton, Dickinson and Co</td><td>309604</td><td>配合 26G 针头用于冲洗骨骼，配合 20G 针头用于打散细胞团块</td></tr><tr><td>Magic touch 2 冰桶</td><td>BelArt</td><td>M16807-2001</td><td>用于将样本置于冰上保存</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Apex</td><td>20-241</td><td>抗体稀释液的组分</td></tr><tr><td>正常马血清</td><td>Vector</td><td>ZE0122</td><td>抗体稀释液的组分</td></tr><tr><td>PE 抗人 CD326 (EpCAM)</td><td>Biolegend</td><td>324206</td><td>稀释比例：每 1×10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞使用 5 &amp;micro;l 至 100 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>PE 抗小鼠 CD326 (EpCAM)</td><td>Biolegend</td><td>118205</td><td>稀释比例：每 1×10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞使用 3 &amp;micro;l 至 100 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>PE 小鼠 IgG2b, &amp;kappa; 同型对照</td><td>Biolegend</td><td>400313</td><td>稀释比例：每 1×10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞使用 1 &amp;micro;l 至 100 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>PE 大鼠抗人 CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>555763</td><td>稀释比例：每 1×10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞使用 20 &amp;micro;l 至 100 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>PE 大鼠 IgG2am, &amp;kappa; 同型对照</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td>稀释比例：每 1×10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞使用 1 &amp;micro;l 至 100 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯锥形离心管</td><td>Basix</td><td>14-955-240</td><td>用于离心机操作</td></tr><tr><td>聚维酮碘消毒液</td><td>Aplicare</td><td>82-227</td><td>用于小鼠消毒的抗菌剂</td></tr><tr><td>PrecisionGlide 20G × 1 1/2 针头</td><td>Becton, Dickinson and Co</td><td>305176</td><td>20G 针头用于打散骨髓细胞团块</td></tr><tr><td>PrecisionGlide 26G × 1/2 针头</td><td>Becton, Dickinson and Co</td><td>305111</td><td>26G 针头用于从骨骼中冲洗骨髓</td></tr><tr><td>PTFE 印刷载玻片</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>63422-06</td><td>8 孔载玻片，用于免疫荧光分选细胞</td></tr><tr><td>RBC 裂解缓冲液 10X</td><td>Invitrogen</td><td>00-4300-54</td><td>使用无菌去离子水按 1:10 稀释</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Roboz</td><td>RS-6762</td><td>收获过程中使用</td></tr><tr><td>不锈钢手术刀片 #4</td><td>Bard-Parker</td><td>371222</td><td>收获过程中使用</td></tr><tr><td>无菌托盘</td><td>Polar ware</td><td>10F</td><td>收获过程中使用</td></tr><tr><td>StretchEase 无粉腈检查手套</td><td>Denville Scientific</td><td>G4161</td><td>收获过程中使用</td></tr><tr><td>手术刀柄 #4</td><td>Fischer</td><td>12-000-164</td><td>与手术刀片配合使用</td></tr><tr><td>TBS 20x</td><td>Thermo</td><td></td><td>TBST 的组分，使用时稀释为 1X</td></tr><tr><td>台盼蓝染色液 (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>用于计数死细胞。使用 0.45 &amp;micro;m 滤膜过滤</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500mL</td><td>TBST 的组分</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Miltex</td><td>6-8</td><td>收获过程中使用</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Vectashield Vibrance 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector</td><td>H-1800</td><td>免疫荧光中的核染色剂</td></tr></tbody></table>

正常人及小鼠血液和骨髓中表达epcam和细胞角蛋白的上皮细胞的证据

Evidence for EpCAM and Cytokeratin Expressing Epithelial Cells in Normal Human and Murine Blood and Bone Marrow

已发现在癌症及其他疾病患者的血液和骨髓中存在上皮细胞。然而，在健康个体的血液和骨髓中是否存在正常的上皮细胞，目前尚未得到一致性的确认。本文介绍一种可重复的方法，利用流式细胞术和免疫荧光（IF）显微镜技术，从健康人及小鼠的血液和骨髓（BM）中分离上皮细胞。在健康个体中，上皮细胞首次被鉴定并分离 通过 使用上皮细胞黏附分子（EpCAM）进行流式细胞术分析。在Krt1-14;mTmG转基因小鼠中，通过免疫荧光显微镜确认这些EpCAM+细胞表达角蛋白。人血液样本中EpCAM+细胞占0.18% ± 0.0004（SEM；n=7个生物学重复，4个实验重复）。在人骨髓中，单个核细胞中有3.53% ± 0.006（SEM；n=3个生物学重复，4个实验重复）为EpCAM+。在小鼠血液中，EpCAM+细胞占0.45% ± 0.0006（SEM；n=2个生物学重复，4个实验重复）；在小鼠骨髓中，EpCAM+细胞占5.17% ± 0.001（SEM；n=3个生物学重复，4个实验重复）。在小鼠中，所有EpCAM+细胞均对广谱细胞角蛋白呈免疫反应阳性，由免疫荧光显微镜测定确认。结果通过Krt1-14;mTmG转基因小鼠实验得到验证，其中检测到较低水平（每10万个细胞中8.6个天然GFP+细胞）6 分析的细胞；占活细胞的0.085%），但数量显著（p &#60; 在正常小鼠骨髓中，GFP+细胞的比例具有统计学意义（P=0.0005），且该结果并非随机性所致，相较于多个阴性对照组差异显著。此外，小鼠血液中的EpCAM+细胞比CD45+细胞更具异质性（骨髓中占0.58%；血液中占0.13%）。这些结果表明，在人和小鼠的血液及骨髓单个核细胞中，表达细胞角蛋白的细胞可被重复检测到。我们展示了一种组织采集、流式细胞术和免疫染色的方法，可用于识别健康个体中这些广谱细胞角蛋白阳性上皮细胞并确定其功能。

利用这些方法，可在正常人和小鼠的血液及骨髓中观察到稀有的上皮细胞群体。在采用适当补偿和对照的情况下，结果一致显示，无论计数细胞数量多少，小鼠骨髓中约有4%–5%的细胞为EpCAM+，如图所示 图4 和 图5在小鼠血液样本中，EpCAM+ 细胞比例低于 0.5%，如图所示 图6在人骨髓样本中，2%–5%的细胞为EpCAM阳性，如图所示 图7 和 图8尽管2%到5%是一个较大的范围，但在逐次增加细胞计数时，每个个体供体内的百分比保持一致。在人血液样本中，约0.3%的细胞为EpCAM+，如图所示。 图9我们的对照样本（无染色、同型对照和FMOs）产生的假阳性EpCAM+结果极少，如图所示 图4 和 图7EpCAM+ 和 EpCAM- 分选至载玻片的细胞中，EpCAM+ 样本显示泛细胞角蛋白染色阳性，而 EpCAM- 样本显示泛细胞角蛋白染色阴性，如图所示 图10这些结果表明，实验设计合理且具有可重复性。
<img alt="显示按分选细胞数量统计的GFP阳性细胞数的柱状图；K14Cre对照组与K14Cre/mTmG杂合子对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：Krt14Cre;mTmG转基因小鼠骨髓细胞计数逐步增加的结果。 对Krt14;mTmG小鼠的骨髓细胞进行逐步计数。GFP阳性细胞表示角蛋白14的表达，通过流式细胞术进行鉴定。随着计数的骨髓细胞数量增加，该角蛋白14阳性细胞群更易于被识别。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血液和骨髓分选FACS示意图，EpCAM+/-细胞涂片，细胞角蛋白免疫荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：EpCAM+ 和细胞角蛋白+ 细胞的工作流程。 首先使用荧光激活细胞分选（FACS）对骨髓和血液细胞进行分选，以分离 EpCAM+ 和 EpCAM- 细胞。这些细胞被分选至两个不同的试管中，同时分别涂布到两张不同的载玻片上。分选到试管中的细胞通过细胞离心机沉积到载玻片上。随后，载玻片使用广谱细胞角蛋白一抗进行染色，再用二抗进行染色。最后通过荧光显微镜分析载玻片，观察广谱细胞角蛋白的表达情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析、散点图、细胞群设门、荧光强度比较、数据过滤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：流式细胞术分析软件。 使用分析软件分析流式细胞术数据时，需利用未染色对照来选择目标细胞。首先通过SSC-A和FSC-A对细胞进行筛选，二者分别反映细胞的内部复杂性和细胞大小。(A) 在细胞周围绘制多边形门。(B) 通过SSC-A与SSC-W设门获取单细胞。(C) 通过FSC-A与DAPI的对比设门获取活细胞。(D) 通过将EpCAM阴性细胞右侧设门，排除EpCAM阴性细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析、EpCAM表达、散点图、未染色对照与对照比较、细胞定量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：小鼠骨髓中EpCAM+细胞的流式细胞术分析。 上图显示了未染色对照、同型对照和荧光减一对照（FMO），下图展示了细胞计数分别为50,000、100,000和500,000时的结果。这些图表显示，尽管总细胞计数总体增加，但各组百分比保持一致。右侧图示为设门策略，该策略在流式细胞术分析部分已作前述，并如图3所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠骨髓细胞中不同染色方法下EPCAM表达的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：小鼠骨髓中的EpCAM+细胞占细胞群体的5.17% ± 0.001%。对三只独立小鼠的骨髓细胞进行了分析。实验中包含了适当的对照，以确保科学严谨性。由于小鼠基因型相同，各样本间阳性细胞的比例保持一致。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术结果；柱状图显示 EpCAM+ 细胞占计数的小鼠全血细胞的比例。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：小鼠血液中的 EpCAM+ 细胞占细胞总数的 0.45% ± 0.0006%。 对两只独立小鼠的血细胞进行了分析。实验包含对照组，以证明操作流程正确，可得出明确结果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图谱，PE-EpCAM染色，对照组与不同细胞计数的比较，数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图7：EpCAM+人骨髓的流式细胞术分析。 上图显示了未染色对照、同型对照和荧光减一对照（FMO），下图显示了50,000、100,000和500,000个细胞的递增计数。这些图表显示，尽管总细胞计数总体增加，但各组百分比保持一致。右侧图示为门控策略，该策略此前已在流式细胞术分析部分讨论，并如图3所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术柱状图；不同染色方法下人骨髓中EpCAM+细胞的计数。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 8"> 
图8：人骨髓中的EpCAM+细胞占细胞群体的3.53% ± 0.006%。 分析了三个不同的人骨髓样本，并包含了适当的科学对照。由于人类之间的遗传异质性，阳性细胞的比例存在差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同染色方法下人血中EPCAM阳性细胞计数的柱状图，共三个样本。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图9"> 
图9：人血中的EpCAM+细胞占细胞总数的0.18% ± 0.0004%。 分析了三个不同的人血样本，并包含了适当的科学对照。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜：DAPI 和广谱细胞角蛋白染色、细胞鉴定与比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65118/65118fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图10"> 
图10：EpCAM+ 和 EpCAM- 载玻片的免疫荧光染色。 采用流式细胞术（FACS）分离 EpCAM+ 和 EpCAM- 细胞。使用 DAKO 广谱细胞角蛋白抗体对广谱细胞角蛋白进行染色。由于广谱细胞角蛋白抗体为多克隆抗体，阴性对照使用正常血清且不加一抗。这些结果验证了流式细胞术分选的准确性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/65118fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">人骨髓或血液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗体</td>
			<td>管编号</td>
			<td>细胞数量</td>
			<td>抗体浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未染色</td>
			<td>1</td>
			<td>1x106</td>
			<td>X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>仅DAPI</td>
			<td>2</td>
			<td>1x106</td>
			<td>1uL/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE同型对照</td>
			<td>3</td>
			<td>1x106</td>
			<td>1 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49f-PE单染对照</td>
			<td>4</td>
			<td>1x106</td>
			<td>20 uL in 100uL per 1x106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM-PE低滴度</td>
			<td>5</td>
			<td>1x106</td>
			<td>3 uL in 100uL per 1x106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM-PE中滴度</td>
			<td>6</td>
			<td>1x106</td>
			<td>4 uL in 100uL per 1x106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM-PE高滴度</td>
			<td>7</td>
			<td>1x106</td>
			<td>5 uL in 100uL per 1x106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM-PE高滴度用于载片分选</td>
			<td>8</td>
			<td>10x106</td>
			<td>50 uL in 1 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：流式细胞术染色方案。 血液或骨髓单个核细胞流式细胞术染色方案示例。所包含的对照有仅DAPI、未染色对照和PE单染对照（使用PE-CD49f作为更佳的阳性对照）。由于本方案仅使用单一荧光素（PE），因此未包含荧光减一（FMO）对照。当增加更多荧光素颜色时，例如异硫氰酸荧光素（FITC）或别藻蓝蛋白（APC），应为每种FMO对照分别排除一种荧光素。
补充文件 1：使用血细胞计数板进行活细胞计数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65118/Suppli-1_65118.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件</a>

本文通过流式细胞术和免疫荧光显微镜技术，报道了一种可重复的方法，并揭示了上皮细胞存在于正常人和小鼠血液及骨髓中的新发现。实验采用Krt1-14;mTmG转基因小鼠作为研究模型 体内 验证这些发现的方法。

正常人及小鼠血液和骨髓中表达EpCAM和细胞角蛋白的上皮细胞的证据

上皮细胞已在癌症及其他疾病患者的血液和骨髓中被发现。然而，正常上皮细胞的存在……

该技术展示了一种可重复的方法，用于分离健康个体血液和骨髓中所含的上皮细胞，以便进行后续深入分析。由于流式细胞术具有较高的可及性，该方法的成本仅为自动循环肿瘤细胞分离技术的一小部分。该方法在发育生物学、干细胞生物学及再生治疗领域具有潜在应用价值。它还可用于研究上皮组织中的伤口愈合和组织维持。骨骼非常细小且脆弱，操作时需小心谨慎，以防折断或丢失骨骼。骨髓相对稳定，因此可以缓慢而仔细地操作，以确保正确获取。首先，将小鼠放入一个500毫升的容器中，并加入足量的碘，使其覆盖小鼠的一半。轻轻摇动并旋转容器，以确保充分覆盖。然后用去离子水冲洗。再进行一次碘伏清洗，随后用70%乙醇清洗两次。将小鼠置于生物安全柜中，仰面放置于托盘上。抓住后肢并将其拉开，直至感觉到弹响。在小鼠腹股沟区域附近的皮肤上做一个一厘米长的切口。将闭合的一把剪刀插入切口中，并在皮下打开剪刀，以分离皮肤与腹膜。围绕大腿部位的腿部皮肤进行环形剪开，然后沿腿部向下剪开皮肤，以暴露肌肉和骨骼。在剪切后肢之前，应触诊髋骨以准确定位剪刀，避免剪到股骨，因为大部分骨髓位于股骨中。随后在不切断股骨的前提下，围绕髋关节剪下后肢。将肢端放入标记为“肢端”的离心管中。接下来，使用剪刀沿骨骼平行方向剪除其中一条肢体上的肌肉、组织和脂肪。然后用手术刀垂直于骨骼进行刮擦动作，仔细去除残留的脂肪或肌肉。彻底清理骨骼后，在膝关节处分离股骨和胫骨。然后使用解剖刀在股骨和胫骨两端无可见骨髓的部位进行切割。将预先准备好的注射器和针头插入骨骼中。如果遇到阻力，修剪骨端直至不再有阻力为止。牢固握住标有“骨髓”的试管上方的骨骼，将骨髓采集液注入骨骼中。随后将骨髓冲洗至试管内。对骨骼的另一端重复此操作，以收集剩余的骨髓，直至骨骼呈现完全白色或空虚状。使用一个10毫升的空注射器和20G针头，通过将骨髓在注射器内反复抽吸5到10次，使管中的骨髓团块分散。将一个40微米滤器置于一个干净的50毫升离心管上，并用1毫升骨髓采集液冲洗滤器。将骨髓通过滤器过滤，以去除任何残留的团块。然后标记过滤后的骨髓样本。将过滤后的骨髓置于冰箱中或冰上保存，并于当日使用。在室温下以170×g离心骨髓细胞10分钟。离心并弃去上清液。用10毫升1×红细胞裂解缓冲液重悬细胞，孵育4分钟。然后加入30毫升杜氏磷酸盐缓冲液以终止裂解缓冲液的反应。在室温下以170G离心8分钟。弃去上清液，并用10至20毫升染色缓冲液重悬细胞。首先，根据所使用的染色面板（包括补偿对照）将细胞分装至各自标记的试管中。制备未染色对照和同位素对照，以阻断非特异性染色。针对每种荧光染料，加入单染对照，并结合其余荧光染料加入减去一种荧光染料（fluorescence minus one）的对照。接着，根据推荐稀释比例加入抗体，并通过轻弹管底充分混匀。建议使用与藻红蛋白偶联的EpCAM来检测少量细胞群体。在4°C避光孵育30分钟。孵育结束后，将试管转移至生物安全二级柜，向每根试管中加入1毫升染色缓冲液。然后在4°C条件下以170 × g离心5到10分钟。离心后，将带盖的试管转移至生物安全二级操作台，吸除上清液。用1毫升染色缓冲液重悬细胞沉淀，并轻轻弹击管底以混匀。再重复洗涤和离心两次。最后，在流式细胞术前将样本重悬于 500 µL 染色缓冲液中。根据制造商的建议加入 DAPI 或死细胞鉴别染料。通过该方案，可在小鼠骨髓中观察到稀有的上皮细胞群体。无论计数的细胞数量如何，小鼠骨髓中约有4%至5%的细胞为EpCAM阳性。在人骨髓样本中，约有2%至5%的细胞为EpCAM阳性。此外，随着计数细胞数量的逐步增加，每个单独供体内的细胞百分比保持一致。在小鼠血液样本中，EpCAM 阳性细胞比例低于 0.5%；而在人血液样本中，该比例约为 0.3%。对照样品中假阳性的EpCAM阳性细胞极少。此外，分选到EpCAM阳性组的细胞显示出泛细胞角蛋白染色阳性，而EpCAM阴性组的细胞则未显示细胞角蛋白信号。保持环境清洁无菌至关重要，这将防止样本受到任何污染。可对分离得到的上皮细胞采用多种下游应用以确定其功能。这些包括RNA测序、体内细胞培养实验以及免疫荧光显微镜技术。

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EpCAM和细胞角蛋白在正常人和小鼠血液和骨髓中表达上皮细胞的证据

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识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

我们描述了制备小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液以及对细胞内分子进行染色以用于流式细胞术分析的实验方案。...

小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液的制备及细胞内分子染色用于流式细胞术分析

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