Name: 芳香族氨基酸调控细胞代谢的生物正交化学成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 了解一种结合受激拉曼散射与双光子荧光显微镜的无标记成像技术，用于可视化活细胞中亚细胞水平的代谢活动。该方法可高特异性地研究芳香族氨基酸调控的脂质与蛋白质合成过程。

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感谢李雅娟博士和Anthony Fung提供的技术支持，以及Fraley实验室提供的细胞系。本研究得到了加州大学圣地亚哥分校（UCSD）的启动资金、美国国立卫生研究院（NIH）U54CA132378、NIH 5R01NS111039、NIH R21NS125395、NIHU54DK134301、NIHU54 HL165443以及Hellman Fellow奖的支持。

1. 培养基制备
<ol>
	<li>在含有50% D2O的杜贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中制备10 mL的对照组和过量芳香族氨基酸（AAAs）溶液。
	<ol>
		<li>对于对照培养基，取10 mg DMEM粉末与4.7 mL双蒸水（ddH2O）在15 mL锥形管中混合。DMEM粉末含有标准浓度的所有氨基酸。充分涡旋并颠倒混匀，确保溶液均匀。加入4.7 mL D2O、0.5 mL胎牛血清（5% FBS）和0.1 mL青霉素/链霉素（1%），再次充分涡旋并颠倒混匀，确保溶液完全混合。</li>
		<li>对于15倍苯丙氨酸（Phe）处理组培养基，在15 mL锥形管中取10 mg DMEM粉末与4.7 mL ddH2O、0.5 mL FBS（5%）和0.1 mL青霉素/链霉素（1%）混合。充分涡旋并颠倒混匀，确保溶液均匀。向培养基中加入过量苯丙氨酸粉末，终浓度为924 mg/L。再次充分涡旋并颠倒混匀，确保溶液完全混合。</li>
		<li>对于15倍色氨酸（Tryp）处理组培养基，在15 mL锥形管中取10 mg DMEM粉末与4.7 mL ddH2O、0.5 mL FBS（5%）和0.1 mL青霉素/链霉素（1%）混合。充分涡旋并颠倒混匀，确保溶液均匀。向培养基中加入过量色氨酸粉末，终浓度为224 mg/L。再次充分涡旋并颠倒混匀，确保溶液完全混合。</li>
		<li>向上述各步骤所得的所有锥形管中分别加入甲硫氨酸和苏氨酸，终浓度分别为30.0 mg/mL和95.0 mg/mL。充分涡旋并颠倒混匀。培养基中无需额外添加丙酮酸钠。</li>
		<li>使用带有0.22 µm聚醚砜膜的25 mm注射器滤器对对照组和处理组培养基进行过滤。</li>
		<li>用封口膜密封所有含培养基的锥形管，并在4 °C下保存，最长可保存3周。在用于细胞处理前，将所有培养基预热至37°C。 
		&#8203;注意：粉末和液体试剂的称量与配制应根据处理组和对照组培养基的总体积进行计算。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞样品制备
<ol>
	<li>使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM标准培养基，在37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下，于培养瓶（如T10、T25等）中培养宫颈癌（HeLa）细胞。2).</li>
	<li>以1:10的传代比例对HeLa细胞进行传代培养，直至细胞活力达到80%或以上。</li>
	<li>当细胞融合度达到80%或更高时，继续接种2 × 105 每孔接种细胞至24孔板，使用添加有0.5% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基。
	<ol>
		<li>在接种细胞之前，准备一个24孔板，其中放入已灭菌、经多聚-d-赖氨酸和层粘连蛋白包被的圆形盖玻片，直径为12 mm。将盖玻片浸入70%乙醇中，然后使用无绒布轻轻擦干。将洁净的盖玻片置于培养板相应的孔中。</li>
		<li>当细胞在步骤2.2中达到80%融合度时，用不含镁离子和钙离子的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。</li>
		<li>加入0.25%胰蛋白酶以解离贴壁细胞，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 3 分钟</li>
		<li>加入含10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM，轻轻吹打混匀，300 x g离心收集细胞 g 室温（RT）孵育 3 分钟。</li>
		<li>用添加了0.5% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM重悬细胞。</li>
		<li>使用血细胞计数板、光学显微镜和台盼蓝对细胞进行计数，并以 2 x 10 的密度接种5 每24孔板每孔的细胞数。或者，可使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。</li>
		<li>将细胞放回37 °C、5% CO₂的培养箱中2，轻轻摇晃培养板以使细胞均匀分布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>8 小时后，将旧的培养基更换为 50% D2O/过量 Phe 或 50% D2O/过量胰蛋白酶培养基。将细胞放回37 °C、5% CO₂的培养箱中继续培养。2 36 小时。</li>
	<li>36小时后，将细胞固定在显微镜载玻片上。
	<ol>
		<li>固定前，准备带有直径为 9 mm 成像垫片的显微镜载玻片，并加入 15 µL 含钙离子和镁离子的 1x PBS。</li>
		<li>用含有钙离子和镁离子的1×PBS缓冲液冲洗细胞。</li>
		<li>加入0.5 mL 4% 无甲醇多聚甲醛（PFA）溶液，将培养板置于生物安全柜中静置约15分钟。</li>
		<li>吸去PFA溶液，用含钙和镁离子的1×PBS缓冲液洗涤两次。</li>
		<li>每孔加入1.5 mL含钙、镁离子的1×PBS。</li>
		<li>使用无菌镊子轻轻夹取每个孔中的盖玻片。将含有细胞的一面朝下，倒置放置于成像垫片上，使其接触步骤2.5.1中准备的PBS。确保不含细胞的一面暴露在空气中。</li>
		<li>使用透明指甲油将盖玻片外层与成像间隔片密封。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>不进行成像时，将显微镜载玻片存放于 4 °C。</li>
</ol>
3. 自发拉曼光谱测量（图2）
<ol>
	<li>使用共聚焦拉曼显微镜获取自发拉曼光谱（图2A）。</li>
	<li>将钥匙转至ON位置以开启激光器。</li>
	<li>双击LabSpec6软件图标以打开采集软件。</li>
	<li>将生物样品直接加载到物镜正下方的样品 holder 上。</li>
	<li>在软件中，点击相机图标以开启视频摄像头。</li>
	<li>调节焦平面，使用50倍物镜识别感兴趣区域。移动操纵杆以控制XY载物台的平面移动，旋转操纵杆以改变焦深。</li>
	<li>选定测量位置后，切换至100倍物镜，并设置激发功率为40 mW。点击红色停止图标以关闭视频摄像头。</li>
	<li>选择1800线/mm的光栅，并将采集范围设置为400 cm-1至3,150 cm-1。</li>
	<li>将采集时间设为90秒，累加次数设为3，二进制像素合并（Binning）设为4，以获得噪声最小且最精确的光谱。 
	注意：这些成像参数可根据实验需求进行优化。</li>
	<li>点击箭头图标以开启实时显示功能。</li>
	<li>调节拉曼位移（cm-1）至所选数值，以精细调节焦平面。 
	注意：本实验中，拉曼激光聚焦于富含CH2键的脂滴上。因此，选择与CH2键伸缩振动模式相匹配的2,850 cm-1拉曼位移。</li>
	<li>使用操纵杆调节焦平面，以优化信噪比。</li>
	<li>选定焦平面后，点击红色停止图标关闭实时显示。</li>
	<li>选择圆形图标以开始光谱采集。</li>
	<li>完成细胞区域采集后，使用相同的焦平面测量PBS背景。利用独立的计算机软件（如Origin）从每个亚细胞目标光谱中扣除背景光谱（图1B）。</li>
</ol>
4. 使用双光子激发荧光和受激拉曼散射进行成像实验
注意：有关受激拉曼散射（SRS）激光准直的详细描述可参见先前的报告28。本方案重点介绍多模态SRS与双光子激发荧光（2PEF）成像系统的操作（图2C，D）。
<ol>
	<li>单击开始以预热激光器。</li>
	<li>按照以下顺序依次打开控制单元和显示器的主开关：1）将控制箱 IX3-CBH 的主开关按下至开启状态，2）将触摸屏控制器的主开关按下至开启状态，3）将连接至主激光合束器 FV31-SCOMB 的 LD OBIS 6 激光远程电源适配器的主开关按下至开启状态，以及 4）将连接至从激光合束器 FV31-SCOMB 的 LD OBIS 6 激光远程电源适配器的主开关按下至开启状态。</li>
	<li>将硅光电二极管探测器和锁相放大器的主开关按下至开启状态。</li>
	<li>将斯托克斯光束设置为 1,031 nm，脉冲宽度设置为 6 ps，重复频率设置为 80 MHz。</li>
	<li>将picoEmerald系统耦合至显微镜，该系统配备同步泵浦光束，其可调波长范围为720–990 nm，脉冲宽度为5–6 ps，重复频率为80 MHz。泵浦光和斯托克斯光的平均激发功率均为450 mW。优化激发功率以最小化对样品的光损伤。</li>
	<li>使用高数值孔径（NA）油浸聚光镜（例如，1.4 NA），通过在聚光镜上滴加少量油滴来收集照射到样品上的斯托克斯光和泵浦光。</li>
	<li>将样品置于油滴上，并在固定样品的载玻片上方放置一大滴水，以用于水浸式物镜。</li>
	<li>将锁相放大器设置为20 MHz。现在使用超分辨率成像软件模块处理图像。</li>
	<li>选择512像素 × 512像素的图像尺寸，像素驻留时间为80 µs/像素。</li>
	<li>当目标细胞区域正确聚焦后，采集图像。使用显微镜的采集软件，将图像保存为Olympus .oir图形文件。</li>
	<li>在1,900 cm-1处采集背景图像，并从所有细胞图像中减去该背景图像。</li>
	<li>进行双光子激发荧光（2PEF）成像时，使用相同的可调谐皮秒激光器，将黄素（Flavin）和NADH的无标记自发荧光激发波长分别设置为800 nm和780 nm。</li>
	<li>使用460 nm/515 nm滤光立方体收集黄素和NADH的反向散射自发荧光发射信号。</li>
	<li>将驻留时间调整为8 µs/像素，像素尺寸设置为512像素 × 512像素。将激光快门功率参数设置为150 mW。</li>
	<li>进行三维图像重建时，将受激拉曼损耗调谐至2,850 cm-1（797 nm）。</li>
	<li>一旦识别出目标单个细胞，设定激光从顶部焦平面开始扫描，以检测这些细胞的顶部和底部层面。 
	&#8203;注意：三维模型将生成并保存为.oir文件。</li>
</ol>
5. 光谱与图像分析
<ol>
	<li>光谱分析
	<ol>
		<li>使用 Origin 软件或其他相关应用程序从所有亚细胞靶标光谱中扣除背景光谱。</li>
		<li>使用 MATLAB 的数学建模功能，通过该软件内置函数处理拉曼光谱。也可使用 Python 进行光谱处理。
		<ol>
			<li>光谱预处理首先将文件转换为数组形式，并在每个倒数厘米处对光谱进行插值。</li>
			<li>为验证结果，绘制原始数据图。使用 MATLAB 中的内置函数 msbackadj 对原始光谱进行基线校正。简而言之，该内置函数在用户指定的间隔单位值处估算基线点，并返回相邻窗口之间的距离。基于这些基线点，估计并绘制一条回归线。应用 Smoothing 对回归线进行平滑处理，以从每条原始光谱中扣除基线。</li>
			<li>通过将 2,930 cm-1 处蛋白质的拉曼强度除以每个拉曼位移的强度，进行最小-最大归一化。2,930 cm-1 信号通常是拉曼光谱中强度最高的信号。经过此归一化处理后，最大值被转换为 1，最小值被转换为 0，其余所有值均被转换为介于 0 和 1 之间的十进制数。</li>
			<li>将相同条件下的个体光谱取平均，合并为单个光谱，以降低噪声。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>处理完成后，使用 Origin 等应用程序同时显示所有光谱。光谱中显示的峰代表特定的化学键或官能团。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂滴的三维图像分析
	<ol>
		<li>使用 FIJI-ImageJ 软件处理所有三维图像。</li>
		<li>对三维图像堆栈执行 Bandpass Filters 和 Smoothing 操作。</li>
		<li>进行三维图像分析时，通过测量每个脂滴质心到表面的距离，计算其球形评分。将每个脂滴的球形评分与在同一欧几里得平面上的理想球体的球形评分进行比较。剔除球形评分较低的脂滴，并对剩余脂滴的体积和数量进行评估。</li>
		<li>使用适当的统计软件分析不同处理组间脂滴体积和数量的统计学显著性。本研究中使用了 GraphPad Prism。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二维高光谱图像分析
	<ol>
		<li>使用 FIJI-ImageJ 软件处理所有二维高光谱图像。</li>
		<li>选择 2,930 cm-1 通道生成包含 0 和 1 值的掩膜图像。将背景赋值为 0，细胞区域赋值为 1。</li>
		<li>从氘标记蛋白质通道（2,175 cm-1）中减去背景通道（1,900 cm-1），以消除荧光效应。</li>
		<li>将所得的氘标记蛋白质通道除以蛋白质通道（2,930 cm-1），获得蛋白质 turnover 率的比值图像。</li>
		<li>然后，将步骤 5.3.2 中生成的掩膜图像与比值图像相乘，以去除任何残留的背景噪声。结果是在每幅比值图像中生成暗背景。</li>
		<li>使用 FIJI-ImageJ 中的 Freehand Selection 工具手动分割单个细胞，并计算其显示的像素强度。像素强度对应于所可视化化学键的浓度。</li>
		<li>使用适当的统计软件对像素强度进行统计学显著性分析。本研究中使用了 GraphPad Prism。对剩余的比值图像重复此分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/">https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/</a> (2023).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。

DO-SRS 和 2PEF 成像已被用于研究多种体系中的代谢动态 离体 模型，包括果蝇和人类组织21,22,23,24,26,27,33本研究采用的成像技术结合了双偏振受激拉曼散射（DO-SRS）和双光子激发荧光（2PEF）显微技术，相较于其他分子特异性成像方法具有更快的成像速度，无需进行分子提取或使用细胞毒性试剂标记，且样品制备步骤极少。具体而言，DO-SRS显微技术使我们能够探测 从头合成 动物和细胞中的脂质生成与蛋白质合成及其代谢动态的可视化 原位23,</su...

苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Tryp）是重要的芳香族氨基酸（AAAs），可被人体吸收用于合成新的分子，以维持正常的生物学功能1。Phe 是合成蛋白质、黑色素和酪氨酸所必需的，而 Tryp 则是合成褪黑素、5-羟色胺和烟酸所必需的2,3。然而，过量摄入这些 AAAs 可以上调雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，抑制 AMP 激活的蛋白激酶，并干扰线粒体代谢，从而共同改变大分子生物合成，导致在健康细胞中产生如活性氧（ROS）等恶性前体物质4,5,6。在过量 AAAs 调控下，对代谢动态变化进行直接可视化观察，对于理解 AAAs 在促进癌症发展以及健康细胞生长中的作用至关重要7,8,9。
传统的氨基酸分析（AAA）研究依赖于气相色谱法（GC）10。其他方法，如磁共振成像（MRI），空间分辨率有限，难以对生物样本进行细胞和亚细胞水平的分析11。近年来，基质辅助激光解吸/电离（MALDI）技术已被用于阐明氨基酸在癌症增殖过程中通过非侵入性生物标志物参与脂质和蛋白质合成的作用12,13,14。然而，该技术仍存在成像深度较浅、空间分辨率差以及样品制备过程复杂等问题。在细胞水平上，可通过多同位素成像和纳米级二次离子质谱技术追踪无毒的稳定同位素（如氮-15和碳-13）在大分子中的掺入情况。但这些方法会对活体生物样本造成破坏15,16。原子力显微镜（AFM）是另一种强大的技术，可用于可视化代谢动态过程17。然而，AFM成像过程中扫描速度较慢，可能因热漂移导致图像失真。
我们开发了一种非侵入性生物正交成像方法，通过将氧化氘（D₂O）与生物正交拉曼标记相结合，实现了在活体系统中对代谢过程的高特异性、高灵敏度成像。该技术利用D₂O作为代谢标记物，在细胞内天然代谢过程中引入氘代分子，再通过受激拉曼散射（SRS）显微成像检测C-D键的特征拉曼信号，从而实现对脂质、蛋白质等生物大分子合成的可视化追踪。由于C-D键在生物样本中背景信号极低，该方法具有优异的信噪比和分子特异性。同时，D₂O无毒、分布广泛，适用于长期活体成像。我们进一步将该技术与炔烃标记的生物正交探针联用，实现了多色拉曼成像，可同时监测多种代谢通路的动态变化。本方法为研究发育、肿瘤代谢及药物响应等生物学过程提供了强有力的工具。 
关键词：非侵入性成像，生物正交化学，氧化氘，受激拉曼散射显微术，代谢标记，C-D键，多色成像，活体成像2O）探测受激拉曼散射（DO-SRS）显微成像和无标记双光子激发荧光显微成像（2PEF）。该模式在对生物样本成像时具有高空间分辨率和化学特异性18,19,20,21,22,23,24本方案介绍了利用DO-SRS和2PEF技术研究癌症进展过程中脂质、蛋白质代谢动态及氧化还原比变化的应用。通过D2由于氧-18是水的一种稳定同位素形式，细胞生物分子可通过氘（D）标记，因为氘能迅速与细胞内全身体水达到平衡，并通过酶促交换形成碳-氘（C-D）键21新合成的生物大分子（包括脂质、蛋白质、DNA/RNA和碳水化合物）中的碳-氘键可在拉曼光谱的细胞静默区被检测到20,21,22,25,26,27利用两束同步的激光脉冲，可在单个细胞上显示新合成脂质和蛋白质中的碳-氘键 通过 无需提取或使用细胞毒性试剂标记的高光谱成像（HSI）。此外，受激拉曼散射（SRS）显微镜能够通过采集并组合生物样品中选定区域的一系列横截面图像，构建三维（3D）模型。22,26利用高光谱和三维体成像，DO-SRS 可获取单细胞中新合成大分子的空间分布，以及在 AAA 调控下促进癌症生长的细胞器类型。22此外，利用双光子激发荧光（2PEF）技术，我们能够以高分辨率、深穿透深度和低损伤的方式获取生物样品中黄素和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的自发荧光信号21,23,24黄素和NADH的自发荧光信号已被用于表征癌细胞中的氧化还原稳态及脂质过氧化22,26因此，DO-SRS与2PEF的联用不仅能够以高空间分布、化学特异性信息以及最少的样品前处理，实现对癌细胞中AAA调控的代谢动态进行亚细胞水平分析，而且该方法还减少了使用有毒试剂对内源性分子进行提取或标记的需求。在本方案中，我们首先介绍D2O 和氨基酸制备，以及癌细胞培养。随后，我们展示 DO-SRS 成像和 2PEF 成像的实验方案。最后，我们呈现 SRS 和 2PEF 成像的代表性结果，这些结果展示了 AAA 调控下癌细胞中脂质和蛋白质的代谢变化，以及氧化还原比的变化。整个过程的详细图示如下所示 图1.

<table><tbody><tr><td>10 mL 血清移液管&amp;nbsp;</td><td>Avantor（由 VWR）</td><td>75816-100</td><td>https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100</td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664</td></tr><tr><td>16% 甲醛，无甲醇</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28906</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0112929</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929</td></tr><tr><td>25 mm 注射器滤器， 2 &amp;mu;m PES</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>381-2216-OEM</td><td>https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003</td></tr><tr><td>460 nm滤光立方体</td><td>Olympus</td><td></td><td>OCT-ET460/50M32</td></tr><tr><td>AC适配器，用于LD OBIS 6激光远程电源供应</td><td>Olympus</td><td></td><td>为激光器供电</td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>KR Electronics</td><td>KR2724</td><td>8 MHz</td></tr><tr><td>BNC 50 欧姆终端器&amp;nbsp;</td><td>Mini Circuits</td><td>STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>BNC 电缆</td><td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>同轴电缆，BNC公头/公头</td></tr><tr><td>宽带介电镜</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100 nm</td></tr><tr><td>离心</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚光镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>康宁</td><td>2850-25</td><td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning® Square #1½ Cover Glass/p/2850-25</td></tr><tr><td>直流电源</td><td>TopWard</td><td>6302D</td><td></td></tr><tr><td>二向色镜支架</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜细胞培养试剂</td><td>mpbio&amp;nbsp;</td><td>196055</td><td>https://www.mpbio.com/0219605525-二甲基亚砜-cf</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔&amp;rsquo;不含甲硫氨酸、苏氨酸和丙酮酸钠的 s 培养基</td><td>MilliporeSigma</td><td>38210000</td><td>https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder&lt;br/&gt; 含碳酸氢钠，不含甲硫氨酸、苏氨酸和丙酮酸钠&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;改良型伊格尔&amp;rsquo;s 培养基</td><td>康宁</td><td>MT10027CV</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>版本 1.53t 2022年8月24日</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>重水（氘代水）</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>7732-18-5</td><td>https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L</td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>https://www.atcc.org/products/ccl-2</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z359629-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI&lt;br/&gt; zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk&lt;br/&gt; QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr&lt;br/&gt; SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL&lt;br/&gt; w_wcB&amp;amp;gclsrc=aw.ds</td></tr><tr><td>高光密度带通滤光片</td><td>Chroma Technology</td><td>ET890/220m</td><td>滤除斯托克斯光束，透射泵浦光束</td></tr><tr><td>HyClone 胎牛血清（FBS）</td><td>Cytiva&amp;nbsp;</td><td>SH300880340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340</td></tr><tr><td>HyClone 胰蛋白酶 0.25% (1x) 溶液</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.02</td><td>https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445</td></tr><tr><td>集成的受激拉曼散射激光系统</td><td>应用物理 &amp;amp; Electronics, Inc.</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALD 输出波长为 1031 nm、脉宽为 6 ps、重复频率为 80 MHz 的脉冲，用作斯托克斯光束。&amp;nbsp; 532 nm 的倍频光束用于同步泵浦一台皮秒光学参量振荡器（OPO），以产生脉宽为五至六皮秒的锁模脉冲序列（OPO 的闲频光束被干涉滤光片阻断）。OPO 的输出波长可在 720&amp;ndash;950 nm，作为泵浦光束。1031 nm的斯托克斯光束通过picoEMERALD内置的电光调制器（EOM）以8 MHz频率进行正弦调制，调制深度超过90%。泵浦光束与斯托克斯光束通过picoEMERALD内部的二向色镜实现空间重叠。泵浦脉冲与斯托克斯脉冲之间的时间重叠通过内置延迟装置实现，并利用显微镜下纯D2O的受激拉曼散射（SRS）信号进行优化。</td></tr><tr><td>倒置激光扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>IX3-CBH 控制箱</td><td>Olympus</td><td></td><td>控制激光扫描显微镜</td></tr><tr><td>运动镜架</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 个低剖面六角调节器</td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td><td>Sigma</td><td>P5482-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482</td></tr><tr><td>L-色氨酸</td><td>Sigma</td><td>T8941-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941</td></tr><tr><td>LabSpec 6</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td>https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/</td></tr><tr><td>锁相放大器</td><td>Zurich Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier</td></tr><tr><td>长通二向色镜分光器</td><td>Semrock</td><td>Di02-R980-25x36</td><td>980 nm 激光 BrightLine 单边激光平面二向色镜分光器</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>版本：R2022b</td><td>https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-003</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-0-03</td></tr><tr><td>显微成像软件</td><td>Olympus</td><td>FluoView</td><td></td></tr><tr><td>MPLN 100x，Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364</td></tr><tr><td>奥林巴斯 MPLN 50x</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON&amp;nbsp;</td><td>https://www.olympus-ims.com/zh-cn/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363</td></tr><tr><td>NA油浸式聚光镜</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>6-U130</td><td>https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser</td></tr><tr><td>指甲油</td><td>湿润的荒野</td><td>B01EO2G5O4</td><td>https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW&lt;br/&gt; HHQP38FXXDC_0</td></tr><tr><td>起源</td><td>OriginLab</td><td>Origin 2022b (9.95)</td><td>https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782</td></tr><tr><td>PBS 1×（Dulbecco 磷酸盐缓冲液）</td><td>Thermofischer - Gibco</td><td>14040117</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔 - 吉布科</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>潜望镜组件</td><td>Thorlabs</td><td>RS99</td><td>包含上部和下部组件， &amp;Oslash;1&quot; 后部及夹紧叉</td></tr><tr><td>picoEmerald 系统</td><td>A.P.E</td><td>N/A</td><td>https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/</td></tr><tr><td>带BNC连接器的屏蔽箱</td><td>Pomona Electronics</td><td>2902</td><td>带盖铝盒，BNC 母/母</td></tr><tr><td>Si光电二极管探测器</td><td>自制</td><td>N/A</td><td>DYI 系列</td></tr><tr><td>硅片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>垫片</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/</td></tr><tr><td>自发拉曼光谱</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td>https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/</td></tr><tr><td>受激拉曼散射显微技术</td><td>自制</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>触控&amp;nbsp; 面板控制器</td><td>Olympus</td><td></td><td>控制激光扫描显微镜的 X-Y 方向</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝 (0.85% NaCl)&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/培养基与试剂/p/000000000000181876/台盼蓝，0.4% 溶液&quot;</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Kaverme - 亚马逊</td><td>B07RNVXXV1</td><td>https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1&quot;</td></tr><tr><td>双光子激发荧光显微镜</td><td>自制</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>称量纸&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>12578-165</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper</td></tr><tr><td>苏黎世仪器 LabOneQ 软件</td><td>Zurich Instruments</td><td></td><td>控制苏黎世锁相放大器</td></tr></tbody></table>

芳香族氨基酸调控的细胞代谢生物正交化学成像

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

必需芳香族氨基酸（AAAs）是细胞合成新生物量和维持正常生物学功能的基本组成单元。例如，充足的AAAs供应对于癌细胞维持其快速生长和分裂至关重要。因此，人们越来越需要一种高度特异、非侵入性且样品前处理最少的成像方法，以直接观察细胞如何利用AAAs进行代谢活动 原位. 此处，我们开发了一种光学成像平台，该平台结合了重水（D₂O）2O）探测结合受激拉曼散射（DO-SRS），并将DO-SRS与双光子激发荧光（2PEF）集成于同一显微镜系统，以直接可视化AAA调控下HeLa细胞的代谢活性。总体而言，DO-SRS平台可在单个HeLa细胞水平上实现新合成蛋白质和脂质的高空间分辨率与高特异性成像。此外，2PEF模态能够以无标记方式检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素的自发荧光信号。此处描述的成像系统同时兼容 体外 和 体内 模型，适用于多种实验。本方案的通用工作流程包括细胞培养、培养基制备、细胞同步化、细胞固定，以及使用DO-SRS和2PEF模式进行样本成像。

在含有50% D2O的细胞培养基中添加15倍浓度的过量芳香族氨基酸（AAAs），可在HeLa细胞中产生新合成脂质和蛋白质特有的C-D拉曼谱带（图2B）。此前的实验曾使用不同浓度（如2倍和5倍）进行，尽管相关数据未予展示，但15倍浓度产生的新合成脂质和蛋白质的C-D拉曼谱带最为明显。具体而言，在研究脂滴（LDs）时，我们发现15倍苯丙氨酸（Phe）和15倍色氨酸（Tryp）分别在2,143 cm-1和2,172 cm-1处诱导出新合成脂质和蛋白质的信号。随后采用去强化拉曼散射（DO-SRS）对单个细胞中C-D信号的空间分布进行成像（图3）。使用ImageJ对单个细胞的像素强度进行手动分割和计算，如图3A中白色虚线边框所示。对照组细胞显示出中等强度的C-D脂质和蛋白质谱带，而15倍Phe和15倍Tryp处理组则显示出更强的C-D脂质和蛋白质谱带。定量分析表明，过量AAAs可能使脂质合成上调10%-1...

我们介绍一种利用氘代水（重水 D2O）探针结合受激拉曼散射（DO-SRS）显微技术直接可视化氨基酸调控的细胞代谢活性的实验方案，该技术与双光子激发荧光显微技术（2PEF）相整合。

必需芳香族氨基酸（AAAs）是细胞合成新生物量和维持正常生物功能的基本组成单元。例如，……

我们展示了一种新型成像技术，具有无标记、高化学特异性和亚细胞分辨率的特点。我们的方法可用于研究衰老及癌症等疾病中的代谢功能障碍问题。拉曼成像结合双光子荧光和二次谐波生成，提供了一种非破坏性、无需标记的成像技术，样品制备简单，可在不损伤细胞样品的情况下实现高亚细胞分辨率。多种成像模式共同构成了本平台的组成部分。个人应尽可能按照我们的方案操作，需注意本系统为自行搭建。在此过程中，应逐步建立适合自身的操作规范以确保成功。取两支独立的离心管，分别加入10毫克DMEM粉末和4.7毫升双蒸水，于15 mL锥形管中进行测量与混合。充分涡旋并倒置离心管，以确保溶液混合均匀。对于两个离心管，均加入4.7 mL氘代水（deuterium oxide）、0.5 mL胎牛血清（FBS）和0.1 mL青霉素-链霉素溶液，随后涡旋并倒置混匀。接着，向其中一个管中加入过量苯丙氨酸，向第二个管中加入过量色氨酸粉末，再次混匀。向两个试管中分别加入甲硫氨酸和苏氨酸，终浓度分别为每毫升30毫克和95毫克，随后涡旋振荡并倒置试管混匀。然后，使用带有0.22微米滤膜的25毫米注射器滤器过滤已配制的培养基。最后，用Parafilm封口膜密封所有装有培养基的锥形管。将制备好的培养基在 4°C 下保存。使用添加了 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素和链霉素的标准 DMEM，在培养瓶中维持愈合细胞的生长。以 1:10 的传代比例对愈合细胞进行传代培养，直至细胞活力达到 80% 或更高。接种细胞前，将已灭菌的、经多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的圆形12 mm盖玻片浸入70%乙醇中。使用无尘纸将盖玻片擦干，并将洁净的盖玻片放入培养板相应的孔中。用不含镁离子和钙离子的PBS洗涤细胞一次。加入0.25%胰蛋白酶以使贴壁细胞从培养瓶中解离，置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育3分钟。随后向细胞中加入含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基。轻轻吹打混匀。在室温下以300 G离心力离心3分钟收集细胞。随后，将细胞重悬于添加了0.5% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。在光学显微镜下使用血细胞计数板对台盼蓝染色细胞进行计数，并以每孔2 × 10⁵个细胞的密度接种至24孔板中。轻轻摇动培养板，使细胞均匀分布。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养。八小时后，将旧的培养基更换为50%氘代水加过量苯丙氨酸培养基，或50%氘代水加过量色氨酸培养基。将细胞放回 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中培养 36 小时。现在准备直径为 9 毫米成像区域的显微镜载玻片。加入 15 微升含有钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液，并用相同溶液冲洗细胞。加入 0.5 mL 4% 无甲醇的多聚甲醛溶液，将培养板置于生物安全柜中静置 15 分钟。吸除多聚甲醛溶液，用添加钙离子和镁离子的 PBS 洗涤两次。每孔加入 1 mL 含钙离子和镁离子的 PBS 溶液。使用无菌镊子小心地从每个孔中取出盖玻片。将其倒置，使含有细胞的一面接触 PBS，并放置在成像隔片的成像区域上。用透明指甲油密封盖玻片外侧边缘与成像隔片之间的区域。将生物样本直接加载到物镜正下方的样本载 holder 上。然后点击软件中的相机图标以开启视频摄像头，并使用50倍物镜调节焦平面，以确定感兴趣的区域。随后切换至100倍物镜。单击停止图标以关闭摄像机。然后选择每毫米 1,800 条线的光栅，并将采集范围设置为 400 至 3,150 厘米⁻¹。最后，将采集时间设为 90 秒，累积次数设为 3，二分设为 4，以获得噪声最小且最精确的光谱。单击“开始”以预热激光器。首先将控制箱 IX3CBH 的主开关拨至“开”，然后打开触摸面板控制器的主开关。接着，打开连接至主激光合束器 FV31S comb 的 LDOBIS6 激光远程电源适配器的主开关。然后打开连接至副激光组合器 FV31S comb 的 LDOBIS6 激光远程电源的交流适配器。接着，打开 SI 光电二极管探测器和锁相放大器的主开关。将激光红外波长设置为 1031 纳米，将 Pico Emerald 系统设置为 720 至 990 纳米之间的可调波长。将样品置于油中，并在固定样品的载玻片位置放置一个较大的水滴。选择扫描尺寸为 512 × 512 像素。以 Olympus 格式采集并保存图像。OIR 图形文件。将信号设置为 862.0 后，采集背景图像并保存。将驻留时间调整为每像素 8 微秒，像素大小调整为 512 × 512 像素。将激光快门功率参数设置为150毫瓦。进行三维图像重建时，将受激拉曼损耗调节至2,850 cm⁻¹。一旦确定了目标单个细胞，即调节激光从最上方的焦平面开始扫描，以检测这些细胞的顶部和底部层面。采用重水（氘代氧化物）作为探针，利用受激拉曼散射技术对单个细胞上CD信号的空间分布进行可视化成像。对照细胞显示出中等强度的CD、脂质和蛋白质条带。然而，15 x v 和 15 x trip 样品的CD脂质和蛋白质条带更强。定量分析表明，过量的芳香族氨基酸可能使脂质合成上调10%至17%，但使蛋白质合成下调10%。经芳香族氨基酸处理的细胞的比率分析显示，黄素/(黄素+还原型NADH)增加50%，不饱和脂质/饱和脂质增加10%。展示了在对照条件和芳香族氨基酸过量条件下愈合细胞中受激拉曼三维脂滴体积投影。对三维脂滴的定量分析显示，与对照组相比，经芳香族氨基酸处理的细胞中脂滴数量增加，但尺寸减小。拉曼成像和双光子荧光成像的成像参数应针对每个样品进行优化，以确保最佳成像质量。研究人员可将我们的系统与二次谐波产生技术结合，用于研究胶原蛋白结构，从而阐明衰老和疾病早期的代谢变化，并有助于理解神经退行性疾病或癌症的发展进程。我们的技术是首个能够在亚细胞高分辨率下可视化生物系统中脂质和蛋白质合成的工具。该技术还可转化为临床应用，用于无创疾病检测。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

芳香族氨基酸调控细胞代谢的生物正交化学成像

13C-同位素标记是一种用于确定多种微生物细胞中心代谢的有效技术。在使用特定标记底物培养细胞后，通过GC-MS检测可基于蛋白质源性氨基酸中的独特标记模式，揭示功能性的代谢通路。...

通过13C标记的蛋白质源性氨基酸进行代谢通路的验证与发现

本文介绍了一种简便的荧光检测方法，用于评估氨基酰-tRNA合成酶/tRNA配对在哺乳动物细胞表达蛋白中掺入非经典氨基酸（ncAAs）的效率。文中还描述了将非经典氨基酸应用于G蛋白偶联受体（GPCRs）研究的实例，包括结合位点的光交联定位以及在活细胞中对GPCR进行生物正交标记。...

优化化学探针在G蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

本文介绍了一种可靠的实验方案，用于定量无细胞蛋白合成反应中涉及中心碳代谢和能量代谢的40种化合物。通过苯胺对无细胞合成混合物进行衍生化处理，以实现反相液相色谱的有效分离，随后使用同位素标记的内标物结合质谱法进行定量分析。...

采用反相液相色谱-质谱法对无细胞蛋白合成代谢进行绝对定量

本方案介绍了一种放射性标记氨基酸摄取检测方法，可用于评估原代细胞或分离骨骼中的氨基酸消耗情况。...

培养骨细胞和分离骨骨干中氨基酸消耗的评估

实时细胞代谢通量检测利用pH和氧气传感器，测量氧消耗速率和细胞外酸化速率，分别对应线粒体和糖酵解途径的三磷酸腺苷（ATP）生成。本文详细阐述了一种用于理解成骨细胞能量状态以及细胞生物能量状态的表征与解读方法。...

使用实时细胞代谢通量分析仪监测成骨细胞生物能量代谢

本方案描述了内源性代谢辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤（磷酸）二核苷酸（NAD(P)H）以及氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的荧光成像与分析。对NAD(P)H和FAD进行自发荧光成像，可提供一种无需标记、非破坏性的细胞代谢评估方法。...

利用自发荧光成像评估细胞代谢

此处，我们介绍一种利用光学光热红外-荧光技术的实验方案 原位 杂交技术（OPTIR-FISH），也称为中红外光热-FISH（MIP-FISH），可用于鉴定单个细胞并研究其代谢活动。该方法具有广泛适用性，可用于多种应用，包括以单细胞分辨率绘制细胞代谢图谱。...

光学光热红外-荧光原位杂交（OPTIR-FISH）

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

本方案将定制的生物反应器系统与超极化¹³C核磁共振波谱技术相结合，用于实时测量活细胞中的丙酮酸代谢，从而提高代谢研究和药物筛选应用中的可重复性和动力学准确性。...

使用超极化13C核磁共振对活细胞进行实时代谢检测

只有通过断层扫描技术才能实现无损的体积可视化，其中最有效的方法是X射线显微计算机断层扫描（CT）。...

Ex-Vivo 生物样本的显微CT高分辨率三维成像

了解一种结合受激拉曼散射与双光子荧光显微镜的无标记成像技术，用于可视化活细胞中亚细胞水平的代谢活动。该方法可高特异性地研究芳香族氨基酸调控的脂质与蛋白质合成过程。

芳香族氨基酸调控的细胞代谢生物正交化学成像

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