Name: 人隐静脉内皮细胞分离和暴露于受控水平的剪切应力和拉伸 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学习使用胶原酶分离培养人隐静脉内皮细胞，并通过流体剪切力和循环拉伸装置研究其机械应力响应。该方法有助于深入理解血管内皮功能障碍的分子机制。

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JEK 获得圣保罗研究基金会 [FAPESP-INCT-20214/50889-7 和 2013/17368-0] 以及国家科学技术发展委员会-CNPq（INCT-465586/2014-7 和 309179/2013-0）资助项目的支持。AAM 获得圣保罗研究基金会（FAPESP 2015/11139-5）以及国家科学技术发展委员会-CNPq（Universal - 407911/2021-9）资助项目的支持。

大隐静脉的废弃段取自圣保罗大学医学院心脏病学研究所（InCor）接受主动脉冠状动脉旁路移植术的患者。所有个体均签署知情同意书，同意参与本研究，该研究已通过当地伦理委员会的审查和批准。
1. 人隐静脉内皮细胞（hSVECs）的原代分离、培养与鉴定
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>高压灭菌一把直头或弯头镊子以及组织剪（7-8 cm）。</li>
		<li>制备无菌明胶。将0.1 g（0.1% w/v）或3 g（3% w/v）猪皮明胶与100 mL超纯水混合，121 °C高压灭菌15 min，4 °C保存。使用前于37 °C温育使其液化，用于包被细胞培养皿和载玻片。</li>
		<li>在超净工作台内制备无菌胶原酶（1 mg/mL）。用 PBS 稀释胶原酶，并使用 0.2 µm 滤器过滤除菌。</li>
		<li>用0.1% w/v明胶在37 °C下孵育至少30分钟，包被一个60 mm细胞培养皿和一个8孔腔室载玻片。接种细胞前去除多余的明胶。</li>
		<li>配制完全内皮细胞培养基：在内皮细胞生长基础培养基（EBM-2）中添加EGM2生长因子。 
		注意：EGM2 生长因子由文中所列公司以试剂盒形式提供 材料表. 公司未披露该因子的浓度。</li>
		<li>配制2%和5%牛血清白蛋白（BSA）、4%多聚甲醛（PFA）以及0.1% Triton X-100溶液，均用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人皮肤血管内皮细胞的分离与培养
	<ol>
		<li>采集至少2-3厘米长的大隐静脉节段用于此操作。 
		注意：所有细胞培养操作均须在无菌条件下于超净工作台内进行。</li>
		<li>将静脉节段转移至盛有预热 PBS 的培养皿中。将移液器吸头插入静脉一端，轻轻用 PBS 冲洗以清除管腔内的全部血液。持续冲洗直至流出液完全澄清。</li>
		<li>用无菌棉线缝合血管的一端。小心地将血管内充满1 mg/mL的II型胶原酶溶液。用棉线缝合血管的另一端。图1A). 将容器置于含5% CO₂的湿润环境中，用胶原酶溶液孵育2 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
		<li>随后，将血管的一端在15 mL离心管内剪开，收集胶原酶溶液。再剪开另一端，用1–2 mL PBS冲洗管腔表面，以收集所有脱落的内皮细胞。将全部PBS与胶原酶溶液一同置于同一离心管中。</li>
		<li>将试管在400 x g下离心 g 在室温（RT）下离心5分钟以沉淀细胞。 
		&#8203;注意：细胞沉淀非常少，难以观察。若在胶原酶处理前（步骤 1.2.2）未完全去除血液，血细胞也会沉淀，导致沉淀呈红色。</li>
		<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 3–4 mL 完全内皮细胞培养基（EBM-2，添加 EGM2 生长因子）及额外的肝素溶液（终浓度 5 U/mL）中。将细胞接种至预先用 3% w/v 明胶包被的 60 mm 细胞培养皿中。 
		注意：明胶因其易得性和低成本而被优先选用。由于明胶包被可有效维持内皮细胞表型，因此未测试其他包被物质。在旨在研究不同细胞外基质成分对内皮细胞黏附及表型影响的研究中，可尝试使用胶原蛋白和纤连蛋白进行测试。</li>
		<li>在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育细胞2 培养4天，期间不更换培养基。此后，每隔一天更换一次培养基。从此时起，培养基中无需再添加肝素。在显微镜下观察培养板，以确认红细胞已被去除。</li>
		<li>3-10分钟后&#160;提取后数天，根据静脉节段的大小和直径，通过相差显微镜观察人小静脉内皮细胞（hSVECs）。</li>
		<li>在相差显微镜下评估细胞的汇合程度及其鹅卵石样形态。</li>
		<li>每2天更换一次培养基，直至细胞达到70%–80%融合度。</li>
		<li>使用0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液传代hSVECs。
		<ol>
			<li>用预热的 PBS 洗涤细胞。</li>
			<li>向60 mm细胞培养皿中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA溶液。在37 °C孵育2分钟，或直至所有细胞脱落。</li>
			<li>加入2 mL完全内皮细胞培养基以灭活胰蛋白酶。</li>
			<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中，以300 x g 室温下持续3分钟。</li>
			<li>弃去上清液，将细胞重悬于1 mL培养基中。</li>
			<li>用1:1的0.4%台盼蓝染色细胞悬液，计数活细胞以进行接种。</li>
			<li>为了扩增培养，将细胞接种于含10 mL预热的完全内皮细胞培养基的100 mm细胞培养皿中，在37 °C、5% CO₂的湿润环境中培养2. 
			注意：平均而言，接种 4 x 104 hSVEC/cm2 48 小时后将达到 100% 汇合度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将步骤1.2.11.5中的细胞沉淀重悬于含5%二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FBS）中，置于液氮中冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人羊膜静脉内皮细胞的表征：CD31的流式细胞术染色
	<ol>
		<li>转移 1 × 105 将hSVECs转移至一个1.5 mL离心管中，于300 x g条件下离心 g 室温孵育3分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于含2% BSA和CD31-FITC单克隆抗体（1:100）的100 µL PBS中。</li>
		<li>在室温避光条件下染色30分钟。</li>
		<li>加入 0.5 mL PBS 洗涤染色后的细胞，然后在 300 x g 条件下离心 g 室温下孵育3分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于400 µL含2% BSA的PBS中。</li>
		<li>使用未标记的hSVECs（不加CD31抗体）作为阴性对照。</li>
		<li>使用蓝色激光和FITC通道（激发/发射波长最大值[Ex/Em]为498/517 nm）进行流式细胞仪采集分析。若使用其他荧光染料，请确认流式细胞仪是否配备适用于检测这些荧光染料的滤光片组。根据细胞的大小和颗粒度将细胞与碎片分离，然后通过前向散射光和侧向散射光圈选单个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人SVEC表征：CD31和VE-钙黏蛋白的荧光染色
	<ol>
		<li>接种 0.1 x 105 明胶包被的8孔腔室载玻片中的细胞。在37 °C、5 % CO₂条件下孵育细胞过夜。2，以使细胞能够贴附于培养表面。</li>
		<li>吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。</li>
		<li>每孔加入 0.3 mL 4% PFA 固定细胞，在室温下孵育 15 分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤三次。</li>
		<li>每孔加入 0.3 mL 的 0.1% Triton X-100 溶液，用于细胞通透处理。室温孵育 15 分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤三次。</li>
		<li>为阻断非特异性抗体结合位点，每孔加入 0.3 mL 5% BSA 溶液，室温孵育 15 分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤三次。</li>
		<li>将细胞与用含2% BSA的PBS稀释的一抗（CD31和VE-cadherin，1:100）在4 °C轻柔振荡孵育过夜。设一孔仅加入含2% BSA的PBS（无一抗）作为阴性对照。</li>
		<li>用 PBS 洗涤三次。</li>
		<li>将细胞与用 PBS 稀释的荧光标记二抗（1:500）在室温下孵育 1 小时。加入 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色，终浓度为 1 mg/mL。</li>
		<li>用 PBS 洗涤三次。</li>
		<li>移除带有隔片的培养基室。加入一滴封片介质试剂（含50%甘油的PBS），然后盖上一张载玻片（24 mm × 60 mm），注意避免产生气泡。</li>
		<li>在荧光显微镜下观察细胞。 
		&#8203;注意：DAPI 使用 DAPI 滤光片组检测（激发波长：335–379 nm；发射波长：417–477 nm），CD31/VE-钙黏蛋白使用绿色荧光蛋白（GFP）滤光片组检测（激发波长：459–481 nm；发射波长：500–550 nm）。使用激发/发射波长范围相似的滤光片组也可适用于这些荧光染料。若使用其他荧光染料，请确认所用显微镜是否配备适用于检测这些荧光染料的滤光片组。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人皮肤微血管内皮细胞的剪切应力
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>将流动腔载玻片用 0.1% w/v 明胶在 37 °C 下孵育至少 30 分钟。在接种细胞前去除多余的明胶。</li>
		<li>将流体单元和无菌灌注装置连同 10 mL 储液槽一起，在 37 °C、5% CO2 的湿润环境中于培养箱内过夜平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剪切应力实验
	<ol>
		<li>将 2 × 105 个悬浮于 100 µL 内皮细胞培养基中的 ECs 接种至明胶包被的流动腔载玻片中。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 4 小时，使细胞贴附于培养表面。</li>
		<li>按照制造商说明书将灌注装置安装到流体单元上。用约 12 mL 预热的完全内皮细胞培养基填充储液槽和灌注系统。&#160;手动去除灌注系统中的气泡，使两个储液槽的液面均平衡至 5 mL。</li>
		<li>将装有灌注装置但未安装腔室载玻片的流体单元放入培养箱，并将其电源线连接至计算机控制的泵。通过泵控制软件运行预设程序，清除储液槽和灌注系统中的所有气泡。 
		注意：为确保系统正常运行，彻底清除气泡至关重要。</li>
		<li>将装有灌注装置的流体单元转移至层流罩中，并安装含有融合单层细胞的载玻片。</li>
		<li>将装有灌注装置和细胞载玻片的流体单元放回培养箱，并将其电源线连接至泵。</li>
		<li>在泵控制软件中设置以下参数：培养基黏度（0.0072）、载玻片类型、灌注系统校准因子、剪切应力速率（20 dyn/cm2）、流动类型（单向流）和时间（72 小时），然后启动流动（详见设备说明书）。同时，将未施加流动处理、仅使用相同培养基培养的细胞作为静态对照组收集。</li>
		<li>刺激结束后，用 PBS 洗涤细胞一次，并根据所需检测方法收集样本。如需进行荧光染色，请参见步骤 2.3.1；如需提取 RNA，请参见步骤 2.3.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剪切应力实验方案有效性的验证
	<ol>
		<li>肌动蛋白丝（F-actin）荧光染色
		<ol>
			<li>按照步骤 1.4.2–1.4.6 所述方法对细胞进行固定和通透处理。在 µ-载玻片中使用 100 µL 体积。</li>
			<li>用荧光标记的鬼笔环肽（以 1:200 比例溶于 PBS）染色 F-actin，并用 DAPI（终浓度为 1 mg/mL 的 PBS 溶液）复染细胞核，在室温避光条件下孵育 2 小时。</li>
			<li>用 PBS 洗涤三次。</li>
			<li>在荧光显微镜下观察细胞。 
			注意：DAPI 使用 DAPI 滤光片组检测（激发波长：335–379 nm；发射波长：417–477 nm），鬼笔环肽使用 GFP 滤光片组检测（激发波长：459–481 nm；发射波长：500–550 nm）。其他具有相似激发/发射波长范围的滤光片组也可用于上述荧光染料的检测。若使用其他荧光染料，请确认所用显微镜是否配备相应的滤光片组以实现有效检测。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过实时定量反转录 PCR（RT-qPCR）检测基因表达
		<ol>
			<li>用 350 µL 含硫氰酸胍的商用裂解缓冲液从 µ-载玻片中收集细胞。&#160;根据制造商说明书，使用基于柱法的试剂盒提取总 RNA。 
			注意：由于 µ-载玻片中培养的细胞数量有限，建议采用柱法提取 RNA。</li>
			<li>根据制造商说明书，使用 cDNA 合成试剂盒（含逆转录酶）制备 cDNA。</li>
			<li>检测受剪切应力调控的基因（KLF2、KLF4 和 NOS3）的表达水平。使用看家基因 PPIA/亲环素对结果进行标准化处理。反应所用特异性引物列于 表 1 中。</li>
			<li>使用 SYBR Green 荧光 DNA 染料试剂盒进行 RT-qPCR，反应条件如下：i) 50 °C 2 分钟，ii) 95 °C 15 分钟，iii) 94 °C 15 秒，iv) 60 °C 30 秒，v) 72 °C 30 秒。重复步骤 iii 至 v 共 40 个循环。反应结束后增加熔解曲线分析步骤，以验证引物的特异性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 人真皮微血管内皮细胞的周期性拉伸
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>将硅基润滑剂涂抹在25 mm六孔等双轴加载站的顶部和侧面。 
		注意：这可以减少培养板膜与加载站之间的摩擦，使循环应变分布更均匀。每次实验前都必须执行此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>循环拉伸实验
	<ol>
		<li>将4 × 105个细胞悬浮于3 mL培养基中，接种至每孔I型胶原包被的六孔柔性底培养板中（材料表）。计划设置一个或多个在静态条件下培养的板作为对照组。将细胞置于培养箱中（37 °C，含5% CO2的湿润空气），直至达到100%汇合度（通常为接种后48小时）。在开始拉伸程序前，用预热的PBS洗涤细胞一次，并向每孔加入3 mL新鲜培养基。</li>
		<li>将所有已润滑的加载站基板放入培养箱中，并将其管路正确连接至张力细胞拉伸生物反应器系统的控制器设备（详见设备说明书）。</li>
		<li>将每个培养板连接至张力细胞拉伸生物反应器系统提供的红色垫圈上，然后将其放入培养箱内的基板中。
		<ol>
			<li>确保培养板完全就位、压紧并与基板密封，以避免抽真空过程中漏气。基板中必须安装全部四个培养板，以确保适当的真空度和拉伸载荷。</li>
			<li>若实验用板少于四个，可使用空板补足基板上的四个位置。将设备附带的丙烯酸板盖在培养板上方，以增强基板的密封性。将静态培养板也放置在同一培养箱中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>打开控制器设备和计算机系统。点击软件图标并配置所需参数：加载站尺寸、应变类型、伸长百分比、波形形状、频率和时间。详细信息请参阅制造商说明书。选择并下载设定的程序。本实验采用以下参数：1/2正弦波形、1 Hz频率、5%伸长率（模拟静脉拉伸）和15%伸长率（模拟动脉拉伸），持续时间最长至72小时。</li>
		<li>启动真空系统，然后在计算机屏幕上点击开始&#160;以运行拉伸程序。检查硅胶膜是否移动并拉伸细胞。</li>
		<li>刺激完成后，用PBS洗涤细胞一次，并根据所需检测方法收集样本。为验证循环拉伸的效果，收集hSVEC培养基，于-80 °C保存以备后续一氧化氮（NO）测定，并对细胞进行固定以进行荧光染色。 
		注意：不使用时，基板不得存放在培养箱内；否则温度可能改变其平面形状，导致其无法使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>验证循环拉伸程序的有效性
	<ol>
		<li>F-肌动蛋白荧光染色
		<ol>
			<li>按照步骤1.4.3所述方法固定细胞。每孔使用1 mL体积。</li>
			<li>用PBS洗涤细胞三次。在准备下一步硅胶膜操作期间，保持细胞处于PBS中，防止干燥。</li>
			<li>使用棉签清除膜底部多余的硅基润滑剂。然后用新的棉签轻轻涂抹玻璃清洁剂或洗手液。重复此过程直至膜上所有润滑剂被清除，随后用去离子水清洗。 
			注意：必须彻底清除硅胶膜上的润滑剂，以获得高质量的显微图像。</li>
			<li>小心地将硅胶膜切成小片，适配于八孔腔室载玻片进行染色。按照步骤1.4.5所述方法对细胞进行通透处理。</li>
			<li>完成洗涤步骤后，使用鬼笔环肽染色F-肌动蛋白，DAPI染色细胞核。按步骤2.3.1.2和2.3.1.3所述进行分析。每腔室孔使用0.3 mL体积。</li>
			<li>移除带分隔器的介质腔室。滴加一滴封片试剂（PBS中含50%甘油），然后盖上盖玻片（24 mm × 60 mm）。</li>
			<li>在荧光显微镜下观察细胞。 
			注意：DAPI使用DAPI滤光片组检测（激发：335–379 nm；发射：417–477 nm），鬼笔环肽使用红色荧光蛋白（RFP）滤光片组检测（激发：511–551 nm；发射：573–613 nm）。具有相似激发/发射波长范围的滤光片组也适用于这些荧光染料。若使用其他荧光染料，请确认所用显微镜是否配备相应的滤光片组以实现有效检测。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>基于亚硝酸盐（NO2）在hSVEC条件培养基中积累量的一氧化氮（NO）测定——采用碘化钾还原化学发光法
		<ol>
			<li>准备
			<ol>
				<li>用超纯水配制0.01–10 mM的亚硝酸钠（NaNO2）溶液，绘制标准曲线。</li>
				<li>向一氧化氮分析仪的吹扫室中加入5 mL乙酸和1 mL碘化钾溶液（50 mg碘化钾溶于1 mL超纯水中）。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>NO测定
			<ol>
				<li>向一氧化氮分析仪的吹扫室中加入20 µL NaNO2标准品溶液。按照制造商说明书进行测量。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向一氧化氮分析仪的吹扫室中加入20 µL条件培养基。按照制造商说明书进行测量。</li>
		<li>根据标准曲线校准计算NO2浓度。根据所分析条件培养基的总体积对所得数值进行校正6,11。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li>
<li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype%3A+implications+for+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

大隐静脉节段应至少有2 cm，才能成功分离人小隐静脉内皮细胞（hSVECs）。过小的节段难以操作，且不易结扎血管两端以保留胶原酶溶液用于细胞分离。较小的管腔表面积无法获得足够数量的细胞以进行培养扩增。为最大限度降低非内皮细胞（non-ECs）污染的风险，整个操作过程中对大隐静脉节段的处理必须极为轻柔。将移液器尖端插入管腔表面以清除血液以及注入胶原酶溶液时，均需格外小心。酶溶液的孵育时间必须严格控制（不超过1小时），以减少非内皮细胞对培养物的污染。使用添加生长因子混合物的特异性内皮细胞培养基，对hSVEC的培养生长至关重要。在培养初期额外添加肝素，有助于减少静脉节段中残留的红细胞，并抑制平滑肌细胞增殖15。在将细胞传代用于实验或维持培养时，应确保接种细胞的融合度高于40%。内皮细胞需要一定的细胞间接触，以保证良好的增殖和存活。hSVECs可在未经包被（如明胶或纤连蛋白）的培养表面轻松培养。然而，在内皮细胞分离后的最初几天内进行表面包被，可增强内皮细胞的贴壁能力并提高收获量。hSVECs具有稳定的增殖速率，并可在连续传代至第八代时仍维持内皮细胞表型，且不表达间充质细胞标志物（如SM22和cal...

内皮细胞（EC）功能障碍是大隐静脉移植物失效的关键因素1,2,3,4持续增加的剪切应力和周期性拉伸可诱导人隐静脉内皮细胞（hSVECs）呈现促炎表型3,4,5,6其潜在的分子通路尚未被完全阐明，且目前尚无标准化的操作流程 体外 研究可利用这些努力在该领域获得新的见解。本文中，我们描述了一种简单的方法，用于分离、鉴定和扩增人源性小血管内皮细胞（hSVECs），并介绍如何将其暴露于不同水平的剪切应力和周期性拉伸，以模拟静脉和动脉的血流动力学条件。
人小静脉内皮细胞（hSVECs）通过胶原酶孵育法分离获得，可用于传代至第8代。与现有的其他方案相比，本方案对血管的操作更少7，从而减少了平滑肌细胞和成纤维细胞的污染。然而，该方法需要至少2 cm长的较大血管片段，以实现高效的内皮细胞提取。文献报道，大血管来源的内皮细胞也可通过机械剥离法获得7,8。尽管该方法有效，但存在内皮细胞得率低和成纤维细胞污染较高的缺点。为提高纯度，需额外采用磁珠分选或细胞分选技术，这会因购买磁珠和抗体而增加实验成本7,8。相比之下，酶消化法在内皮细胞纯度和活性方面具有更快且更优的效果7,8。
研究内皮功能障碍最常用的内皮细胞是人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。已知内皮细胞表型在不同血管床中会发生变化，因此开发能够代表所研究血管的方法至关重要9,10。在这方面，建立一种分离人小隐静脉内皮细胞（hSVEC）并在机械应力条件下进行培养的方案，是理解hSVEC功能障碍在静脉移植物疾病中作用的重要工具。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA 溶液</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>15 &amp;micro; slide I 0.4 Luer&amp;nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚双乳酸盐（DAPI）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>25 mm 6孔等双轴加载站&amp;nbsp;</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>LS-3000B25.VJW</td><td></td></tr><tr><td>8孔可拆卸小室载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>1 cm 厚丙烯酸板</td><td>Plexiglass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗CD31抗体</td><td>Abcam</td><td>ab24590</td><td></td></tr><tr><td>抗CD31 FITC抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD3101</td><td></td></tr><tr><td>抗VE-钙黏蛋白抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原Bioflex培养板</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>BF3001C</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>棉线缝合线 EP 3.5 15 x 45 cm</td><td>Brasuture</td><td>AP524</td><td></td></tr><tr><td>亲环素正向引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>亲环素反向引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2基础培养基</td><td>Lonza</td><td>CC3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots添加剂</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2657-029</td><td></td></tr><tr><td>Flexcell FX-5000张力系统</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX-5000T</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount水溶性封片介质</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>猪皮来源明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>猪肠黏膜来源肝素钠 5000 IU/mL</td><td>Blau Farmac&amp;ecirc;utica</td><td>SKU 68027</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi泵系统（泵 + 流体单元）</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td></td></tr><tr><td>KLF2正向引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>KLF2反向引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>KLF4正向引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>KLF4反向引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>NOA 280一氧化氮分析仪</td><td>Sievers Instruments</td><td>NOA-280i-1</td><td></td></tr><tr><td>NOS3正向引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>NOS3反向引物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>灌注套装 15 cm，内径1.6 mm，红色，10 mL储液器</td><td>Ibidi</td><td>10962</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽-Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽-Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>碘化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221945</td><td></td></tr><tr><td>QuanTitec SYBR Green PCR试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12K flex平台&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471087</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy微量试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Quiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>载玻片（24 mm x 60 mm）</td><td>Knittel Glass</td><td>VD12460Y1D.01</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31443</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV 第一链合成系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091200</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染液</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>产气荚膜梭菌来源II型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr></tbody></table>

人隐静脉内皮细胞的分离及其在可控剪切应力与拉伸条件下的暴露

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

冠状动脉旁路移植术（CABG）是一种用于重建缺血心肌血供的手术。尽管与动脉移植物相比，大隐静脉移植物的长期通畅率较低，但其仍被广泛用作CABG的血管通路。移植物动脉化过程中血流动力学应力的急剧增加会导致血管损伤，尤其是内皮损伤，这可能是大隐静脉移植物（SVG）通畅率低的原因之一。本文描述了人源大隐静脉内皮细胞（hSVECs）的分离、鉴定与扩增方法。通过胶原酶消化法分离的细胞呈现典型的铺路石样形态，并表达内皮细胞标志物CD31和VE-钙黏蛋白。为评估机械应力的影响，本研究采用相关方案分别研究剪切应力和牵张力这两种主要物理刺激对动脉化SVG的作用。将hSVECs培养于平行板流动腔中以产生剪切应力，细胞会沿流动方向排列，并上调KLF2、KLF4和NOS3的表达。此外，hSVECs也可培养于可伸展的硅胶膜上，以模拟静脉（低）和动脉（高）水平的牵张力。动脉水平的牵张力可相应地调节内皮细胞的F-肌动蛋白分布和一氧化氮（NO）的分泌。综上所述，我们提供了一种详细的hSVECs分离方法，可用于研究血流动力学机械应力对内皮细胞表型的影响。

通常在提取后3-4天可观察到贴壁的内皮细胞。人阴茎海绵体血管内皮细胞（hSVECs）最初形成细胞簇，并呈现典型的“鹅卵石”样形态（图1B）。这些细胞表达内皮细胞标志物CD31（图1C，D）和VE-钙黏蛋白（VE-cadherin）（图1D）。hSVECs可在未经包被处理的细胞培养皿中轻松传代培养，并可在体外培养中维持内皮细胞表型至第八代。
人小静脉内皮细胞（hSVECs）在剪切应力作用下培养时，会沿流动方向排列（图2A）。20 dyn/cm2的剪切应力作用72小时可诱导典型的机械敏感基因KLF2、KLF4和NOS3的表达，表明剪切刺激在hSVECs中具有有效性（图2B）12,...

我们描述了一种分离和培养人隐静脉内皮细胞（hSVECs）的方案。同时提供了详细的方法，用于施加剪切应力和拉伸力，以研究hSVECs中的机械应力。

冠状动脉旁路移植术（CABG）是一种用于重建缺血心肌血供的手术。尽管……，大隐静脉仍被用作CABG的血管通路。

冠状动脉旁路移植术后，大隐静脉会突然暴露于动脉环境中。了解其对机械应力的适应性反应，可能有助于设计预防静脉移植物失效的治疗手段。该内皮细胞分离方案非常简单，仅需用胶原酶进行孵育即可。通过最小程度的血管操作，可减少平滑肌细胞和成纤维细胞的污染。分离人隐静脉内皮细胞并在剪切应力和周期性拉伸条件下进行培养的方案，对于理解机械力在隐静脉移植失败相关的内皮细胞功能障碍中的作用至关重要。此前的内皮细胞培养在细胞培养基添加剂方面要求非常高。成功分离培养人隐静脉内皮细胞（human SVECs）时，必须添加生长因子。为分离原代人隐静脉内皮细胞或人SVECs，需收集至少2至3厘米长的隐静脉片段。在无菌超净工作台内操作，将静脉片段转移至盛有预热PBS的培养皿中。为了清除管腔内的全部血液，将连接移液器并装有 PBS 的移液器吸头插入静脉的一端，轻轻冲洗。持续冲洗直至冲洗液完全澄清。然后用无菌棉线缝合封闭静脉的一端。用每毫升含1毫克的II型胶原酶溶液小心地填充血管，并用棉线缝合封闭血管的另一端。将含有胶原酶溶液的血管置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润环境中孵育1小时。随后，在15毫升离心管上方剪开血管的一端，收集胶原酶溶液，然后再剪开另一端。用一到两毫升的PBS冲洗管腔表面，以收集管内含有胶原酶的全部脱落内皮细胞。在室温下以400×g离心5分钟。去除上清液后，将细胞沉淀重悬于三到四毫升含额外肝素溶液的完全内皮细胞培养基中。将细胞接种于预先用3%（质量/体积）明胶包被的60毫米细胞培养皿中。在湿润环境中培养细胞4天，期间不更换培养基。之后每隔一天更换一次培养基，但不添加肝素补充物。在显微镜下观察培养板，确保红细胞已被去除。根据静脉段的大小和直径，取材后1至4天内，通过相差显微镜观察人源SVECs，以评估细胞融合程度及其铺路石样形态。每两天更换一次培养基，直至细胞达到70%至80%融合度。用0.1%（重量/体积）明胶包被流室载玻片，并在37摄氏度下孵育至少30分钟。为平衡带有10毫米储液槽的流体单元和无菌灌注装置，请将其在湿润环境中孵育过夜。在剪切应力实验中，将200,000个悬浮于100微升培养基中的内皮细胞接种至明胶包被的流室载玻片中。为使细胞贴附于培养表面，将细胞孵育4小时。将灌注装置放置在流体单元上。用约12毫升预热的完全内皮细胞培养基填充储液器和灌注装置。从灌流装置中去除气泡，使两个储液罐的液面均平衡在五毫升。将流体单元放置在已安装但未插入腔室载玻片的灌流装置上，并将其电源线连接至计算机控制的泵。通过运行泵控制软件中的预设程序，清除储液罐和灌流装置中的所有气泡。将装有灌注装置的流体单元移至超净工作台，并安装带有融合单层细胞的载玻片。将装有载玻片的整个单元放入培养箱后，将其电源线连接至泵。在泵的控制软件中，通过选择载玻片类型并设置培养基黏度来调整流体单元的配置。在流体参数中，输入剪切应力值，并设置循环持续时间和流动类型。然后点击播放按钮以开始实验。请记住，将经过相同培养基处理但未暴露于流动条件下的细胞载玻片作为静态对照。将硅基润滑剂涂抹在25毫米6孔等双轴加载站的顶部和侧面。将400,000个细胞悬浮于3毫升培养基中，接种至已包被I型胶原的6孔弹性底培养板的每个孔内。将细胞置于加湿空气中孵育，直至达到100%汇合度。开始拉伸程序之前，用预热的PBS洗涤细胞一次，并在每个孔中加入三毫升新鲜培养基。将所有已润滑的加载站安装在底板上，放入培养箱中，并将管路正确连接至张力细胞拉伸生物反应器系统的控制器设备。将每块培养板固定在生物反应器系统提供的一个红色垫圈上。然后将它们放入培养箱中的底板上。将全部四个培养皿放置到底板中，以确保实现适当的真空和拉伸载荷。打开控制器设备和计算机系统。打开 FlexCell 控制软件，设置所需的拉伸程序，包括伸长百分比、波形形状、频率和时间。保存该程序。启动真空系统，然后在计算机屏幕上选择该程序并点击开始，以运行拉伸实验。检查硅胶膜是否在运动并拉伸细胞。贴壁的内皮细胞可在提取后4至10天内观察到。它们最初形成具有典型鹅卵石样形态的细胞簇。它们表达内皮细胞标志物CD31和VE-钙黏蛋白。人皮肤微血管内皮细胞（hSVECs）在剪切应力作用下培养时，会沿流动方向排列。20达因/平方厘米的剪切应力作用72小时可诱导典型的机械敏感基因KLF2、KLF4和NOS3的表达，表明剪切刺激有效。环状拉伸的效果取决于施加于人源SVECs的强度。在低拉伸条件下，细胞表现出与静态细胞相似的皮质F-actin结构。在长达72小时的时间内，一氧化氮的释放未发生改变；然而，在24小时后，达到动脉水平的拉伸强度会重塑细胞骨架的肌动蛋白结构，并在72小时后减少NO的释放。除了力学应力研究外，研究人员还可利用分离的细胞采用多种方法，进一步拓展对内皮细胞功能与功能障碍的认识。按照本实验方案，可对任何其他类型的内皮细胞在剪切应力和拉伸条件下进行研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

人隐静脉内皮细胞分离和暴露于受控水平的剪切应力和拉伸

本文首先描述了一种从人脐静脉中分离内皮细胞的实验步骤，然后展示了如何利用这些细胞在流动条件下研究中性粒细胞的跨内皮迁移。通过使用由具有玻璃光学特性的聚合物制成的低体积流动腔室，还可实现对稀有细胞群体的活细胞荧光成像。...

人脐静脉内皮细胞的分离及其在流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移研究中的应用

采用光刻技术蚀刻并由PDMS制成的微流控流动室，用于研究与内皮细胞功能障碍和炎症相关的功能结果。在一个代表性实验中，展示了不同剪切应力对单核细胞黏附于细胞因子激活的内皮细胞单层能力的调节作用。...

芯片上内皮炎症表型分析

导致内膜增生（IH）和静脉移植物失效的机制仍不甚清楚。本研究描述了一种在可控血流和压力条件下灌注人静脉的ex vivo系统，并进一步评估了外部网状加固限制IH发展的有效性。...

人体大隐静脉操作步骤 离体 灌注与外部加固

已知不同水平和模式的流体剪切力可调节内皮细胞的基因表达、表型及其对疾病易感性。本文讨论“剪切环”模型的组装与使用：该模型可产生单向、周期性的剪切应力模式。剪切环结构简单、成本低廉，且可获得较高的细胞产量。...

“剪切环”的组装与应用：一种用于轨道式、单向周期性流体流动和剪切应力研究的新型内皮细胞模型

本文介绍了一种在流体剪切应力条件下培养内皮细胞并进行基因表达分析的工作流程。该流程包括一种物理装置，可在受控环境中同时容纳和监测多个流动腔室，并采用外源性参照RNA进行定量PCR分析。...

使用多个平行板流动腔对暴露于剪切应力下的内皮细胞进行基因表达分析

本实验方案的目的是描述一种改良的平行板流动室，用于研究剪切应力对机械敏感性离子通道的实时激活作用。...

在明确定义的剪切应力下进行单细胞离子电流的电生理记录

本方案描述了一种包被方法，用于在6孔板的特定区域限制内皮细胞生长，以便利用轨道摇床模型施加剪切应力。...

在轨道摇床中于6孔板内分割培养内皮细胞以用于力学生物学研究

本文建立了一种实验方案，用于在暴露于病理性和生理性流体剪切应力条件下的内皮细胞中，通过邻位连接实验（proximity ligation assay,...

利用邻近连接技术在不同流体剪切应力条件下可视化与定量TGFβ/BMP/SMAD信号通路

在此，我们开发了一种人主动脉平滑肌细胞类器官芯片模型，用于模拟 体内...

构建人主动脉平滑肌细胞类器官芯片模型以模拟主动脉壁中的生物力学应变

本文介绍了一种从人类多能干细胞分化获得内皮细胞的简单工作流程，随后详细描述了对其进行机械刺激的实验方案。该方法可用于研究内皮细胞发育过程中的力学生物学特性。此方法适用于对机械刺激后从培养芯片中收集的活细胞进行后续分析检测。...

体外胎儿人源血管芯片模型用于研究发育性机械生物学

学习使用胶原酶分离培养人隐静脉内皮细胞，并通过流体剪切力和循环拉伸装置研究其机械应力响应。该方法有助于深入理解血管内皮功能障碍的分子机制。

人隐静脉内皮细胞的分离及其在可控剪切应力与拉伸条件下的暴露

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