基于卵黄抗体的流式微球阵列检测标准化

在旨在诊断疾病的免疫测定技术中，流式微球阵列法作为一种高灵敏度且可靠的方法脱颖而出，可在单次检测中分析数千个微粒。流式细胞术具有高准确性，加之乳胶微球成本低廉，使得本技术适用于抗体和抗原等免疫测定工具的分析。IgY 抗体成本较低，且在生产过程中具有伦理学优势，可作为罕见疾病检测的工具。

首先将新鲜或孵化四天的Gallus gallus deckle white品系鸡蛋浸入0.2%稀释的次氯酸钠溶液中，用流动水快速冲洗并轻轻擦干。小心敲开鸡蛋，借助蛋黄分离器将蛋黄与蛋清分离。

用滤纸吸除多余的蛋白。刺破蛋黄，将其内容物收集到一个 50 毫升的锥形管中。将蛋黄在 -20 °C 下保存至少 24 小时，然后使用。

解冻保存的蛋黄后，用1毫摩尔的PBS按1比10的比例稀释。用1当量的盐酸将溶液pH值调节至5，并在4摄氏度下孵育6至24小时。在3000 ×g下离心溶液40分钟，用0.7微米的纤维素滤膜过滤收集的上清液，然后将上清液的pH值重新调至5。

在4°C下，边搅拌边加入辛酸，使其终浓度为8.7%，持续搅拌30分钟。将样品在4°C下离心15分钟，分离上清液与沉淀物。使用1摩尔氢氧化钠将溶液的pH值重新调节至7.4。

在将抗体于 -20 摄氏度保存之前，使用 Bradford 法测定其浓度。向 21 µL 的乳胶微珠中加入 21 µL 的 EDC 和 21 µL 的 NHS。再用过滤后的 10 mM PBS 缓冲液定容至终体积 2.1 mL。

将溶液在22摄氏度下快速振荡孵育3小时。向含有100微升该溶液的不同微量离心管中加入先前提取的捕获抗体IgY PfHRP2，并再次孵育16小时。

离心样品并弃去上清液后，使用500微升过滤过的10毫摩尔PBS缓冲液对乳胶微珠进行两次洗涤，每次均通过离心和重悬步骤完成。为封闭微珠，将样品重悬于1毫升封闭缓冲液中，并按照前述相同步骤孵育两小时。用PBS缓冲液洗涤微珠后，再次将其重悬于10毫摩尔PBS缓冲液中。

向每个微量管中加入100 µL荧光标记的抗鸡抗体，该抗体用含BSA的10 mM PBS缓冲液按1:2000比例稀释。将样品在避光条件下孵育30分钟。洗涤磁珠后，用250 µL过滤过的10 mM PBS缓冲液重新悬浮磁珠。

通过将100微升阻断后的珠子工作液分别加入含有不同浓度稀释重组蛋白PfHRP2的试管中（每组设三个重复），测定检测限。将珠子溶液与蛋白在22摄氏度下孵育，快速振荡一小时。随后用500微升过滤后的10毫摩尔PBS缓冲液洗涤珠子，离心，操作步骤如前所述。

弃去上清液后，向每个样品中加入2微克针对重组蛋白的小鼠IgG抗体，该抗体用含BSA的10毫摩尔PBS稀释，随后按相同的孵育程序操作。接着，向每个样品中加入100微升稀释的荧光标记抗小鼠抗体。孵育后，将样品重悬于250微升经滤膜过滤的10毫摩尔PBS中。

打开计算机和流式细胞仪，等待几分钟，使设备与计算机连接。点击计算机上安装的流式细胞分析软件并登录。在软件工作界面中，依次选择细胞仪（Cytometer）、流路启动（Fluidics Startup）、清洗模式（Cleaning Modes）和SIT冲洗（SIT Flush）。

根据阴性对照颗粒的形态学和荧光特性确定设门策略。为分析细胞形态学，选择点图图形，以侧向散射A为Y轴，前向散射A为X轴进行分析。通过侧向散射确定单细胞，使用点图图形，以侧向散射W为Y轴，侧向散射H为X轴进行分析；并通过前向散射确定单细胞，使用点图图形，以前向散射W为Y轴，前向散射H为X轴进行分析。

进行荧光分析时，选择使用前向散射A的FL1点图。取一支带有封口的聚苯乙烯管，其中含有未标记的样本以及先前用单色Alexa Fluor 488标记的样本，并轻轻混匀管内物质。将该管连接至流式细胞仪探头，然后左键点击“采集”。为设定激光功率，点击“参数”，在下方选项中将前向散射电压调节至182伏，侧向散射电压调节至236伏。

设置流式细胞仪的阈值时，点击“Threshold”，在下方选项中将FSC调整为500伏。设置分析门以根据颗粒的大小和复杂性进行表征，并进行单细胞分析。通过分析仅含乳胶微球而不含染料的样本，调整FL1 FITC检测器的电压至332伏，以消除自发荧光。

将荧光分析门设置为四边形格式，从点图中显示的阴性点开始。在调整好形态学和荧光分析参数后，将仪器设置为采集 50,000 个事件，然后点击记录。此处显示的是利用辛酸分离得到的 IgY PfHRP2 抗体的电泳图谱。

从该图可以看出，经辛酸分离前后的抗体表现出相似的电泳图谱，均显示出 65 千道尔顿和 27 千道尔顿的特征条带，分别对应 IgY 的轻链和重链。除此之外，还可观察到其他条带，可能源于卵黄蛋白卵黄高磷蛋白 II 前体的 C 末端片段。评估抗体在乳胶微球上的饱和浓度，对于开发基于微球的免疫测定方法至关重要。

此处展示了不同浓度抗体与每微升商用乳胶微珠偶联后荧光百分比的曲线。随着抗体浓度增加，荧光百分比值也随之上升，并在抗体浓度达到2微克时趋于平稳，因此确定该浓度为靶抗原免疫测定的最佳偶联浓度。通过评估乳胶微珠与不同浓度重组PfHRP2蛋白反应的荧光百分比，确定了检测限。

通过夹心免疫测定法观察到，荧光信号从 0.01 微克的 PfHRP2 蛋白开始增强，并在 0.1 微克时达到平台期。在 0 微克与 0.01 微克之间，荧光信号无显著差异；然而，在 0.01 微克、0.1 微克和 10 微克时，荧光信号均表现出显著差异。

本方案中的洗涤步骤至关重要，可避免微球的丢失。必须明确定义规格参数，以确保获得的结果无误。此处描述的步骤代表了一项重要的标准化操作，对于确保通过流式细胞术评估的乳胶微球诊断检测的可靠性十分必要。

因此，该方法是对经典三明治检测模型的一种替代方案。该方法可应用于多种类型的检测，适用于将多种分子固定在微珠表面，也可用于检测不同的分析物。