Name: 生成用于药物评估研究的 3D 肿瘤微球 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学习构建三维肿瘤微球的标准化方法，结合高通量成像与深度学习分析技术，提升药物测试的准确性与效率。该方法适用于AMG510等靶向药物在NCI-H23细胞球上的评估研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢我们实验室所有成员的重要贡献和建议。本研究得到了江苏省卫生健康委员会重点项目（K2019030）的支持。研究概念化由 C.W. 和 Z.C. 完成，方法学由 W.H. 和 M.L. 完成，调查研究由 W.H. 和 M.L. 完成，数据整理由 W.H.、Z.Z.、S.X. 和 M.L. 完成，初稿撰写由 Z.Z.、J.Z.、S.X.、W.H. 和 X.L. 完成，审稿与编辑由 Z.C. 完成，项目管理由 C.W. 和 Z.C. 完成，经费获取由 C.W. 完成。所有作者均已阅读并同意该手稿的发表版本。

1. 类球体构建
<ol>
	<li>培养板的防粘附处理
	<ol>
		<li>将100 µL防粘附试剂加入48孔U型底培养板的每个孔中，静置10分钟。10分钟后吸除包被试剂，并用无菌PBS洗涤两次。</li>
		<li>将培养板置于培养箱中（37 °C，含5% CO2的湿润空气中）备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞准备、收集与计数
	<ol>
		<li>使用适用于目标细胞的培养基在细胞培养瓶中进行细胞培养（补充表2）。例如，NCI-H23和CT-26细胞使用RPMI 1640培养基，HT-29细胞使用McCoy's 5A培养基。上述两种培养基分别添加10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液（P/S）。</li>
		<li>在增殖期间，将所有细胞维持于标准培养条件（37 °C，含5% CO2的湿润空气中）。以下步骤以NCI-H23细胞系为例进行说明。</li>
		<li>用1×PBS洗涤T25培养瓶中的细胞两次，以去除培养基（建议选择处于对数生长期的细胞，并在细胞融合度达到80%–90%时进行传代）。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2的培养箱中，用1 mL 0.25%胰蛋白酶/EDTA处理扩增后的细胞1–2分钟。在显微镜下观察细胞形态（通常此时细胞呈圆形），随后终止胰酶消化反应。操作时，吸除T25培养瓶中的胰酶/EDTA悬液，并用4 mL新鲜培养基洗涤细胞。</li>
		<li>将全部悬液（5 mL）转移至15 mL离心管中。用1 mL新鲜培养基冲洗残留细胞并加入该离心管。在室温下以186.48 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，向细胞沉淀中加入10 mL新鲜培养基，轻轻吹打至细胞均匀悬浮。</li>
		<li>吸取0.1 mL细胞悬液至新的离心管中，加入0.9 mL新鲜培养基，充分吹打混匀。</li>
		<li>取10 µL细胞悬液进行细胞计数。重复此过程两到三次，取平均值。</li>
		<li>根据步骤1.2.7中获得的细胞浓度，将悬液稀释至最终接种密度为50,000个细胞/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞培养与球体形成
	<ol>
		<li>向48孔U型底培养板的每孔中加入200 µL细胞悬液。</li>
		<li>用密封膜包裹培养板，在室温下以119.35 × g离心5分钟。</li>
		<li>小心将培养板从离心机中取出，撕去保护膜。然后向孔周围水槽中加入5–8 mL无菌水（防止蒸发），并在37 °C培养5天。在此期间不得向水槽中添加或更换水分。</li>
		<li>在接下来的5天内观察细胞聚集情况。 
		注：通常情况下，细胞在5天内开始聚集成团。然而，不同细胞类型和细胞密度可能导致球体形成速度加快或减慢。因此，必须每天通过以下三种方法之一观察细胞状态。第一种方法是透过培养板底部观察：当细胞尚未形成球体时，可见单层细胞贴附于孔底；当形成球体后，可在每个孔的U型底部观察到致密的三维结构。第二种方法是在显微镜下检查细胞：当细胞形成肿瘤球体时，其结构由外向内分为三层（增殖层、静止层和坏死核心），并呈现透明度梯度。第三种方法是观察培养基颜色变化，这在使用数码显微镜仍无法清晰辨认三层结构时尤为有用。当培养基颜色由紫红色变为黄色时，即可开始进行凝胶包埋操作。在细胞聚集期间不得更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶包埋 
	注：凝胶需储存于−20 °C以下温度环境中。特别应注意将凝胶远离冰箱门放置，以避免温度波动。此时凝胶处于冷冻状态。
	<ol>
		<li>从−20 °C冰箱中取出冷冻凝胶，并在整个实验过程中将其置于冰盒上。</li>
		<li>在显微镜下观察细胞球体。在开始凝胶包埋前，应再次使用数码显微镜检查球体状态。</li>
		<li>小心吸除每孔中150 µL培养基。操作时培养板也应置于冰盒上。</li>
		<li>通过预冷的移液枪头沿孔壁缓慢加入液态凝胶，同时移动枪头在孔内及周围旋转，使每个球体被凝胶包埋。等待5分钟后，若凝胶未均匀扩散，可用10 µL移液枪头轻轻吹打凝胶。每孔包含一个肿瘤球体、25 µL 3.5 mg/mL凝胶和50 µL完全培养基。对照组同样需加入75 µL培养基。 
		注：每孔含一个球体。</li>
		<li>将培养板在37 °C孵育30分钟，直至水凝胶完全形成。在显微镜下确认凝胶化状态。</li>
		<li>向每个样本孔中覆盖125 µL新鲜培养基。</li>
		<li>继续培养球体7–10天。每组设置4–6个孔，至少选择其中三个孔用于后续分析。 
		​注：若进行药物测试，应为同一样本设置两组。一组用于活力检测，另一组用于成像与分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 药物处理
<ol>
	<li>根据制造商说明书溶解药物。使用DMSO配制100倍工作液。通过连续稀释法至少配制五种不同浓度的药物。此处以肺癌治疗药物AMG 510为例。其组成见补充表1。</li>
	<li>使用0.1% DMSO作为阳性对照。</li>
	<li>向每个孔中加入125 µL含药培养基，然后将培养板放回培养箱中（37 °C、含5% CO2的湿润空气环境）。此时，每个孔包含一个肿瘤类球体、25 µL浓度为3.5 mg/mL的凝胶以及175 µL培养基。对照组孔中含有200 µL培养基。</li>
</ol>
3. 类球体活力检测
<ol>
	<li>根据制造商的说明书，使用阿玛蓝（Alamar Blue）检测试剂盒测定类球体的活力。在阿玛蓝处理后，使用微孔板光度计（在570 nm和600 nm处测定吸光度）测定活力。</li>
	<li>分别在类球体包埋于凝胶后的第1天、第4天、第7天和第10天测定活力，或按指定时间点进行。 
	注意：使用阿玛蓝检测时，至少需要16小时的反应时间。因此，应在第0天、第3天、第6天和第9天的下午各加入20 µL阿玛蓝溶液。</li>
	<li>从每个孔中吸取100 µL上清液转移至新的检测板中，并向培养板的每个孔中加入80 µL新鲜培养基。随后，再更换100 µL药物处理培养基。确保孔中无残留的阿玛蓝。 
	​注意：每次测定活力时均需进行培养基更换，且用于成像分析组的药物处理培养基也需在同一天更换。</li>
</ol>
4. 药物测试中通过图像进行类球体观察和深度学习分析
<ol>
	<li>成像
	<ol>
		<li>吸出 100 µL 成像前将培养基吸出。</li>
		<li>将培养板置于载物台上。使用配备10倍物镜（先使用2倍物镜）的自动显微镜获取类球体的数字图像。该显微镜可自动对焦并居中定位这些类球体。 
		注意：自动对焦功能及其所使用的算法此前已由 Yazdanfar 等人报道。17.</li>
		<li>等待自动成像。每个球状体采集四幅图像，通过高内涵成像系统连接的软件生成并处理整合图像。</li>
		<li>单击“图像块处理”按钮，并在软件中选择已整合的图像。</li>
		<li>选择“U-NET模型”，并输入转换率（10倍物镜图像的转换率为3.966）。点击屏幕下方底部以开始图像处理。随后，将直径、周长和粗糙度数据保存至电子表格软件中。</li>
		<li>计算多余周长指数（EPI）。EPI 是类球体周长与P0）以及等效周长（Pe），根据公式1计算。使用Image J测量类球体在焦平面的面积（S），然后根据公式2计算类球体的等效周长。 
		EPI = (Po− Pe)/Pe       (公式 1) 
		<img alt="周长计算公式，Pe = 2π√(S/π)；几何分析的数学公式。" src="/files/ftp_upload/65125/65125eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">      (公式 2) 
		注意：类球体的周长由基于开发的U-NET模型的深度学习算法软件自动生成。</li>
		<li>添加 100 µL 新鲜培养基加入药物后，将培养板放回培养箱（37 °C 在含5% CO₂的湿润空气中2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类球体抑制
	<ol>
		<li>使用公式 3 计算肿瘤生长抑制率（TGI）。相对类球体体积（RTV）为终末体积与初始体积之比（公式 4）。类球体体积（V）由软件根据类球体直径输出，按公式 5 自动计算得出。 
		TGI = (RTV对照− RTV治疗)/RTV对照 × 100% （公式 3） 
		RTV = V末端/原始       (公式 4) 
		V = 4/3π(d/2)3      (公式 5) 
		注意：TGI 是相对于参考值获得的 在体 生长抑制，肿瘤重量被替换为RTV。RTV对照 对照组的相对类球体体积，RTV治疗 是药物测试组的相对类球体体积，V末端 为类球体在最后一天的体积，V原始 为类球体在培养第一天的体积，且 d 表示球状体的直径。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carioli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+cancer+mortality+predictions+for+the+year+2021+with+focus+on+pancreatic+and+female+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer.</a> Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).</li>
<li>Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+in+cancer+biology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">CRISPR in cancer biology and therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).</li>
<li>Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-Ts%3A+New+perspectives+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy.</a> FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).</li>
<li>Shokooohi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+targeted+therapy+and+immunotherapy+on+advanced+nonsmall-cell+lung+cancer+outcomes+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world.</a> Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).</li>
<li>Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+to+target+RAS+signaling+in+human+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy.</a> Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116(2021).</li>
<li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186(2020).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).</li>
<li>Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stretchable+scaffold+with+electrochemical+sensing+for+3D+culture%2C+mechanical+loading%2C+and+real-time+monitoring+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells.</a> Advanced Science. 8 (13), 2003738(2021).</li>
<li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+multidrug+resistance+transporter+P-glycoprotein+in+multicellular+tumor+spheroids+by+hypoxia-inducible+factor+%28HIF-1%29+ad+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species.</a> FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).</li>
<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+How+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+spheroids+for+the+prediction+of+the+effects+of+radiation+and+hyperthermia+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments.</a> Scientific Reports. 10, 1653(2020).</li>
<li>Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer.</a> Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+The+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li>
<li>Carragher, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerns%2C+challenges+and+promises+of+high-content+analysis+of+3D+cellular+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models.</a> Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606(2018).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+morphological+and+physiological+monitoring+of+three-dimensional+tumor+spheroids+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59020(2019).</li>
<li>Yazdanfar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+robust+image-baed+autofocusing+for+digital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy.</a> Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+evaluation+of+tumor+spheroid+behavior+in+3D+culture+using+deep+learning-based+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition.</a> Biomaterials. 22 (272), 120770(2021).</li>
<li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 603640(2020).</li>
<li>Anastasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+factors+shaping+the+cancer+metabolism+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape.</a> British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+clinical+significance+of+mechanical+tumor+microenvironment%3A+Cancer+cell+sensing%2C+mechanobiology+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Communications%22%5BJournal%5D)">Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis.</a> Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).</li>
<li>Zhu, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+KRAS+cancers%3A+From+druggable+therapy+to+druggable+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 159(2022).</li>
<li>Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+in+vitro+tumor+models+for+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy.</a> Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).</li>
<li>Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hanging-drop+multicellular+spheroids+as+a+model+of+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis.</a> Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).</li>
<li>Costa, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroids%3A+An+overview+on+the+tools+and+techniques+used+for+their+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis.</a> Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).</li>
<li>Sant, S., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+3D+tumor+spheroids+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 6, 19103(2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

微环境在肿瘤生长中起着重要作用。它可能影响细胞外基质的提供、氧浓度梯度、营养供应以及机械相互作用，从而影响肿瘤细胞的基因表达、信号通路及多种功能19,20,21。在许多情况下，二维（2D）细胞培养无法产生此类效应，甚至可能产生相反的效果，从而影响对药物治疗的评估。然而，三维（3D）模型的出现解决了这一问题。例如，我们对AMG510在肺癌治疗体系中作用的评估即通过3D方法完成。我们构建了一种3D肿瘤类球体-细胞外基质（TSE）模型，将肿瘤类球体包埋于凝胶中，以监测AMG510对一种与肺癌相关的侵袭性细胞系的作用。AMG510是一种靶向G12C突变型KRAS的新抑制剂22，我们的研究发现证实了其有效性，即部分携带该突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者对此药物有响应。根据我们一系列实验数据与分析，可得出一些极具价值的结果：与2D培养条件相比，在3D类球体条件下，细胞对AMG510的敏感性显著增强，而在低氧条件下...

癌症是人类最恐惧的疾病之一，主要因其高死亡率1近年来，随着新疗法的引入，癌症治疗的可能性已显著增加2,3,4,5二维（2D）和三维（3D） 体外 模型被用于在实验室环境中研究癌症。然而，二维模型无法即时且准确地评估所有能够指示抗肿瘤敏感性的重要参数；因此，它们无法充分模拟 体内 药物治疗测试中的相互作用6.
自2020年以来，全球三维（3D）培养市场得到显著推动。根据纳斯达克OMX的一份报告，到2025年底，全球3D细胞培养市场的价值将超过27亿美元。与二维（2D）培养方法相比，3D细胞培养具有诸多优势特性，不仅可在增殖和分化方面进行优化，还可实现长期存活7,8通过这些方法， 体内 可以模拟细胞微环境，以获得更准确的肿瘤特征描述以及代谢谱型，从而更深入地理解基因组和蛋白质的改变。因此，三维检测系统应被纳入主流药物研发流程，特别是针对新型抗肿瘤药物的筛选与评价。永生化细胞系或原代细胞培养在三维球状结构中的生长具有 体内 肿瘤的特征，如缺氧、药物渗透性，以及细胞间的相互作用、应答和耐药性，可被视为进行研究的严格且具有代表性的模型 体外 药物筛选9,10,11.
然而，这些三维培养模型也存在一些问题，可能需要一段时间才能解决。尽管可以使用这些方案形成细胞球，但它们在某些细节上存在差异，例如培养时间或包埋凝胶12，因此所构建的细胞球难以在严格限定的尺寸范围内实现良好控制。细胞球的尺寸可能会影响活力检测和成像分析的一致性。此外，生长微环境和生长因子也各不相同，可能导致细胞分化差异，从而产生不同的形态特征13。目前迫切需要一种标准化、简单且成本效益高的方法，以构建尺寸可控的各类肿瘤模型。
从另一个角度来看，尽管已有均相检测法和高内涵成像方法用于评估形态、活力和生长速率，但由于文献中报道的多种原因，三维模型的高通量筛选仍然面临挑战，例如肿瘤类球体在位置、大小和形态上缺乏一致性14,15,16。
在本方案中，我们列出了构建三维肿瘤球体的每一步骤，并介绍了一种利用高通量、高内涵成像系统对球体进行观察和分析的方法，该系统具备自动对焦、自动成像及分析等多种优势特性。我们展示了该方法能够生成大小均一的三维肿瘤球体，适用于高通量成像分析。这些球体对抗癌药物处理具有高度敏感性，且可通过高内涵成像技术监测其形态学变化。综上所述，我们验证了该方法在生成用于药物评价的三维肿瘤模型方面的稳健性和可靠性。

<table><tbody><tr><td>0.5-10 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>AXYGEN</td><td>T-300</td><td></td></tr><tr><td>1.5&amp;nbsp;mL 耐煮微型离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&amp;mu;L 移液器吸头</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Nest</td><td>601052</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>AXYGEN</td><td>T-200-Y</td><td></td></tr><tr><td>3D 凝胶</td><td>Avatarget</td><td>MA02</td><td></td></tr><tr><td>48 孔 U 型底板</td><td>Avatarget</td><td>P02-48UWP</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Nest</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>刃天青（Alamar Blue）</td><td>Thermo</td><td>&amp;nbsp;DAL1100</td><td></td></tr><tr><td>防黏附冲洗液</td><td>STEMCELL</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>认证胎牛血清（FBS）</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>aladdin</td><td>W433884-500ml</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Excel 软件&amp;nbsp;</td><td>Microsoft Office</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件&amp;nbsp;</td><td>GraphPad Software&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高内涵成像仪及 SMART 系统</td><td>Avatarget</td><td>1-I01</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒-A 添加剂（100X）</td><td>Gibco</td><td>51300-044</td><td></td></tr><tr><td>封口膜（Parafilm）</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Scientific Fluoroskan Ascent 荧光酶标仪</td><td>Thermo</td><td>Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td>T25 培养瓶</td><td>JET Biofil</td><td>TCF012050</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶，0.25%（1X）</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr></tbody></table>

用于药物评价研究的三维肿瘤球体的生成

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

近几十年来，除了单层培养的细胞外，三维肿瘤球体也被开发为一种潜在的强大工具，用于评估抗癌药物。然而，传统的培养方法无法在三维层面上以均一的方式操控肿瘤球体。为解决这一局限性，本文介绍了一种构建大小均一的肿瘤球体的简便且有效的方法。此外，我们还描述了一种基于人工智能分析软件的图像分析方法，该方法能够扫描整块培养板并获取三维球体的数据。我们研究了多个参数。通过采用标准化的肿瘤球体构建方法以及高通量成像与分析系统，可显著提高在三维球体上进行药物测试的有效性和准确性。

图1A,B 展示了本研究中构建肿瘤球体的过程。我们首先将细胞接种于48孔U型底培养板中。此步骤与二维细胞培养所用方法几乎相同。将培养板置于普通培养箱中，并在孔周围保留水以维持湿度，使贴壁细胞开始通过自组装过程形成球体。在常规操作条件下，当使用特定培养基时，大多数类型的肿瘤球体在5天后即可完全形成（补充表 2）。我们使用数码显微镜在5天内检查了球状体构建的情况（图1D）。生长过程结束后，向每个孔中的单个球体加入凝胶包裹，从而形成一个 体内类细胞外基质（ECM）以包裹每个球状体。随后进行药物测试。由于我们采用了配备深度学习分析软件的高内涵成像系统（图1C），我们可以清楚地观察到单个球状体的生长（图1E）并获取合适的参数值，以确定药物治疗期间的特性，包括活力、直径和粗糙度。
<p class="jove_conte...

本文展示了一种构建三维肿瘤球体的标准化方法。同时介绍了一种利用自动化成像系统对球体进行观察及基于图像的深度学习分析的策略。

近几十年来，除了单层培养的细胞外，三维肿瘤球体已被开发为一种潜在的有力工具，用于……

本方案展示了一种构建球形三维肿瘤的标准化方法。该方法可对三维肿瘤结构进行高通量、高内涵分析。通过采用标准化的肿瘤球体构建方法以及高通量成像与分析系统，可显著提高基于三维球体进行药物测试的有效性和准确性。在本实验方案中，我们以AMG510处理NCI-H23细胞球为例。通过实验可观察到靶向抗癌药物对肿瘤细胞球具有显著作用。首先，用移液器将100 µL抗黏附试剂加入48孔圆底U型板的每个孔中，孵育10分钟。孵育10分钟后，吸除包被试剂，并用无菌PBS洗涤两次。将培养板置于含5%二氧化碳的湿润化空气中，37摄氏度培养箱中保存备用。在显微镜下观察细胞。然后，用 PBS 将 T25 培养瓶中培养的细胞洗涤两次，以去除培养基，并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 溶液处理扩增的细胞 1 至 2 分钟。在显微镜下观察细胞形态变化。随后，吸除 T25 培养瓶中的胰蛋白酶 EDTA 悬浮液，并用 4 毫升新鲜培养基洗涤细胞，以终止胰蛋白酶消化反应。将全部悬液转移至一个15毫升离心管中，用1毫升新鲜培养基冲洗残留的细胞，并将其加入该离心管中。在室温下以186.48 ×g离心5分钟，弃去上清液。向细胞沉淀中加入10毫升新鲜培养基，轻轻吹打至细胞形成均一的悬液。吸取0.1毫升细胞悬液至新的离心管中。加入0.9毫升新鲜培养基，然后充分吹打混匀悬液。取10微升细胞悬液用于细胞计数。重复此过程一至两次，并取平均值。将悬浮液稀释至最终接种密度为每毫升50,000个细胞。随后，向48孔U型底培养板的每孔中加入200微升细胞悬液。用封口膜包裹培养板，在室温下以119.35 G离心五分钟。离心后，撕去保护膜，并向孔周围的水通道中加入五至八毫升无菌水。将培养板在37摄氏度下孵育五天。在此期间，切勿向水通道中添加或补充任何水分，并在接下来的五天内观察细胞聚集情况。进行凝胶包埋时，从零下20摄氏度冰箱中取出冷冻凝胶后，应将其始终放置在冰盒上直至实验结束。在显微镜下观察细胞球体。在开始凝胶包埋之前，应再次检查类球体的状态。小心移除150微升培养基，然后从孔壁一侧缓慢加入液态凝胶，同时移动预冷的移液枪头在孔内及孔壁周围，将每个类球体包埋于凝胶中。等待5分钟，若凝胶未均匀扩散，可用10微升移液枪头轻轻吹打凝胶。每个孔包含一个肿瘤类球体、25 微升浓度为 3.5 毫克/毫升的凝胶以及 50 微升完全培养基。同样向对照组中加入 75 微升培养基。将培养板置于 37 摄氏度孵育 30 分钟，直至水凝胶完全形成。在显微镜下确认凝胶状态。每个样本上覆盖 125 微升新鲜培养基，将类球体继续培养 7 至 10 天。每组类球体设置 4 到 6 个孔，并从中选择至少 3 个孔进行分析。根据制造商说明书溶解药物，并用DMSO配制100倍工作液。以0.1% DMSO作为阳性对

generation-of-3d-tumor-spheroids-for-drug-evaluation-studies

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

生成用于药物评估研究的 3D 肿瘤微球

我们介绍一种利用市售微孔板生成大量（数千至数十万个）尺寸和组分均一可控的肿瘤类球体的实验方案。...

使用微孔板大规模制备尺寸可控的肿瘤球体

侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。...

三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

本文介绍了一种利用水相两相系统在96孔板高通量格式中进行癌细胞球体机器人打印的实验方案。...

利用水相两相系统进行癌症细胞球体的机器人化生产以用于药物测试

利用三维人类生物凝胶培养系统，可将多形性胶质母细胞瘤的患者来源异种移植瘤微型化为活体微肿瘤。这种模拟体内环境的三维肿瘤检测方法适用于药物反应测试和分子谱型分析，包括激酶组学分析。...

利用三维人类生物凝胶培养系统和患者来源的胶质母细胞瘤细胞生成微肿瘤用于激酶组学分析和药物反应测试

在多种疾病适应症中，越来越多具有更高生理相关性的模型正被开发并应用于药物发现项目。本文所述的新型模型系统展示了如何在高通量的1536孔板系统中培养和筛选三维肿瘤球体，以寻找新的肿瘤学药物。...

用于药物筛选的高通量三维肿瘤球体的生成

光学相干断层扫描（OCT）是一种三维成像技术，可用于监测和表征多细胞肿瘤球体的生长动力学。本研究展示了基于体素计数法对肿瘤球体进行精确的体积定量分析，并利用内源性光学衰减对比实现无需标记的球体内坏死组织检测。...

利用光学相干断层扫描对三维肿瘤球体进行长期形态学与生理学监测

本方案描述了患者来源类球体的生成及后续分析，包括增殖定量、细胞毒性检测、流式细胞术、免疫荧光染色和共聚焦成像，以评估候选药物作为抗肿瘤治疗剂的潜力。该方案有助于精准医疗，可为每位患者及疾病阶段确定特定药物。...

用于靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选的生理性患者来源三维球体

全面的 体外 缺乏能够真实再现相关人类疾病的模型。本研究介绍了三维（3D）肿瘤球体的构建与培养，一种可靠的 体外...

一种用于研究肝细胞癌中肿瘤-间质相互作用的三维球状模型

本实验方案描述了如何从原代癌细胞生成三维肿瘤培养模型，并通过细胞活力检测和显微镜观察评估其对药物的敏感性。...

建立源自患者肿瘤样本的三维肿瘤球体并评估其对药物的敏感性

本文介绍一种用于鉴定可调节ADCC机制化合物的方法，ADCC是抗肿瘤抗体杀伤癌细胞的重要机制。通过该方法，在存在曲妥珠单抗（Trastuzumab）的条件下，检测自然杀伤（NK）细胞对乳腺癌细胞球状体的细胞毒性作用。图像分析可识别球状体中存活和死亡的效应细胞及靶细胞。...

在肿瘤类球体模型中定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性：用于药物发现的应用

学习构建三维肿瘤微球的标准化方法，结合高通量成像与深度学习分析技术，提升药物测试的准确性与效率。该方法适用于AMG510等靶向药物在NCI-H23细胞球上的评估研究。

用于药物评价研究的三维肿瘤球体的生成

探索更多视频