Name: 在二氧化硅暴露小鼠模型中使用尼古丁促进肺上皮-间充质转化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 探索尼古丁与二氧化硅联合暴露小鼠模型，通过皮下注射和鼻腔滴注建立肺纤维化研究方法。该模型可模拟上皮-间充质转化过程，为肺疾病机制研究提供可靠实验基础。

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本研究由安徽省高校协同创新计划项目（GXXT-2021-077）和安徽理工大学研究生创新基金（2021CX2120）资助。

所有操作均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NRC 第8版）发布的指南进行，并经安徽科技大学动物伦理委员会批准。
1. 动物准备
<ol>
	<li>将32只8周龄雄性C57/BL6小鼠饲养在具有12小时光照/12小时黑暗循环的实验室中。确保小鼠可自由获取食物和水。</li>
	<li>经过2周环境适应后，当10周龄小鼠体重达到23–26 g时，使用计算机生成的随机数字将动物随机分为四组，不进行区组划分，分别为：对照组（Con）、尼古丁组（Nic）、二氧化硅组（SiO2）以及尼古丁联合二氧化硅组（Nic+ SiO2）。</li>
</ol>
2. 尼古丁溶液的配制
注意：尼古丁的密度为 1.01 g/mL。
<ol>
	<li>将尼古丁溶解于无水乙醇中，并稀释20倍，配制浓度为50 mg/mL的尼古丁储备液。</li>
	<li>用无菌生理盐水将尼古丁储备液稀释1,000倍，得到浓度为0.05 mg/mL的工作溶液。 
	&#8203;注意：尼古丁需避光保存。储备液可在4 °C下保存最多1周。</li>
</ol>
3. 二氧化硅制备
<ol>
	<li>将无菌结晶二氧化硅悬浮于生理盐水中，配制浓度为20 mg/mL的二氧化硅悬浮液，并在超声振荡水浴中震荡25分钟。</li>
	<li>在给予小鼠鼻滴之前，先用涡旋振荡器震荡二氧化硅悬浮液3 min。用200 µL移液器上下吹打2–3次混匀二氧化硅悬浮液，然后吸取50 µL用于鼻滴。 
	注意：二氧化硅悬浮液应在混合后立即给药 通过 尽快处理鼻腔滴漏。</li>
</ol>
4. 小鼠捕获与尼古丁暴露
<ol>
	<li>称量小鼠体重，并在每次暴露前每日记录体重。</li>
	<li>在第1–40天期间，对尼古丁组（Nic）和尼古丁+二氧化硅组（Nic+ SiO2）的小鼠每天皮下注射两次尼古丁（间隔12小时）。尼古丁剂量为0.25 mg/kg；例如，确保一只体重为25 g的小鼠接受6.25 µg的尼古丁。对于该小鼠，注射体积计算如下：6.25/0.05 = 125 µL。同时，向对照组（Con）小鼠注射等体积的生理盐水。</li>
	<li>为每组准备所需的1 mL注射器，并用其吸取相应体积的尼古丁或生理盐水。在吸取尼古丁前，先将0.1–0.2 mL空气吸入注射器，然后吸取125 µL尼古丁。轻轻敲击注射器，使尼古丁充满针头及注射器前端。将含尼古丁的注射器置于避光托盘中。 
	注意：注射时，0.1–0.2 mL空气位于尼古丁后方，以确保所有液体均成功注入小鼠体内。</li>
	<li>用右手抓住小鼠尾巴，待动物放松后，用左手拇指和食指从尾部向头部方向按压颈部背部皮肤，直至耳缘处，施加适度压力。随后松开右手，用左手小指和无名指夹住尾巴及后肢，此时小鼠将完全由左手固定。 
	注意：抓握小鼠力度应适中。力量不足易导致小鼠咬人，而力量过大则可能导致小鼠窒息。</li>
	<li>用右手持注射器，沿头至尾方向刺入小鼠耳缘附近颈部背部皮肤，以均匀速度注入尼古丁。观察是否出现半圆形皮肤隆起，以确认注射成功。 
	注意：当针头刺入皮肤时，会有阻力感；针头完全插入后阻力消失。此时需稍许回撤针头，再缓慢且均匀地进行注射。</li>
</ol>
5. 二氧化硅暴露 体内
<ol>
	<li>在第5-19天，向SiO2组和Nic+ SiO2组小鼠的鼻腔内滴注二氧化硅悬浮液。使用麻醉机以3.6 mL/h的流速，通过2%异氟烷快速麻醉每只小鼠。麻醉后，将小鼠置于一只手的掌心，暴露其鼻腔，并在4-8秒内向鼻腔滴注50 µL二氧化硅悬浮液。</li>
	<li>为使二氧化硅悬浮液尽快进入肺部，在滴注后用食指轻轻按压小鼠心脏部位3-5秒，频率为每秒3-5次，以促进其呼吸频率。</li>
	<li>待小鼠呼吸逐渐恢复均匀后，将其放入笼中观察3分钟。</li>
	<li>对所有接受二氧化硅悬浮液处理的小鼠重复步骤1-3。对照组小鼠在第5-19天向鼻腔内滴注50 μL无菌生理盐水。</li>
</ol>
6. 获取新鲜和固定的肺组织
<ol>
	<li>第41天，根据小鼠体重，按0.1 mL/20 g的剂量，使用50 mg/kg的戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉&#160;小鼠。将四肢固定于泡沫板上，并用75%酒精喷洒毛发。</li>
	<li>进行&#160;心脏灌注以获取新鲜肺组织，沿腹部正中线剪开暴露胸腔，在右心尖处剪一小孔。随后，从左心尖缓慢均匀地注入20 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS），使血液从右心尖处的小孔流出。取出整个肺叶，置于预冷的1.5 mL离心管中，转移至−80 °C保存，待后续进行蛋白提取。</li>
	<li>对其他小鼠在同一位置先灌注20 mL预冷PBS，再灌注10 mL 4%多聚甲醛以固定全肺；每只肺组织置于30 mL 4% PFA中保存。</li>
	<li>72小时后，将固定好的肺组织进行石蜡包埋。
	<ol>
		<li>将肺组织置于40 °C超声水浴中的固定液中浸泡30分钟，随后依次在75%乙醇、95%乙醇和无水乙醇中各脱水50分钟。</li>
		<li>用二甲苯洗涤2次，每次50分钟。</li>
		<li>将组织置于55–60 °C熔化的石蜡中2–3小时，使肺组织中的二甲苯逐渐被石蜡取代。</li>
		<li>将肺组织置于包埋框中用石蜡固定，待蜡块完全硬化后，使用石蜡切片机将肺组织切成4–5 µm厚的切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将肺组织切片置于45 °C超纯水中，待石蜡完全融化后，将切片转移至防脱载玻片上。</li>
</ol>
7. 苏木精-伊红（HE）染色
<ol>
	<li>将切片在 60 °C 下烘烤 2 小时，然后将切片放入二甲苯中脱蜡，每次 30 分钟，共 2 次。随后，将切片依次放入无水乙醇、95% 乙醇、85% 乙醇和 75% 乙醇中，每种浓度各 5 分钟。最后，用超纯水洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用移液枪向肺组织滴加 50 µL 苏木精染色液，染色 5 分钟；然后用流水冲洗切片 5 分钟。</li>
	<li>向切片上加入 50 µL 2% 乙醇盐酸溶液，用蒸馏水冲洗 30 秒。然后向肺组织滴加 50 µL 伊红染色液，染色 1 分钟。</li>
	<li>对石蜡切片进行脱水、透明化和封片。
	<ol>
		<li>在组合塑料染色缸中分别加入 100–150 mL 的 75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇、无水乙醇和二甲苯。将切片依次放入 75%、85%、95% 和无水乙醇中，每种溶液中脱水 5 分钟。</li>
		<li>然后将切片放入二甲苯中透明化 5 分钟。</li>
		<li>最后，在肺组织切片上滴加 20 µL 中性树胶，盖上盖玻片封片。 
		&#8203;注意：上述步骤均在室温下进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 马松染色
<ol>
	<li>脱蜡、水化并清洗石蜡切片，操作步骤如第7.1步所述。</li>
	<li>用50 µL配置好的Weigert氏苏木精染色液染色7分钟，随后用50 µL酸性乙醇分色液处理10秒，再用流水冲洗使细胞核呈蓝色。</li>
	<li>用50 µL马松三色染色液染色4分钟，然后用水清洗。</li>
	<li>用蒸馏水冲洗切片1分钟，然后用丽春红酸性品红染色7分钟。</li>
	<li>依次用弱酸工作液（30%盐酸）洗涤1–2分钟，磷钼酸溶液处理1–2分钟，再用弱酸工作液洗涤1–2分钟。</li>
	<li>将切片置于苯胺蓝染色液中染色2分钟，然后用弱酸工作液洗涤1分钟。</li>
	<li>依次用95%乙醇和无水乙醇脱水各1&#160;s，二甲苯透明1 s，最后按第7.4步所述方法用中性树脂封片。</li>
</ol>
9. 免疫组织化学
<ol>
	<li>将切片在 60 °C 下烘烤 6 小时。按照步骤 7.1 所述方法进行脱蜡、水化并清洗石蜡切片。</li>
	<li>抗原修复：将切片放入耐热塑料切片盒中，加入足量的柠檬酸抗原修复液以完全浸没切片，煮沸 20–30 分钟。</li>
	<li>冷却至室温，取出切片，用去离子水冲洗。随后在含 0.5% Tween-20 的 PBS（PBST）中浸泡 2 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>用疏水笔在载玻片上的肺组织切片周围画一圈封闭的疏水环。</li>
	<li>向切片上滴加 50 µL 3% 过氧化氢溶液（3% H2O2），室温避光孵育 15 分钟，以灭活内源性过氧化物酶。</li>
	<li>将切片在 PBST 中浸泡 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>向切片上滴加 50 µL 5% 牛血清白蛋白（BSA）-PBST 溶液，室温封闭 1 小时。</li>
	<li>弃去封闭液，向切片上滴加 50 µL 稀释后的一抗 CD206（稀释比例：1:1,500）、TGF-β1（稀释比例：1:200）和波形蛋白（vimentin，稀释比例：1:2,000），4 °C 过夜孵育。 
	注：本实验中所有抗体均用 5% BSA 溶液稀释。</li>
	<li>次日将切片恢复至室温（约 40 分钟），按步骤 9.6 所述方法清洗切片。</li>
	<li>用 5% BSA 溶液稀释二抗，向切片滴加 50 µL 辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释比例：1:500），室温孵育 1 小时，然后按步骤 9.6 所述方法清洗切片。</li>
	<li>向肺组织切片滴加 50 µL 对应酶标二抗的 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色液，在避光湿盒中孵育 5–10 分钟，显微镜下观察至出现明显棕褐色着色为止，随后用蒸馏水冲洗终止反应。 
	注：棕褐色着色视为阳性染色。</li>
	<li>滴加 50 µL 苏木精染液染色 30 秒，流水冲洗。随后将切片依次浸入 75%、85%、95% 及无水乙醇中，各 3 分钟，再放入二甲苯中处理 2 次，每次 10 分钟。按步骤 7.4 所述方法封片。</li>
</ol>
10. 蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>从冷冻箱中取出肺组织并称重。每20 mg肺组织加入150 µL含有PMSF的RIPA裂解缓冲液。使用手持式匀浆器在冰上裂解小鼠肺组织3-5分钟，于4 °C轻轻振荡2小时以充分裂解肺组织，然后在4 °C、14,800 × g条件下离心15分钟，收集上清液。 
	注意：使用RIPA裂解缓冲液前数分钟加入100 mM苯甲基磺酰氟（PMSF），PMSF终浓度为1 mM（例如，10 µL PMSF + 990 µL RIPA）。</li>
	<li>按照BCA蛋白浓度检测试剂盒的说明书测定样品的蛋白浓度。测定后，以蛋白裂解液中最低的蛋白浓度为基准，用RIPA缓冲液将同一批次的蛋白裂解液稀释至相同浓度，使各样品的蛋白质量和体积一致。 
	注意：上样肺组织总蛋白量为30 µg。</li>
	<li>向160 µL蛋白裂解液中加入40 µL 5x上样缓冲液，在100 °C加热10分钟。</li>
	<li>将预先制备好的10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）装入Western blot电泳系统，加入SDS-PAGE电泳缓冲液，轻轻拔出梳子，每孔缓慢、均匀地加入20 µL蛋白样品。接通电源，以80 V电泳30分钟；当蛋白质进入分离胶后，切换至100 V，继续电泳60-70分钟。 
	注意：电泳需使用新鲜配制的电泳缓冲液。</li>
	<li>采用湿法转膜将蛋白转移至PVDF膜。预先用甲醇活化PVDF膜（5-30秒）。取出电泳凝胶板，小心撬开，将凝胶放入湿转缓冲液中，制备电转“三明治”结构，并组装湿转系统。电泳槽中加满转移缓冲液，在400 mA条件下转膜90分钟。 
	注意：转移缓冲液需预先冷却，以避免湿转过程中高温对结果的影响。</li>
	<li>用含0.5% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBST）清洗PVDF膜，每次5分钟，共洗3次。用TBST稀释的5%脱脂奶粉封闭PVDF膜，室温摇床孵育60分钟；然后用TBST清洗2分钟。清洗后，加入用5% BSA稀释的一抗vimentin（1:5,000）和GAPDH（1:10,000），4 °C孵育过夜。</li>
	<li>将膜置于室温30分钟，用TBST清洗5次，每次5分钟。清洗后，加入用5%脱脂奶粉稀释的二抗（1:10,000），室温孵育60分钟。</li>
	<li>将膜蛋白面朝上平放，滴加配制好的ECL工作液，孵育1-2分钟，使用凝胶成像仪观察结果。通过凝胶成像仪软件测得的灰度值评估蛋白表达水平。 
	注意：本实验中GAPDH作为内参蛋白。</li>
</ol>

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<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica+particles+disorganize+the+polarization+of+pulmonary+macrophages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364(2020).</li>
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</ol>

所有作者均声明不存在利益冲突。

为了研究尼古丁与结晶型二氧化硅同时暴露的作用及其潜在机制，需要建立一种双重暴露的动物模型。本研究通过皮下注射尼古丁和鼻腔滴注二氧化硅的方法实现了该模型。为确保尼古丁注射成功，操作者必须熟练掌握小鼠抓持技术，因为抓握小鼠颈背部皮肤可能对其造成疼痛。因此，让小鼠逐步适应抓持过程至关重要。此外，小鼠二氧化硅暴露的关键步骤是鼻腔滴注。为了提高操作成功率及小鼠的存活率，事先练习鼻腔滴注技术十分必要。
注射时，应将注射器从鼠头上方掠过，以避免小鼠看到注射器后剧烈挣扎。用右手牢固抓住小鼠尾巴，同时用左手小心轻柔地将颈背部皮肤向上推至耳缘处，并捏住该处皮肤。右手松开小鼠尾巴后，应用左手拇指和无名指固定尾巴及后肢，以防被咬伤。用右手持1 mL注射器，将针头以30°角沿头部至尾部方向刺入颈背部松弛的皮肤。当阻力消失后，应将针头略微回撤，然后缓慢而均匀地进行注射。在第5至19天，双暴露组小鼠接受尼古丁和二氧化硅暴露。建议于上午08:00注射尼古丁，下午14:00进行二氧化硅鼻滴，晚上20:00再次注射尼古丁。两次尼古丁注射需间隔12小时，以避免频繁抓握对小鼠造成影响。
<p class="jov...

在某些职业环境中，工人接触二氧化硅是不可避免的，且一旦暴露于二氧化硅，即使脱离该环境，病情仍会持续恶化。此外，这些工人中大多数有吸烟习惯，而传统香烟含有数千种化学物质，其中主要成瘾成分为尼古丁1。电子烟在年轻人群中正变得越来越流行2；这些电子烟作为尼古丁输送系统，增加了尼古丁的可及性，从而提高了肺部易感性和肺炎风险3。香烟烟雾还会加速博来霉素暴露小鼠的肺纤维化过程4，并增加二氧化硅暴露小鼠的肺毒性及肺纤维化程度5,6。然而，尼古丁是否会影响二氧化硅引起的炎症反应和肺纤维化过程，仍有待进一步研究。
通过一次性向气管内吸入高剂量二氧化硅建立的矽肺小鼠模型对小鼠创伤较大。尽管该方法可快速获得矽肺模型，但与工人在实际环境中反复暴露于二氧化硅的情况不符。因此，我们通过反复给予低剂量二氧化硅悬液，建立了一种二氧化硅暴露小鼠模型 通过 鼻腔滴注；该剂量可在小鼠中引起炎症和纤维化。
为了规避香烟中其他成分的影响，本小鼠模型通过皮下注射的方式将尼古丁注入颈部松弛的皮肤，以确定成瘾性成分尼古丁对矽肺病的影响。通过皮下注射可实现精确给药，从而建立尼古丁暴露模型，并观察剂量-毒性反应以及成瘾行为。已有研究在雄性小鼠中建立了尼古丁成瘾模型，尼古丁注射剂量为 0.2–0.4 mg/kg7,8。在该模型中，为满足成瘾小鼠的觅药需求，每间隔 12 小时进行一次皮下注射，共注射两次。该小鼠尼古丁成瘾模型有助于模拟人类吸烟习惯及二氧化硅暴露情况。
单因素动物模型在疾病研究中存在局限性，而本文所述方法采用尼古丁与二氧化硅联合暴露的双因素小鼠模型。在二氧化硅暴露之前，小鼠预先暴露于尼古丁，以模拟吸烟人群的尼古丁暴露情况。随后，在第5天至第19天进行二氧化硅暴露，以模拟有吸烟史个体在工作环境中接触二氧化硅的情况。
肺泡巨噬细胞在调控肺部炎症和纤维化过程中发挥着重要作用。巨噬细胞无法降解吸入的二氧化硅，导致巨噬细胞极化或发生凋亡9，并释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和转化生长因子-β（TGF-β）等细胞因子。其中，以表面标志物CD86为特征的M1型巨噬细胞是矽肺病中炎症反应的主要启动者，而以CD206为标志物的M2型巨噬细胞则主导疾病的纤维化阶段10。在双重暴露的小鼠模型中，尼古丁促使二氧化硅损伤肺组织中的巨噬细胞向M2表型极化，从而促进肺纤维化的发展。此外，TGF-β1在诱导纤维化及上皮-间质转化（EMT）过程中起关键作用11；TGF-β1表达水平升高可通过EMT加速肺纤维化的进展。该模型成功分析了尼古丁对矽肺病的影响，并进一步强调了戒烟的重要性。

<table><tbody><tr><td>10% 中性福尔马林固定液</td><td>南昌玉路实验设备有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒剂</td><td>新泰矿业消毒产品有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA，第五组分</td><td>碧云天生物技术</td><td>ST023-200g</td><td></td></tr><tr><td>CD206 单克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>60143-1-IG</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸抗原修复液</td><td>百奥舍生命科学</td><td>BL619A</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>西亚化学科技（山东）有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>增强型 BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>碧云天生物技术</td><td>P0009</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 多克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>10494-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>苏木精和伊红（H&amp;和 E)</td><td>碧云天生物技术</td><td>C0105S</td><td></td></tr><tr><td>HRP底物</td><td>默克密理博公司</td><td>P90720</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记的Affinipure山羊抗小鼠IgG(H+L)</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记的Affinipure山羊抗兔IgG(H+L)</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT[R] DAB EqV 过氧化物酶（HRP）底物</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4103-100</td><td></td></tr><tr><td>马松三色染色试剂盒</td><td>Solarbio</td><td>G1340</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Macklin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼古丁</td><td>Sigma</td><td>N-3876</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）&amp;nbsp;</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水&amp;nbsp;</td><td>淮南市第一人民医院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>碧云天生物技术</td><td>ST505</td><td></td></tr><tr><td>正荧光显微镜</td><td>奥林巴斯公司</td><td>BX53+DP74</td><td></td></tr><tr><td>预染色蛋白质分子量标准&amp;nbsp;预染彩色蛋白分子量标准</td><td>碧云天生物技术</td><td>P0071</td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>Millipore</td><td>3010040001</td><td></td></tr><tr><td>RIPA裂解缓冲液</td><td>碧云天生物技术</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒</td><td>碧云天生物技术</td><td>P0012A</td><td></td></tr><tr><td>二氧化硅</td><td>Sigma</td><td>#BCBV6865</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;</td><td>Bioss</td><td>bs-0086R</td><td></td></tr><tr><td>波形蛋白多克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>10366-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;材料/设备名称&lt;/strong&gt;</td><td>公司</td><td>货号</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 离心管</td><td>Biosharp</td><td>BS-05-M</td><td></td></tr><tr><td>振荡恒温金属浴</td><td>阿布森</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡包埋机</td><td>常州精准医疗设备有限公司</td><td>PBM-A</td><td></td></tr><tr><td>石蜡切片机</td><td>金华东瑞仪器有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>偏光显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>精密天平</td><td>Acculab</td><td>ALC-110.4</td><td></td></tr><tr><td>RODI IOT 智能多功能水净化系统</td><td>RSJ</td><td>RODI-220BN</td><td></td></tr><tr><td>Scilogex SK-D1807-E 三维摇床</td><td>Scilogex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型动物麻醉机</td><td>安徽耀坤生物科技有限公司</td><td>ZL-04A</td><td></td></tr><tr><td>通用移液器吸头</td><td>KIRGEN</td><td>KG1011</td><td></td></tr><tr><td>通用移液器吸头</td><td>KIRGEN</td><td>KG1212</td><td></td></tr><tr><td>通用移液器吸头</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合&amp;nbsp;混匀器&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;材料/设备名称&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用尼古丁在二氧化硅暴露的小鼠模型中促进肺上皮-间质转化

Using Nicotine in a Silica-Exposed Mouse Model to Promote Lung Epithelial-Mesenchymal Transition

吸烟和接触二氧化硅在职业人群中较为普遍，而二氧化硅对吸烟者肺部的损伤风险高于非吸烟者。香烟中主要的成瘾成分尼古丁在矽肺病发展中的作用尚不明确。本研究采用的小鼠模型结构简单且易于控制，能够有效模拟长期摄入尼古丁和反复接触二氧化硅通过上皮-间质转化对人类肺纤维化的影响。此外，该模型有助于直接研究尼古丁对矽肺病的作用，同时避免香烟烟雾中其他成分的干扰。
经过环境适应后，小鼠每日早晚间隔12小时，在颈背部松散皮肤处皮下注射0.25 mg/kg的尼古丁溶液，持续40天。此外，将结晶型二氧化硅粉末（1–5 µm）悬浮于生理盐水中，稀释成20 mg/mL的悬浮液，并使用超声水浴均匀分散。小鼠在异氟烷麻醉状态下经鼻吸入50 µL该二氧化硅粉尘悬浮液后苏醒。 通过 胸部按摩。二氧化硅暴露在第5至19天每天进行。
双暴露小鼠模型先暴露于尼古丁，随后暴露于二氧化硅，这模拟了同时接触这两种有害因素的工人暴露史。此外，尼古丁通过促进小鼠的上皮-间质转化（EMT）加重了肺纤维化。该动物模型可用于研究多种因素对矽肺病发生发展的影响。

建立了一种尼古丁联合二氧化硅暴露的小鼠模型，用于研究尼古丁在小鼠矽肺病进展中的潜在作用。图1展示了采用双暴露小鼠模型的实验流程，该模型结合了尼古丁注射与二氧化硅悬浮液的鼻腔滴注。通过HE染色观察各组小鼠的病理变化。与单独暴露于尼古丁或二氧化硅的小鼠相比，尼古丁联合二氧化硅暴露组小鼠的肺损伤显著更严重。尼古丁暴露组小鼠肺部淋巴管周围淋巴细胞增多，形成炎性细胞簇。Masson染色显示，与其余各组相比，尼古丁联合二氧化硅暴露组小鼠肺组织中胶原纤维沉积显著增加，该结果得到了Masson染色定量分析的支持（图2）。二氧化硅暴露组小鼠肺泡结构遭到破坏，巨噬细胞数量增加。然而，在尼古丁联合二氧化硅暴露后，出现明显的炎性细胞浸润，并可见成纤维细胞结节。此外，双暴露组中积累了大量巨噬细胞，尤其是M2型巨噬细胞。M2型巨噬细胞在矽肺病的晚期纤维化阶段中起关键作用。
此外，通过免疫组织化学（IHC）染色发现，双暴露小鼠肺组织中促纤维化因子 TGF-β1 显著升高，尤其在淋巴管周围的炎性...

本研究描述了一种小鼠模型，用于研究尼古丁在实验性矽肺小鼠肺纤维化进展中的协同作用。双重暴露小鼠模型可模拟尼古丁与二氧化硅同时暴露后肺部的病理进展过程。所述方法简便且具有高度可重复性。

吸烟和接触二氧化硅在职业人群中较为常见，且二氧化硅对吸烟者肺部的损伤风险高于非吸烟者。其作用……

本研究采用的小鼠模型能够有效模拟长期摄入尼古丁并反复暴露于二氧化硅后，通过上皮-间质转化在人体中引发肺纤维化的过程。通过皮下注射尼古丁和鼻腔滴注二氧化硅，以一种简单且可靠的方式建立了该模型。将无菌结晶型二氧化硅悬浮于生理盐水中，制备成浓度为 20 毫克/升的悬浮液。在超声振荡水浴中震荡25分钟。将二氧化硅悬浮液用涡旋振荡器振荡3分钟。吸取悬浮液混匀，然后取50 µL用于鼻腔滴注。开始二氧化硅暴露时，首先将麻醉后的小鼠置于一只手的掌心，暴露小鼠的鼻腔。从一侧鼻孔在4至8秒内注入50微升二氧化硅悬浮液。为促进悬浮液快速进入肺部，用食指轻轻按压小鼠胸部3至5秒，每秒重复按压3至5次，以维持其呼吸频率。当小鼠呼吸均匀后，将其置于笼中观察三分钟。准备尼古丁注射器时，先用1毫升注射器抽取空气至0.2毫升刻度处，然后吸入125微升尼古丁。轻敲注射器，使尼古丁充满针头及前端，随后将其置于避光托盘中。用右手抓住小鼠尾巴。待小鼠放松后，用左手拇指和食指从尾部向耳缘方向对皮肤施加适度压力。现在，松开右手，用左手的小指和无名指夹住小鼠的尾巴和后肢以固定小鼠。右手持注射器，沿头部至尾部方向刺入颈部背部皮肤。以均匀速度注射尼古丁。将麻醉后的小鼠固定在泡沫测试板上，用75%酒精喷洒毛发。沿腹部中线做切口，暴露胸腔。在心脏右侧心尖处做一个小切口。从左心尖部缓慢且均匀地注入 20 毫升预冷的 PBS，使血液从右心尖处所创建的开口流出。完整取出肺叶并置于 -80 摄氏度冰箱中冷藏。用 10 毫升 4% 多聚甲醛对剩余小鼠进行灌注。在 PBS 灌注后，将肺组织置于 30 毫升的对甲醛溶液中保存。72 小时后，将肺组织浸入配制好的固定液中，并放入超声波水浴仪中，在 40 摄氏度下处理 30 分钟。接下来，将组织依次置于75%乙醇、95%乙醇和无水乙醇中，每步脱水50分钟。用二甲苯浸泡肺组织，每次50分钟，共两次，以洗涤组织。将组织置于55至60摄氏度的熔融石蜡中浸蜡2至3小时。待石蜡完全凝固后，使用切片机获取厚度为四到五微米的肺组织切片。将切片置于超纯水中，于45摄氏度下加热。待石蜡融化后，将肺组织切片转移至防脱载玻片上。苏木精-伊红染色研究显示，暴露于尼古丁联合二氧化硅的小鼠肺部损伤显著比仅暴露于尼古丁或仅暴露于二氧化硅的小鼠更为严重。Masson染色显示，与其它组相比，尼古丁联合二氧化硅暴露组小鼠肺部胶原纤维沉积增加。在暴露于二氧化硅的小鼠中，肺泡结构遭到破坏。免疫组织化学研究表明，暴露于尼古丁和二氧化硅联合作用的小鼠体内，CD206阳性巨噬细胞及促纤维化因子TGF-β1阳性细胞数量增加。与其余各组相比，接受双重暴露的小鼠vimentin表达水平更高。免疫组织化学分析及蛋白质定量提示存在严重的上皮-间质转化。为了确保尼古丁注射成功，操作者必须熟悉小鼠的抓握方法，因为抓握颈部后方的皮肤可能会使其感到疼痛。

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科研

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Medicine

医学

在二氧化硅暴露小鼠模型中使用尼古丁促进肺上皮-间充质转化

肺上皮细胞可从小鼠呼吸道分离，并在气液界面培养，作为分化型呼吸道上皮的模型。本文描述了一种分离、培养这些细胞并将其暴露于主流香烟烟雾的实验方案，以研究细胞对这种环境毒素的分子响应。...

小鼠呼吸道上皮细胞的分离及在气液界面暴露于实验性香烟烟雾

本实验方案旨在提供一种自动化方法，用于量化慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型中的慢性肺部病理变化。该方案包括将小鼠暴露于香烟烟雾（CS）中、测定肺功能、灌注膨胀肺组织，以及采用形态计量学方法测量小鼠肺气肿和小气道重塑情况。...

香烟烟雾暴露小鼠肺气肿及小气道重塑的自动化测量

迁移能力是多种不同类型细胞的关键功能，包括间充质基质细胞（MSCs）。然而，量化损伤后迁移能力的变化具有挑战性。本方案描述了一种易于调整的迁移检测方法，该方法采用严格的统计学手段来量化损伤后MSC迁移能力的变化。...

优化划痕损伤实验以检测可溶性香烟烟雾提取物损伤后小鼠间充质基质细胞迁移能力的变化

本方案展示了利用自行构建的全身吸入（WBI）暴露系统（WBIS）研究香烟烟雾（CS）病理生理效应的方法。该系统可在可控且可重复的条件下使动物暴露于香烟烟雾中，用于研究香烟烟雾对肺气肿和造血功能的影响。...

使用全身体吸入系统使小鼠暴露于香烟烟雾

本方案描述了一种通过反复暴露于二氧化硅悬浮液来建立小鼠矽肺模型的方法 通过...

通过反复吸入结晶二氧化硅粉尘建立的矽肺小鼠模型

用于研究香烟烟雾提取物刺激下小鼠气道上皮细胞分化及多组学变化的体外模型

本文介绍了一种简单高效的气管插管方法，可用于小鼠肺功能测定或肺部灌注，且允许小鼠在术后恢复并进行后续研究。该操作使用一种廉价的光纤光源，可直接照亮气管。...

一种小鼠肺部插管的简易方法

重现器官特异性的微环境（可刺激局部血管生成）对于受损组织的成功再生至关重要。本报告展示了一种新方法，即将纤维蛋白凝胶植入活体小鼠的肺表面，以探究肺特异性微环境如何调控成年小鼠中的血管生成及肺泡再生。...

在小鼠肺部植入纤维蛋白凝胶以研究肺特异性血管生成

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离体肺灌注（EVLP）通过实现对器官的评估并扩大供体来源，使人类肺移植变得更加可行。本文中，我们描述了大鼠EVLP模型的建立过程以及相关优化，这些改进为未来的进一步拓展提供了可重复的实验模型。...

分离方法 离体 大鼠模型中的肺灌注：建立大鼠离体肺灌注（EVLP）项目的经验总结

探索尼古丁与二氧化硅联合暴露小鼠模型，通过皮下注射和鼻腔滴注建立肺纤维化研究方法。该模型可模拟上皮-间充质转化过程，为肺疾病机制研究提供可靠实验基础。

利用尼古丁在二氧化硅暴露的小鼠模型中促进肺上皮-间质转化

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