Name: 使用 体内 显微注射和电穿孔的体细胞基因组工程小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学习小鼠输卵管体内显微注射与电穿孔技术，实现CRISPR介导的体细胞基因组编辑。该方法可在免疫健全环境中创建散在突变细胞，用于研究肿瘤发生机制，无需特定转基因小鼠品系。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢Katie Teng和Matthew J. Ford博士提供了用于获得代表性结果和优化实验方案的质粒。K.H.获得了魁北克健康研究基金会（Fonds de recherche du Québec - Santé, FRQS）博士奖学金、Donnor基金会、Delta Kappa Gamma世界奖学金、生殖与发育研究中心（CRRD）、Hugh E. Burke、Rolande &amp;#38; Marcel Gosselin以及Alexander McFee研究生奖学金的资助。

动物饲养在带有滤膜盖的静态微隔离笼具中，笼具位于配备II级生物安全柜的专用房间内。所有动物实验均遵循机构指导原则，并经麦吉尔大学医学与健康科学学院动物护理委员会批准（实验动物使用许可号：#7843）。
1. 显微注射针的制备
<ol>
	<li>使用显微拉针仪，按照以下程序将玻璃毛细管拉制成尖锐的尖端：P = 500，Heat = 576，PULL = 50，VEL = 80，DEL = 70。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用一对锥形超细尖镊子剪断已拉制的毛细管尖端，以形成开口，如图1A、B所示。注意开口不宜过大，以免损伤输卵管并影响缓慢注射。</li>
</ol>
<img alt="微电极比较示意图，显示两个标为 A 和 B 的尖锐金属尖端，比例尺单位为微米。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：显微注射针的制备。（A,B）拉制后的毛细管具有一尖端（A），经剪切形成开口（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 准备用于腹腔注射的麻醉剂
<ol>
	<li>在手术当天配制过滤后的稀释型戊巴比妥溶液。戊巴比妥（2,2,2-三溴乙醇）储备液的浓度为每毫升1.6克，溶剂为叔戊醇，需通过剧烈搅拌配制，并避光保存。</li>
	<li>在通风橱内，用体积分数为1.25%的等渗盐水将戊巴比妥储备液稀释至终浓度为20 mg/mL。涡旋混匀稀释后的戊巴比妥溶液，并通过0.22 µm无菌滤器过滤。避光保存。</li>
</ol>
3. 手术区域的准备
<ol>
	<li>手术区域应为专用的无菌环境，最好使用洁净工作台或生物安全柜。根据需要摆放无菌手术器械、显微镜、显微操作仪和电穿孔仪。示例见图2。</li>
	<li>启动加热垫/加热板并将其放置在一个清洁且配备齐全的笼子下方。该笼子将用于术后小鼠的饲养。</li>
	<li>将无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS）倒入无菌培养皿中。使用一把洁净的剪刀将吸水纸剪成约1 cm × 1 cm的正方形小片，并将其放入1× PBS中浸泡。</li>
</ol>
4. 准备注射用溶液和针头
<ol>
	<li>在手术当天配制注射溶液。将DNA/RNA/核糖核蛋白复合物（RNPs）与过滤后的台盼蓝混合，使每种成分的终浓度至少达到200 ng/µL，台盼蓝浓度为5%。注射前于室温下保存。 
	​注意：使用1 mL注射器吸取100%台盼蓝，并在使用前通过0.22 µm无菌滤膜过滤。</li>
	<li>将拉制的毛细玻璃针（此后称为显微注射针）安装至由磁性底座固定的夹持式显微操作器上（装置如图2B所示）。</li>
	<li>将2 µL注射溶液移取至无菌培养皿中。在显微镜下观察的同时，利用连接在显微操作器上的气压驱动注射器，缓慢将1–2 µL溶液吸入显微注射针内。避免产生气泡或将气泡吸入显微注射针中。</li>
</ol>
<img alt="显微镜和显微注射装置；包括解剖显微镜、显微操作器、电极。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：手术区域准备。（A）洁净工作台内的手术区域设置。（B）适用于右利手操作者的解剖显微镜与显微操作器装置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 暴露雌性生殖道
<ol>
	<li>通过腹腔注射方式给予6-8周龄雌性小鼠过滤稀释的Avertin（麻醉剂），剂量为0.25-0.5 mg/g，以实现麻醉。随后，皮下注射卡洛芬（预先镇痛剂），剂量为5 mg/kg。 
	注意：其他可用作麻醉剂的替代品包括异氟烷或氯胺酮/赛拉嗪。</li>
	<li>在洁净的加热垫/加热板上放置吸水纸。然后将麻醉后的小鼠仰卧置于该加热吸水纸上。向每只眼睛涂抹眼用润滑剂，以防止手术过程中角膜干燥。 
	注意：应用手背轻触测试，确认加热垫/加热板温度略温，不可过热。</li>
	<li>使用镊子轻夹麻醉小鼠的脚趾，检测其是否达到深度麻醉状态。去除拟切口部位背侧的毛发（位置见图3A），并用消毒剂擦拭裸露皮肤。</li>
	<li>使用一对直头钝头镊夹住裸露皮肤，再用无菌锋利剪刀沿身体中线做约1 cm长的切口。用消毒剂清洁切口周围区域。</li>
	<li>用无菌Adson镊夹住切口一侧的皮肤并提起。然后使用无菌弯齿镊，从切口中线开始，向侧方轻轻分离皮肤与体壁。</li>
	<li>定位肾脏下方的脂肪垫。使用无菌直头钝头镊夹住脂肪垫正上方的体壁组织。使用无菌尖头解剖剪在体壁上做一个小切口，注意避开血管。</li>
	<li>在继续用直头钝头镊夹住体壁的同时，将无菌钝头弯镊插入切口，扩大体壁上的切口。</li>
	<li>用钝头弯镊夹住可见的脂肪垫，并将其拉出切口，以暴露卵巢、输卵管和子宫。</li>
	<li>为保持生殖道持续暴露，使用无菌鳄嘴钳夹住脂肪垫，如图3B所示。</li>
</ol>
6. 体内 输卵管注射与电穿孔
<ol>
	<li>将加热的吸水纸和麻醉后暴露生殖道的小鼠小心地放置在解剖显微镜的载物台上，使生殖道能够被观察到。显微镜下观察的示例见图3B。</li>
	<li>调节显微操作仪，使带有溶液的注射针也能在显微镜下被观察到。</li>
	<li>使用一对无菌锥形超细尖镊子，夹住待注射部位的输卵管并固定。待注射区域必须与显微注射针的方向对齐。 
	注意：如有需要，可使用固定脂肪垫和生殖道的鳄鱼夹轻轻旋转或移动生殖道至最佳位置。</li>
	<li>调节显微操作仪，用显微注射针刺穿输卵管，同时使用锥形超细尖镊子将输卵管轻轻推向针尖。轻微移动显微注射针以确认其已插入输卵管内。 
	注意：应将显微注射针插入输卵管的直线段，而非盘曲部分的转折点，以避免多次穿刺及注射液泄漏。</li>
	<li>在显微镜下观察蓝色溶液的流动及输卵管管腔的扩张情况，缓慢向输卵管内注射最多1 µL溶液。注意避免将气泡注入管腔。注入100%台盼蓝后的输卵管代表性图像见图3C、D。</li>
	<li>将针头从输卵管中取出。用一块预先浸泡于无菌1x PBS（来自步骤3.3）中的吸水纸覆盖待处理区域。</li>
	<li>使用电极镊子（1 mm、3 mm 或 5 mm，根据目标区域大小选择）夹住已预湿的纸片及目标区域，并将其轻轻拉离身体，然后使用脉冲发生器/电穿孔仪按以下参数进行电穿孔：30 V，3次脉冲，间隔1 s，脉冲时长50 ms，单极性。 
	注意：电极间距应设置为能够夹住目标区域而不使输卵管变形的程度，推荐间距约为1 mm。</li>
	<li>电穿孔完成后，移除吸水纸，将小鼠（下方垫有加热的吸水纸）放回加热垫上。松开鳄鱼夹，并小心地将暴露的生殖道推回体壁下方。重复第5节操作，暴露对侧的生殖道。 
	注意：只要管腔内充满溶液，电穿孔的成功不受小鼠动情周期阶段的影响。</li>
	<li>用预先浸泡于无菌1x PBS的吸水纸覆盖暴露的生殖道，防止其干燥；然后通过重复步骤4.2和4.3准备第二次注射用的显微注射针。 
	注意：根据需要更换显微注射针。必要时可滴加无菌1x PBS以防止暴露组织干燥。</li>
	<li>重复上述步骤，对对侧输卵管进行注射和电穿孔。 
	​注意：手术过程中及术后根据需要重新涂抹眼用润滑剂。</li>
	<li>双侧输卵管完成电穿孔并复位至体壁下方后，缝合或钉合背部切口。若采用缝合，使用止血钳夹住丝线编织缝合针（3/8圆；规格：5-0；针长：18 mm；线长：75 cm），用一对无菌弯齿镊夹起切口一侧组织并提起，再使用止血钳操作缝线关闭伤口。</li>
	<li>将小鼠转移至放置在加热垫/加热盘（来自步骤3.2）上的洁净笼盒中，并持续监测直至小鼠恢复活动。</li>
	<li>术后连续3天，每天皮下注射5 mg/kg卡洛芬，并在接下来的10天内持续观察小鼠状态。</li>
</ol>
<img alt="小鼠卵巢注射过程；示意图包含子宫、输卵管、夹钳；用于生育力研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3女性生殖道暴露与显微注射 (A) Rosa-LSL-tdTomato 小鼠背部中线切口位置（黄色线条所示）。B) 女性生殖道暴露。使用无菌蚊式血管钳夹住脂肪垫，以固定生殖道并保持其暴露状态。C，D代表性图像 在体 输卵管注射。将显微注射针插入远端壶腹部（标记为AMP），在暴露输卵管管腔的同时，注入经过滤的100%台盼蓝溶液C）。输卵管解剖后的代表性图像，显示注入的台盼蓝溶液分布于输卵管远端和近端管腔内（D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<ol><li>Avilés, M., Coy, P., Rizos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oviduct%3A+A+key+organ+for+the+success+of+early+reproductive+events%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Frontiers%22%5BJournal%5D)">The oviduct: A key organ for the success of early reproductive events.</a> Animal Frontiers. 5 (1), 25-31 (2015).</li>
<li>Li, S., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviduct%3A+roles+in+fertilization+and+early+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Oviduct: roles in fertilization and early embryo development.</a> The Journal of Endocrinology. 232 (1), R1-R26 (2017).</li>
<li>Briceag, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fallopian+tubes--literature+review+of+anatomy+and+etiology+in+female+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine+and+Life%22%5BJournal%5D)">Fallopian tubes--literature review of anatomy and etiology in female infertility.</a> Journal of Medicine and Life. 8 (2), 129-131 (2015).</li>
<li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca%3BTp53%3BPten+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).</li>
<li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+grade+serous+ovarian+carcinomas+originate+in+the+fallopian+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube.</a> Nature Communications. 8 (1), 1093(2017).</li>
<li>Shaw, P. A., Rouzbahman, M., Pizer, E. S., Pintilie, M., Begley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+serous+cancer+precursors+in+fallopian+tube+epithelium+of+BRCA1%2F2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Candidate serous cancer precursors in fallopian tube epithelium of BRCA1/2 mutation carriers.</a> Modern Pathology. 22 (9), 1133-1138 (2009).</li>
<li>Soong, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+lineage+continuity+between+early+serous+proliferations+%28ESPs%29+in+the+Fallopian+tube+and+disseminated+high-grade+serous+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evidence for lineage continuity between early serous proliferations (ESPs) in the Fallopian tube and disseminated high-grade serous carcinomas.</a> The Journal of Pathology. 246 (3), 344-351 (2018).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> The Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).</li>
<li>Puisieux, A., Pommier, R. M., Morel, A. P., Lavial, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pliancy+and+the+multistep+process+of+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular pliancy and the multistep process of tumorigenesis.</a> Cancer Cell. 33 (2), 164-172 (2018).</li>
<li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li>
<li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677(2021).</li>
<li>Teng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+high-grade+serous+ovarian+carcinoma+using+a+combination+of+in+vivo+fallopian+tube+electroporation+and+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling high-grade serous ovarian carcinoma using a combination of in vivo fallopian tube electroporation and CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Cancer Research. 81 (20), 5147-5160 (2021).</li>
<li>Ford, M. J., Yamanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+mouse+oviduct+epithelial+cells+using+in+vivo+electroporation+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reprogramming mouse oviduct epithelial cells using in vivo electroporation and CRISPR/Cas9-mediated genetic manipulation.</a> Methods in Molecular Biology. 2429, 367-377 (2022).</li>
<li>Maresch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+pancreatic+genome+engineering+and+cancer+induction+by+transfection-based+CRISPR%2FCas9+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/Cas9 delivery in mice.</a> Nature Communications. 7, 10770(2016).</li>
<li>Braun, C. J., Adames, A. C., Saur, D., Rad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+design+and+execution+of+CRISPR+in+vivo+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tutorial: design and execution of CRISPR in vivo screens.</a> Nature Protocols. 17 (9), 1903-1925 (2022).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Chazaud, C., Yamanaka, Y., Pawson, T., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+lineage+segregation+between+epiblast+and+primitive+endoderm+in+mouse+blastocysts+through+the+Grb2-MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Early lineage segregation between epiblast and primitive endoderm in mouse blastocysts through the Grb2-MAPK pathway.</a> Developmental Cell. 10 (5), 615-624 (2006).</li>
<li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nature Reviews. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li>
<li>Kroeger Jr, P. T., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+heterogeneity+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer.</a> Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+analyses+of+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma.</a> Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本详细方案中的关键步骤包括将 DNA/RNA/RNP 溶液微量注射至输卵管管腔，以及对电穿孔强度和作用区域的控制。微量注射过程中若发生 DNA/RNA/RNP 溶液泄漏，可能导致非目标区域或非目标细胞被转染。为实现稳定且高效的电穿孔，建议将输卵管管腔充分充满溶液（图 3C,D）。这是因为电穿孔的作用区域主要由电极的尺寸和放置位置决定。电穿孔过弱会减少被转染的细胞数量，而过强则可能导致非目标细胞被转染或组织结构受损。通过调整 DNA/RNA/RNP 溶液的浓度或电穿孔参数，可调节被转染细胞的数量。然而，由于电穿孔过程中产生的高电压或热量可能损伤组织，因此这些参数应在实际用于活体或麻醉小鼠前预先进行测试。最后，鉴于该操作技术要求较高，建议在对活体或麻醉小鼠实施手术前，先在死亡小鼠上练习输卵管暴露和微量注射操作。
已知多种基因参与癌症的起始过程，因此模拟这一事件需要对多个基因进行多等位基因修饰。此外，也已明确并非所有细胞对致癌突变都具有相同的易感性9。因此，癌症建模需要特定的Cre小鼠品系，以实现对致癌损伤的精确控制。然而，这些小鼠品系的可获得性和特异性带来了多种挑战，包括在非靶组织中的效应以及致死性19。此外，传统的基因工程小鼠模型（G-GEMMs）维持成本高昂，且需要较长时间来建立小鼠品系。CRISPR/Cas9基因组编辑技术的发展以及向特定体细胞递送基因方法的改进，使我们能够克服上述问题。在本方案中，我们介绍一种用于体细胞基因组操作的DNA/RNA/RNP递送方法，可用于癌症建模，且无需依赖特定的小鼠品系12。通过将DNA/RNA/RNP溶液注射至管腔内，并采用不同尺寸的镊形电极进行基于电穿孔的递送，可靶向小鼠输卵管黏膜上皮的特定区域（图4A-F）。该方法在模拟起源于输卵管远端的高级别浆液性癌（HGSCs）起始过程中尤为有用。
本文介绍的显微注射和体内电穿孔方法在靶向具有管腔的组织/器官方面具有高度通用性。该方法也可用于靶向器官实质14。病毒递送方法（如慢病毒和腺病毒系统）也可用于类似目的。然而，与病毒递送方法相比，电穿孔具有以下优势：1）可将多个质粒递送至单个细胞；2）对插入片段大小无限制15；3）可方便地控制递送的区域和时间。此外，通过使用谱系特异性启动子，可进一步提高靶向特异性。而在病毒系统中，由于病毒包装能力的限制，这一操作有时难以实现。
与电穿孔技术的特性一致，经电穿孔处理的上皮细胞会随机地与健康的、未经编辑的细胞交错分布（图4G）。然而，这种基因修饰细胞与未修饰细胞共存的嵌合状态可能有利于研究癌症的起始过程，因为它模拟了在免疫功能完整的微环境中早期癌症发生的偶发性特征。通过调整DNA/RNA/RNP溶液的浓度和/或电穿孔参数，可以调节电穿孔细胞的频率。结合CRISPR-Cas介导的基因编辑技术与本方案，可方便地对多个基因进行筛选，并在靶基因中产生异质性的突变/等位基因组合模式；这对于建模具有大量基因组改变的癌症（如高级别浆液性癌，HGSCs）尤为有用20,21。此外，通过对癌症进展过程中靶基因的测序，可以在免疫功能完整的 小鼠中追踪肿瘤及转移灶的体内克隆演化过程12。

输卵管（在小鼠中称为输卵管）是连接子宫与卵巢的管状结构。它在哺乳动物生殖过程中发挥关键作用，为体内受精和着床前发育提供必要的环境。1,2尽管其具有重要性，但关于它的功能和稳态机制仍知之甚少，部分原因在于相关研究工具的开发尚不充分。 体外 绕过与此器官相关的任何不孕问题的受精技术3然而，人们已经认识到，高级别浆液性卵巢癌（HGSC）是一种侵袭性卵巢癌组织学类型，约占卵巢癌病例的75%和相关死亡病例的85%，其癌前病变4局限于远端输卵管上皮5,6,7,8这表明，我们体内并非所有细胞对致癌损伤都具有同等的易感性，而是在每种组织或器官中仅特定的/易感的细胞才会成为癌症的起源细胞——这一特性称为细胞可塑性（cellular pliancy）。9沿此方向，已有研究表明，位于卵巢附近的输卵管远端的上皮细胞与其他部位的输卵管上皮细胞存在差异。10,11因此，传统的高级别浆液性癌（HGSC）小鼠模型靶向输卵管中的所有细胞，无法准确模拟人类疾病状况。在最近的一项研究中，我们采用了CRISPR介导的基因组编辑技术相结合的方法， 体内 输卵管电穿孔及基于Cre的谱系示踪成功诱导了高级别浆液性癌（HGSC）&#160;通过在小鼠远端输卵管中突变四个肿瘤抑制基因12,13本文详细介绍了显微注射技术的逐步操作流程。 体内 电穿孔法靶向小鼠输卵管黏膜上皮
该方法具有多项优势，可进行调整以靶向其他组织或器官，包括器官实质14。尽管其他 体内 基因递送方法（如慢病毒和腺病毒系统）虽可实现类似的组织/器官特异性靶向，但使用不同尺寸的镊子型电极进行基于电穿孔的递送时，靶向区域更易于调节。根据DNA/RNA/核糖核蛋白（RNPs）的浓度、电穿孔参数以及电极尺寸，可调控电穿孔细胞的数量。此外，当与驱动Cas9表达的启动子联用时，该方法可靶向特定细胞类型，而无需完全依赖生殖系基因工程小鼠模型（G-GEMMs）。另外，与病毒递送系统不同，电穿孔可实现多个质粒同时递送至单个细胞，且对插入DNA片段的大小限制更小15. 在体 由于这种高灵活性，基因突变的筛选也可以相对容易地进行。此外，当该方法与Cre报告基因小鼠品系（如Tdtomato或Confetti）联合使用时，可对电穿孔的细胞进行追踪或示踪。16,17.

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 无菌滤器组件&amp;nbsp;</td><td>LifeGene</td><td>SF0.22PES</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Terumo Medical Corportation</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>1 mm 镊子型电极</td><td>BEX CO., LTD</td><td>LF650P1</td><td></td></tr><tr><td>3 mm 镊子型电极</td><td>BEX CO., LTD</td><td>LF650P3</td><td></td></tr><tr><td>30G × 1/2 针头</td><td>BD</td><td>305106</td><td>使用可注射麻醉剂或镇痛剂时，将针头连接至 1 mL 注射器。</td></tr><tr><td>阿登顿镊</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-000-451</td><td></td></tr><tr><td>气压式注射器</td><td>BD</td><td>B302995</td><td>连接至显微操作器；如图 2B 所示。</td></tr><tr><td>镇痛剂</td><td>-</td><td>-</td><td>卡洛芬，剂量：5 mg/kg。</td></tr><tr><td>消毒剂</td><td>Cardinal Health</td><td>OMEL0000017</td><td>Baxedin：70% 异丙醇中含 2% 氯己定。</td></tr><tr><td>Avertin（2,2,2-三溴乙醇）— 麻醉剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>夹式安装显微操作器</td><td>AD Instruments</td><td>MM-33</td><td></td></tr><tr><td>弯齿解剖镊</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0696845</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td>复消色差 S，0.63X，工作距离 107 mm。顶部光源配备 KL 200 LED，图 2B 中标注为光源。</td></tr><tr><td>眼部润滑剂</td><td>Alcon</td><td>-</td><td>Systane 软膏（润滑性眼用软膏）</td></tr><tr><td>玻璃毛细管针头</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100&amp;ndash;50-10</td><td>外径：1 mm，内径：0.5 mm，长度：10 cm</td></tr><tr><td>哈特曼止血钳</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-711</td><td></td></tr><tr><td>加热垫/加热盘&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>本实验方案使用 SnuggleSafe 宠物床微波加热垫。微波加热 2–5 分钟，并用戴着手套的手背测试温度。</td></tr><tr><td>显微操作器磁性支架</td><td>AD Instruments</td><td>MB-B</td><td>用于在注射过程中保持夹式安装显微操作器的稳定与直立。</td></tr><tr><td>微型无损伤血管夹</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-230</td><td>3 cm</td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>P-97 Flaming/Brown 型微量移液器拉制仪。所用程序：P = 500，Heat = 576，PULL = 50，VEL = 80，DEL = 70</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>263991</td><td>也可使用经高压灭菌/无菌的玻璃培养皿。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PD8117</td><td>将 10X PBS 用去离子水稀释至 1X。使用前进行高压灭菌。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>脉冲发生器/电穿孔仪</td><td>BEX CO., LTD</td><td>CUY21 EDIT II</td><td>电穿孔参数：30 V，3 次脉冲，间隔 1 秒，脉冲时长 = 50 ms，单极性</td></tr><tr><td>Rosa-LSLtdTomato 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7914</td><td>Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td></tr><tr><td>尖头钝头解剖剪</td><td>Fisher Scientific</td><td>28251</td><td></td></tr><tr><td>尖头解剖剪</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDI130</td><td></td></tr><tr><td>剃毛器</td><td>-</td><td>-</td><td>也可使用脱毛膏。</td></tr><tr><td>编织丝线缝合线</td><td>Ethicon</td><td>682G</td><td>3/8 圆弧，规格：5-0，针长：18 mm，线长：75 cm。也可使用皮肤缝合钉。</td></tr><tr><td>细尖超精细镊&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>薄型吸水纸</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7050</td><td>使用前经 0.22 &amp;micro;m 无菌滤器过滤，用于显微注射。</td></tr></tbody></table>

利用体细胞基因组编辑小鼠模型 体内 显微注射与电穿孔

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

生殖系基因工程小鼠模型（G-GEMMs）为研究 体内 基因功能在发育、稳态及疾病中的作用。然而，品系的建立与维持所需的时间和成本较高。近年来，CRISPR介导的基因组编辑技术的进步使得可通过直接靶向特定细胞、组织或器官，从而构建体细胞基因工程小鼠模型（S-GEMMs）。
输卵管（在人类中称为输卵管）被认为是最常见的卵巢癌——高级别浆液性卵巢癌（HGSCs）的起源组织。HGSCs起始于输卵管远离子宫的远端区域，该区域毗邻卵巢，而非输卵管的近端部分。然而，传统的HGSC小鼠模型靶向整个输卵管，因此无法准确模拟人类疾病的真实情况。本文介绍了一种将DNA、RNA或核糖核蛋白（RNP）溶液显微注射至输卵管管腔内的方法 体内 通过电穿孔技术靶向输卵管特定区域的黏膜上皮细胞。该方法在癌症建模中具有多项优势：1）电穿孔的区域/组织/器官及具体部位具有高度可适应性；2）结合特异性启动子驱动Cas9表达时，可灵活靶向多种细胞类型（细胞可塑性高）；3）电穿孔细胞数量具有较高灵活性（相对较低频率）；4）无需特定小鼠品系（可实现免疫健全的疾病建模）；5）基因突变组合具有高度灵活性；6）结合Cre报告小鼠品系时，可实现对电穿孔细胞的示踪。因此，这一经济高效的方法能够有效模拟人类癌症的发生过程。

图1 和 图2 分别展示显微注射针的制备和手术区域的设置 体内 显微注射与小鼠输卵管电穿孔。手术过程中，通过在背部皮肤做切口暴露雌性生殖道。图3A) 和麻醉状态下 Rosa-LSLtdTomato（Gt(ROSA)26Sor）小鼠的体壁tm14(CAG-tdTomato)Hze/J)17 小鼠。使用止血钳夹住通道上方的脂肪垫，以保持其暴露并固定。图3B含 PCS2 CreNLS 质粒的注射溶液18 400 ng/µL 将一定浓度的物质注入输卵管盘曲部分的壶腹部（标记为AMP），并使其在输卵管腔内扩散。图3C，D）。尽管本研究中使用PCS2 CreNLS质粒获得了代表性结果，但所述方法可在注射溶液中灵活替换为其他DNA、RNA或核糖核蛋白复合物（RNP），用于小鼠输卵管内的CRISPR/Cas介导的基因编辑。随后，将1 mm或3 mm镊形电极置于输卵管远端两侧，使输卵管位于两电极之间，以实现基于电穿孔的递送。
术后4天采集输卵管，通过去除系膜以观察电穿孔的特异性。使用1 mm或3 mm镊形电极时，被TdTomato标记的靶向区域局限于输卵管远端上皮（图4A、D）。通过使用不同尺寸的电极可进一步控制该靶向区域的大小。使用3 mm镊形电极时，靶向区域覆盖了更大的壶腹部（AMP）范围（图4B、C），而使用1 mm镊形电极则仅靶向最远端的伞部（INF）（图4E、F）。采集的输卵管经固定后，采用蔗糖梯度处理，并利用冷冻切片机进行切片以进行详细分析。切片使用Hoescht 33342和Phalloidin分别对细胞核和细胞骨架进行复染，随后通过点扫描共聚焦显微镜成像。在靶向区域内，被电穿孔的细胞（由TdTomato标记）随机分布于未被电穿孔（TdTomato阴性）的细胞之间（图4G）。此外，电穿孔的细胞仅局限于黏膜上皮层，未在下方的间质层或肌层中发现（图4G、H）。最后，为确认CRISPR-Cas介导的基因编辑，可通过荧光激活细胞分选（FACS）分离TdTomato阳性细胞，用于DNA提取及MiSeq测序12。
<img alt="使用TdTomato和Hoescht 33342标记的昆虫肠道明场显微镜观察；细胞结构分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：成功验证 体内 术后4天对输卵管上皮细胞进行注射和电穿孔 (A-C使用3 mm镊形电极进行电穿孔。通过去除输卵管系膜使输卵管展开，以更清晰地观察电穿孔的特异性A）。通过TdTomato表达鉴定的电穿孔区域局限于远端输卵管，标记为AMP（B，C). (D-F) 使用1 mm镊型电极进行电穿孔。通过去除输卵管系膜使输卵管伸展，以更清晰地观察电穿孔的特异性D）。电穿孔区域被限定于输卵管最远端的漏斗部（标记为INF）E，F). (G，H) 输卵管远端在电穿孔 PCS2 CreNLS 质粒后第 4 天的横切面。电穿孔细胞用 TdTomato 标记（G）局限于上皮单层（H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了显微注射及 体内 小鼠输卵管区域限制性CRISPR介导基因组编辑的电穿孔法

生殖系基因工程小鼠模型（G-GEMMs）为研究基因在发育、稳态及疾病中的体内功能提供了重要见解。

本方案是一种在小鼠输卵管中进行基因组操作的高度灵活方法。它能够在免疫功能健全的环境中，形成周围被未编辑细胞包围的散在突变细胞。这一特性有利于研究癌症的起始过程。该技术的主要优势在于其高度的适应性，能够通过简单互换突变组合，灵活地靶向特定的器官、区域、部位或细胞类型，且无需依赖特定的小鼠品系。该方法可轻松适用于具有管腔的器官以及实质器官。首先，使用微量移液器拉针仪将玻璃毛细管拉制成尖锐的尖端。使用一对锥形超细尖镊子，在解剖显微镜下剪断拉制好的毛细管末端，形成开口。注意开口不宜过大，以免损伤输卵管并影响缓慢注射。接下来，将无菌手术器械、显微镜、显微操作仪和电穿孔仪放置在洁净无菌的工作台面或生物安全柜内。将加热垫加热后置于一个干净且配备齐全的笼子下方。向培养皿中倒入无菌的1×PBS。使用一把干净的剪刀，将吸水纸剪成一乘一厘米的方块。将这些毛细管针浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中浸泡。接着，将拉制好的毛细管针安装到由磁性底座固定的钳夹式显微操作器上。用移液器吸取2 µL注射溶液，滴加到无菌培养皿中。在显微镜下观察的同时，使用连接在显微操作仪上的气压注射器，缓慢吸取一到两微升注射液进入显微注射针中。注意避免吸入气泡。将一只六至八周龄的雌性小鼠麻醉并皮下注射卡洛芬后，将其置于加热的吸水纸上，背部朝上放置。在每只眼睛上涂抹眼用润滑剂，以防止手术过程中眼睛干涩。使用镊子轻夹脚趾，确认麻醉成功后，去除切口部位周围的背部毛发，并用消毒剂擦拭裸露的皮肤。用一对直头钝镊夹住裸露的皮肤，沿身体正中线用无菌剪刀做一处长约1厘米的切口。使用无菌 Adson 镊子夹住切口一侧并轻轻提起。然后，使用无菌有齿弯镊，从正中切口开始，向侧方轻轻分离皮肤与体壁。找到肾脏下方的脂肪垫后，使用无菌直头钝镊，在脂肪垫正上方夹住体壁。使用无菌的尖头解剖剪在体壁上做一个小切口，注意避开血管。继续用直头钝头镊夹住体壁的同时，将无菌的钝头弯镊插入切口，扩大体壁上的切口。用钝头弯镊夹住可见的脂肪垫，并将其从切口中拉出，以暴露卵巢、输卵管和子宫。使用无菌的 bulldog 夹夹住脂肪垫，保持生殖道暴露。将麻醉后生殖道已暴露的小鼠小心地放置在解剖显微镜的载物台上。调节显微操作仪，使装有溶液的注射针在显微镜下可见。然后调整显微镜，以便于观察卵巢、输卵管和子宫。使用一对无菌的锥形超细尖镊子夹住待注射的输卵管部位，该部位必须与显微注射针的方向对齐。调整显微操作仪，用显微注射针刺穿输卵管，同时使用锥形超细尖镊子将输卵管轻轻推至针尖上。轻柔移动显微注射针，确认其已插入输卵管内。在观察蓝色溶液流动及输卵管管腔扩张的情况下，缓慢向输卵管内注射1 µL注射液和5%过滤后的台盼蓝溶液。避免将气泡注入管腔内。注射后，将针头从输卵管中取出，并用预先浸有PBS的吸水纸覆盖待处理区域。用一对电极镊子夹住预先浸湿的纸和待处理区域，然后将其从身体上拉开。使用30伏特电压，对目标区域施加三个单极脉冲，每个脉冲持续50毫秒，脉冲间隔为1秒。电穿孔后，移除吸水纸，将小鼠放回加热垫上。松开蚊式止血钳，小心地将暴露的生殖道推回体壁下方。在两侧输卵管完成电穿孔并放回体壁下方后，使用持针器夹住缝合针。用无菌弯齿镊夹起并提起切口一侧的组织，然后使用持针器操作缝线，缝合伤口。将小鼠移至放置在加热垫上的清洁笼中，并持续观察直至小鼠恢复活动。使用3毫米或1毫米镊形电极进行电穿孔后，TdTomato标记的靶向区域仅局限于输卵管远端上皮。使用3毫米镊形电极时，靶向区域覆盖了更大部分的壶腹部，而使用1毫米镊形电极时，靶向区域仅限于最远端的伞部顶端。在靶向区域中，由 TdTomato 标记的电穿孔细胞随机分布于未电穿孔的细胞之间。此外，电穿孔细胞仅局限于黏膜上皮层，在其下方的间质层或肌层中未观察到。为确认 CRISPR 介导的基因组编辑，可通过 FACS 分选分离出荧光细胞，进而提取 DNA 并进行测序。这使我们能够量化靶向等位基因的频率，并追踪样本间的独特通讯，以在免疫健全的环境中跟踪原发性肿瘤和转移灶的体内冠状面演化过程。

somatic-genome-engineered-mouse-models-using-vivo-microinjection

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

使用 体内 显微注射和电穿孔的体细胞基因组工程小鼠模型

一种将质粒DNA导入小鼠视网膜细胞以开展功能获得或功能缺失研究的方法 体内...

体内 电穿孔转染发育中小鼠视网膜

尽管下丘脑在功能和医学上具有重要意义， 在子宫内 其发育过程的遗传操作鲜有尝试。本文展示了一种详细的实验流程 在子宫内...

通过遗传操作调控小鼠发育期下丘脑 在子宫内 电穿孔

锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等设计核酸酶可通过激活非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）通路，对小鼠着床前胚胎的基因组进行修饰。这些技术进步使得能够快速生成具有精确遗传修饰的小鼠。...

利用设计核酸酶进行小鼠基因组编辑

本文描述了小鼠睾丸的显微注射与电穿孔技术 在 体内...

体内 小鼠睾丸显微注射与电穿孔

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

本实验方案描述了通过向受精卵显微注射CRISPR-Cas9系统和供体DNA，高效制备基因盒敲入和条件性敲除（floxed）小鼠的方法。...

通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和Flox等位基因

本文介绍一种简单的方法，旨在高效产生名为“CRISPR RNP...

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

本文介绍了一种利用胚胎干细胞构建基因修饰小鼠模型的实验方案，尤其适用于大片段DNA的基因敲入（KI）。该方案结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行优化，与传统的依赖同源重组的线性化DNA靶向方法相比，显著提高了基因敲入效率。...

利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

利用具有常见患者突变驱动的免疫健全、同源性肿瘤模型进行临床前测试，对免疫治疗研究至关重要。本方案描述了一种通过电穿孔递送质粒DNA来构建脑肿瘤小鼠模型的方法，该模型可模拟常见患者突变，从而提供一种准确、可重复且稳定的小鼠模型。...

建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA

基因组编辑改进效率 通过 输卵管核酸递送（I-GONAD）方法与传统显微注射技术相当，后者需要从供体雌性动物中收集受精卵，并将其移植到假孕雌性动物体内。本方案通过引入CRISPR/Cas9诱导的突变，证明了该方法的有效性 ROSA26...

基因组编辑技术的改进 通过 基于输卵管核酸递送的 在体 内 电穿孔技术用于基因敲除小鼠的制备

学习小鼠输卵管体内显微注射与电穿孔技术，实现CRISPR介导的体细胞基因组编辑。该方法可在免疫健全环境中创建散在突变细胞，用于研究肿瘤发生机制，无需特定转基因小鼠品系。

利用体细胞基因组编辑小鼠模型体内显微注射与电穿孔

探索更多视频

利用体细胞基因组编辑小鼠模型 体内 显微注射与电穿孔

探索更多视频

利用体细胞基因组编辑小鼠模型体内显微注射与电穿孔