Name: 分离、表征和总 DNA 提取以鉴定真菌异养植物中的内生真菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学习从真菌异养植物中分离和表征内生真菌的实验方法，包括无菌培养、显微观察和DNA提取技术。该方法有助于研究植物与真菌的共生关系及其生态功能。

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感谢圣保罗研究基金会（FAPESP，项目号：2015/26479-6）和国家科学技术发展委员会（CNPq，项目号：447453/2014-9）的资助。JLSM 感谢 CNPq 提供的生产力研究基金（项目号：303664/2020-7）。MPP 感谢卡洛斯·查加斯博士高级别学术人员培训基金会（Capes，硕士奖学金，项目号：88887.600591/2021-00）以及 CNPq 的支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

植物样品的表面消毒是本方案中最关键的步骤之一。在最后一次洗涤液滴入的PDA培养皿中应尽可能无任何污染。在分离培养皿中，细菌污染通常比空气传播的产孢真菌更为常见，因为植物组织内也普遍存在内生细菌3,11。因此，在接种组织片段时，向培养基中添加抗生素至关重要。联合使用不同类型的抗生素可获得更佳效果，从而实现更广谱的抑菌作用。另一个需要注意的重要问题是真菌分离过程中的固有偏差，使用PDA和AA培养基不可避免地会筛选出某些真菌种类，而对其他种类不利。联合使用其他培养基可在一定程度上减小这种偏差，但无法完全消除此类局限性9。
通常，在培养皿中生长时能够产孢的真菌，在低温或非低温的保藏方案中均表现出较高的存活率；而不能产孢的菌株可能无法耐受卡斯特拉尼法（Castellani's）或矿物油保藏法34,35,...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

内生真菌按定义是指那些以不显眼的方式（即不对宿主造成伤害）侵染植物器官和组织内部的真菌1,2。这些真菌可与宿主植物呈中性或互利关系，可能赋予植物对病原体和不利环境条件的抗性，并可能参与合成对植物有益的化合物（如生长因子及其他植物激素）1,3。菌根内生真菌是指能够与植物建立菌根共生关系并参与养分转运的真菌4。在兰科植物中，绝大多数物种的种子萌发以及该科所有植物的幼苗定植都依赖于与菌根内生真菌的相互作用5。在这些情况下，菌异养型兰科植物表现出对其菌根共生真菌的完全依赖，因其整个生命周期所需的矿物质养分和碳化合物均依赖于这些真菌的供给6。因此，在研究菌异养生活策略时，分离和鉴定与其共生的真菌是基本前提。此外，目前对于内生真菌在菌异养植物中的作用，甚至这些真菌的真实多样性，仍知之甚少7,8。
内生真菌的研究可进行如下 通过 不同的技术，传统上被称为非依赖培养或依赖培养的方法，例如：（a）直接观察，（b）真菌分离及形态学和/或分子鉴定，（c）植物组织总DNA提取及分子鉴定9在直接观察（a）中，可通过光学显微镜或电子显微镜在植物细胞和组织内部原位研究内生真菌。9，因为Pena-Passos等人详细描述了不同的显微镜实验方案10通过分离方法（b），可根据菌落、菌丝以及繁殖或抗性结构的形态特征对内生真菌进行表征。此外， 通过 分离技术，可通过DNA提取、分子鉴定序列（条形码或指纹图谱）的扩增及测序，对分离物进行分子鉴定11后者技术（c）可在内生真菌仍处于植物组织内部时，通过DNA提取进行分子鉴定（高通量测序），随后进行文库构建和测序12.
此外，可将分离得到的真菌用于共生萌发试验，使用自养型或菌异养型兰科植物的种子。此类应用的一个实例是Sisti等人13开展的研究，该研究描述了菌异养型兰科植物Pogoniopsis schenckii在与其部分分离物（包括非菌根内生真菌）共同作用下的种子萌发及原球茎早期发育过程。所采用的共生萌发实验方案已在Pena-Passos等人10发布的视频中进行了详细展示。通过从不同植物器官中分离真菌，可针对植物-真菌互作的性质开展多样化的研究，例如探究该互作关系的生态学或生理学特征，以及真菌向植物转移养分的相关机制9。
第1节中介绍的方法基于地下器官样本的采集，因为这些器官在采集过程中最具挑战性，且具有重要的研究价值，因为菌根内生真菌主要定殖于这些器官。然而，所包含的两种方案（步骤1.1和1.2）均可应用于其他菌异养植物器官（如根状茎、花茎和果实）。步骤1.1中描述的采集方法适用于分离内生真菌（第2节），用于后续的形态学表征（第4和第5节）和/或提取总DNA以进行菌株鉴定（第6节）。而步骤1.2中描述的采集方法则专门用于植物组织总DNA的提取，以进行高通量测序（metabarcoding）分析（第7节）。第3节介绍了四种丝状真菌的保存与保藏方法，其中两种适用于短期保存（3–6个月），另外两种适用于长期保存（>1年）。形态学表征（第4和第5节）可结合分子鉴定方法，以增强鉴定的准确性，并提供有关真菌宏观和微观形态的重要信息。图1总结了下文所述的整套技术流程。
<img alt="植物样品真菌分析流程图；包括DNA提取和分光光度法定量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65135/65135fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：本研究方法的示意图总结。 植物样品采集及真菌的分离、保藏，以及通过依赖培养和非依赖培养方法进行的分子鉴定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65135/65135fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>胶带</td><td></td><td></td><td>（任何公司生产，用于微形态学分析中的胶带贴片法）</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5354</td><td>（用于植物片段的接种；可使用其他抗生素——参见步骤 2.2.1）</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td></td><td></td><td>（任何公司生产，用于多个步骤中的材料灭菌）</td></tr><tr><td>细菌学琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>（用于多个步骤）</td></tr><tr><td>C1、C2、C3、C4、C5 和 C6 溶液</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>（随 DNeasy PowerSoil 试剂盒购入）</td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Merck/Eppendorf</td><td>5810 G</td><td>（用于真菌分离物的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Merck</td><td>CLS430828</td><td>（用于样品收集）</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>（用于真菌分离物的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>刚果红</td><td>Supelco</td><td>75768</td><td>（用于菌丝染色）</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Merck</td><td>BR114831</td><td>（用于多个步骤）</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Supelco</td><td>100983</td><td>需进行适当稀释（用于多个步骤）</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>（用于真菌分离物的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Merck</td><td>WHA10010155</td><td>（用于多个步骤）</td></tr><tr><td>玻璃试管</td><td>Merck</td><td>CLS7082516</td><td>（用于稻谷未脱壳状态下的冷冻保存）</td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>Supelco</td><td>20411</td><td>（用于稻谷未脱壳状态下的冷冻保存）</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>或右旋糖（用于蛭石冷冻保存）</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>或丙三醇（用于蛭石冷冻保存，制备 LPCB）</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935</td><td>（用于真菌分离物的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>乳酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td>（用于制备 LPCB——菌丝染色）</td></tr><tr><td>乳酸酚蓝溶液（LPCB）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td>（用于菌丝染色）</td></tr><tr><td>超净工作台</td><td></td><td></td><td>（I 级，任何公司生产，用于多个步骤）</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td></td><td></td><td>（任何公司生产，用于观察菌丝）</td></tr><tr><td>MB 离心柱</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>（随 DNeasy PowerSoil 试剂盒购入）</td></tr><tr><td>甲基蓝（棉蓝）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5528</td><td>（用于制备 LPCB——菌丝染色）</td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL）</td><td>Merck</td><td>HS4323</td><td>（用于真菌分离物的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>微量离心管（2 mL）</td><td>Merck</td><td>BR780546</td><td>（用于多个步骤）</td></tr><tr><td>矿物油</td><td></td><td></td><td>（用于真菌分离物的保存）</td></tr><tr><td>纸袋</td><td></td><td></td><td>平均尺寸 150 mm × 200 mm（用于样品收集）</td></tr><tr><td>培养皿（玻璃，120 mm × 20 mm）</td><td>Merck/Pyrex</td><td>SLW1480/10D</td><td>（可高压灭菌，用于真菌载片培养，建议使用较高者）</td></tr><tr><td>培养皿（玻璃，50 mm × 17 mm）</td><td>Merck/Aldrich</td><td>Z740618</td><td>（用于真菌分离物的纯化）；或可选用：聚苯乙烯培养皿（无菌，&amp;gamma;射线辐照，不可高压灭菌）</td></tr><tr><td>培养皿（玻璃，80 mm × 15 mm）</td><td>Merck/Brand</td><td>BR455732</td><td>（用于植物片段的接种）；或可选用：聚苯乙烯培养皿（无菌，&amp;gamma;射线辐照，不可高压灭菌）</td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1037</td><td>（用于真菌分离物的总 DNA 提取，制备 LPCB）</td></tr><tr><td>瓷研钵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td>（用于真菌分离物的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>瓷研杵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247502</td><td>（用于真菌分离物的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）</td><td>Millipore</td><td>P2182</td><td>（用于多个步骤）</td></tr><tr><td>PowerBead 管</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>（随 DNeasy PowerSoil 试剂盒购入）</td></tr><tr><td>快速封片剂（Entellan）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.0796</td><td>（用于真菌载片培养）</td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Supelco</td><td>717185</td><td>（用于稻谷未脱壳状态下的冷冻保存）</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>（用于真菌分离物的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>月桂基硫酸钠盐（用于真菌分离物的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>次氯酸钠（含 2% 活性氯）</td><td></td><td></td><td>（市售产品，用于表面消毒）</td></tr><tr><td>土壤 DNA 提取试剂盒（DNeasy PowerSoil 试剂盒）</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>（用于植物器官的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>分光光度计 - Nanodrop 2000/2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>（用于植物器官的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td></td><td></td><td>（=解剖显微镜，任何公司生产，用于宏观形态学分析）</td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td>（用于植物片段的接种）</td></tr><tr><td>恒温金属浴</td><td>Merck/Eppendorf</td><td>EP5362000035</td><td>（或其他公司产品）</td></tr><tr><td>组织匀浆仪与细胞破碎仪</td><td>SPEX SamplePrep</td><td></td><td>2010 Geno/Grinder — 自动化组织匀浆仪与细胞破碎仪（用于植物器官的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>甲苯胺蓝 O</td><td>Sigma-Aldrich/Harleco</td><td>364-M</td><td>（用于菌丝染色）</td></tr><tr><td>海藻糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531</td><td>（用于蛭石冷冻保存）</td></tr><tr><td>Tris 碱溶液（Tris）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1699</td><td>（用于真菌分离物的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>未脱壳稻米</td><td></td><td></td><td>（用于冷冻保存）</td></tr><tr><td>U 形玻璃棒</td><td></td><td></td><td>（或进行适当改装——参见步骤 5.4.1，用于真菌载片培养）</td></tr><tr><td>蛭石</td><td></td><td></td><td>细颗粒（用于蛭石冷冻保存）</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Sigma-Aldrich/BenchMixer</td><td>BMSBV1000</td><td>（用于真菌分离物的总 DNA 提取）</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td>（用于蛭石冷冻保存）</td></tr></tbody></table>

分离、鉴定及全基因组dna提取以鉴定菌根异养植物中的内生真菌

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

菌异养植物表现出菌根依赖性中最极端的形式之一，已完全丧失自养能力。与这些植物密切关联的真菌对其而言如同其他任何重要资源一样必不可少。因此，研究菌异养物种时最关键的技术之一就是能够用于探究其相关真菌的方法，尤其是定殖于根部和地下器官的真菌。在此背景下，通常应用依赖培养和不依赖培养的内生真菌鉴定技术。分离真菌内生菌可实现其形态学鉴定、多样性分析，并可保存接种物用于兰科种子的共生萌发。然而，已知植物组织中存在大量不可培养的真菌。因此，不依赖培养的分子鉴定技术能够更全面地覆盖真菌物种的多样性和丰度。本文旨在为开展两种研究方法——依赖培养和不依赖培养的方法——提供必要的方法学支持。关于依赖培养的实验方案，本文详细描述了从野外采集点到实验室条件下植物样品的采集与保存流程，以及从菌异养植物的地下器官和地上器官中分离丝状真菌、建立分离菌株保藏体系、通过载片培养法对菌丝进行形态学表征，以及通过总DNA提取进行真菌的分子鉴定。在不依赖培养的技术方面，详细流程包括为宏基因组分析采集植物样品，以及使用商业化试剂盒从无叶绿素植物器官中提取总DNA。最后，本文还提出了后续实验流程（如聚合酶链式反应 [PCR]、测序）的衔接方案，并介绍了相应的分析技术。

在分离方案中，若考虑到最后一次冲洗用水存在污染，且在接种了组织片段的培养皿中也检测到污染，则可根据污染物的类型采取不同的应对措施（表1）。如果污染源为生长迅速且产孢能力强的真菌，或对所选抗生素具有抗性的快速增殖细菌，则必须从头重新进行该操作流程。相反，若真菌污染物生长缓慢或不产孢，则可在后续步骤中简单地避免对其的分离操作。最后，对于增殖速度较慢的细菌污染，在后续步骤中也较易避免，尤其是在恢复菌丝的纯化阶段。
在前述所有情况下，理想的处理方案是使用其他样本重新进行消毒处理，并将植物材料接种到含有其他抗生素的培养基中，这些抗生素应具有更广谱的抗菌活性，以应对污染初始培养皿的耐药细菌。然而，考虑到采集新样本以及获取菌异养植物器官所面临的困难，某些污染情况也可在后续的实验步骤中成功解决，如表1所示。
<table border="1" fo:...

本文旨在提供详细的实验方案，用于分离植物相关内生真菌、长期保存分离物、形态学表征，以及提取总DNA，以用于后续的分子鉴定和宏基因组分析。

分离、鉴定及全基因组DNA提取以鉴定菌根异养植物中的内生真菌

菌异养植物是菌根依赖性中最极端的形式之一，已完全丧失自养能力。正如……一样重要

本文介绍的技术可用于研究与不同植物器官相关的内生真菌群落。通过分离内生真菌，可对其进行鉴定，并可用于共生萌发等其他技术。首先，准备直径8至10厘米的PDA培养基培养皿，每升添加3毫升抗生素。使用前将培养基培养皿在36摄氏度下孵育24小时，以检查是否存在污染。次日，采用标准程序对健康的菌根异养植物片段进行表面消毒，并将其置于无菌培养皿中。为评估样品表面消毒的效果，将样品最后一次洗涤时使用的蒸馏水滴加几滴至PDA培养基上进行接种。接下来，使用灼烧过的手术刀和镊子将样品切成 0.2 厘米厚的片状。切分样品以增大与培养基接触的表面积。将地下器官的五个片段尽可能彼此远离地放置于添加抗生素的 PDA 平板中，且勿接触培养皿边缘。用保鲜膜密封培养皿，并在25至27摄氏度的黑暗条件下保存五天。继代培养前一天，使用每升含5至7克AA培养基的培养基制备直径为5厘米的培养皿，并在36摄氏度下孵育24小时。为纯化真菌分离物，可根据颜色、生长模式、质地和菌落边缘形态对PDA培养皿上的菌落进行区分。然后在培养皿底部标记菌落边缘，并用编码标识菌落。用灭菌木质牙签的尖端从已识别真菌菌落的边缘挑取少量菌丝，在AA平板上划线，距离培养皿边缘1厘米处连续划三条平行线，线间相距1厘米。使用标签纸和铅笔在AA平板上标记相应的代码。将平板密封后，在25至27摄氏度的黑暗条件下培养三天。培养结束后，仔细观察平板，识别形成单个菌落的细小菌丝。使用永久性记号笔标出单个菌落的范围。用灭菌牙签切取含有菌落的部分培养基，将切下的培养基块转移至不含抗生素的新PDA培养皿中央。用分离株编号标记培养皿后，用保鲜膜密封，并于25至27摄氏度避光培养7至14天。采用卡斯特拉尼法（Castellani's method）保存真菌分离物时，首先向已灭菌的2毫升微量离心管中加入0.5毫升蒸馏水。使用已灭菌的牙签，从已纯化培养物的菌丝边缘切取0.5厘米×0.5厘米的立方体培养基块。将4至6块培养基块放入盛有蒸馏水的微量离心管中。将试管避光保存于 25 摄氏度，保存时间根据需要而定。使用时，取出一个方块状培养物，置于新的 PDA 培养皿中央，以培养保存的分离菌株。开始进行压片染色法时，在洁净的玻璃载片上滴加一滴甲苯胺蓝-O 染液。该技术可使用不同的染色剂。用灭菌的牙签小心地从培养的菌株中挑取一些菌丝，放入染色剂液滴中。盖上盖玻片，在光学显微镜下观察。对于胶带粘贴法，先在干净的载玻片上滴加一滴乳酸酚棉蓝染液。剪取一段大小适合载玻片及中央染液滴的透明胶带。将胶带的粘性面向下接触菌丝表面，尽量收集少量菌丝，避免用力按压或采集过多。然后将胶带贴在载玻片上，确保染色面与收集到的菌丝接触。在胶带上滴加一滴水，盖上盖玻片，再置于光学显微镜下观察。将菌异养植物器官片段接种于PDA培养基上5天后，可观察到从片段内部伸出的丝状真菌菌丝体的小群落生长情况。在纯化分离物接种后的7至14天内，可在PDA培养基上观察到纯真菌分离物菌落呈离心式生长，形成单一的圆形菌丝体。可能的污染易于识别，会破坏菌落在生长形态、颜色及培养基中色素产生方面的均一性。从腐生兰类植物无叶兰（Wullschlaegelia aphylla）的纺锤形根部分离出的一个菌落呈不透明状，培养基中无扩散性色素或渗出物。菌落上表面呈白色至灰色，下表面呈褐色。菌丝为气生且丰富，菌落边缘不规则且呈气生状。菌落具有绒毛状质地，表面呈皱褶状，无宏观结构。经过乳酸酚棉蓝和甲苯胺蓝-O对菌丝染色后，原本在未染色菌丝中不易观察的结构得以显现，从而便于鉴定。本文所述的真菌分离方法也可应用于绿色植物，以鉴定其内生真菌。分离得到的真菌可用于共生萌发试验。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

分离、表征和总 DNA 提取以鉴定真菌异养植物中的内生真菌

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利用iChip技术分离土壤微生物

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分离、鉴定及全基因组DNA提取以鉴定菌根异养植物中的内生真菌

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