Name: 富集分枝杆菌的天然和重组细胞外囊泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 了解分枝杆菌细胞外囊泡的富集方法，用于疫苗开发与微生物学研究。本方案涵盖天然mEVs分离及含mCherry和EsxA的重组囊泡构建技术。

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作者衷心感谢Sarah M. Fortune教授慷慨分享M. smegmatis mc2155菌株。同时感谢Servier医学艺术（smart.servier.com）为图1提供了一些基本图形元素。作者诚挚感谢实验室其他成员在进行mEV富集过程中长期使用摇床培养箱、离心机和超速离心机时所给予的耐心配合与支持。同时感谢实验室助理Surjeet Yadav先生始终确保必要的玻璃器皿和耗材充足且易于取用。最后，作者感谢THSTI行政、采购和财务团队在项目顺利实施过程中提供的持续支持与帮助。

所有作者声明，本研究工作是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系/利益的情况下进行的。

由于开发一种优于卡介苗（BCG）并能取代它的新型结核病疫苗仍面临巨大挑战，作为替代策略，多个研究团队正致力于发现不同的结核病亚单位疫苗，以增强BCG的效力并延长其保护持续时间48,49。鉴于细菌胞外囊泡（bEVs）作为潜在亚单位成分及天然佐剂正受到越来越多关注50,51，稳定富集足量的分枝杆菌胞外囊泡（mEVs）以用于后续检测与分析已成为关键步骤。本实验方案正是基于上述研究需求，旨在从无菌培养的分枝杆菌及其重组株中富集mEVs。
在对耻垢分枝杆菌（Msm）胞外囊泡（EVs）进行详细的质谱蛋白质组学分析时，Prados-Rosales 等 鉴定了丰度最高的10种蛋白质30。我们进一步推测，经过充分的分子改造后，其中任意一种蛋白应足以将目标外源蛋白带入mEVs中。有趣的是，Cfp-29因其...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

尽管已研发并接种了多种针对传染病的疫苗，但时至今日，人类死亡总数中仍有约30%源于传染性疾病1。在结核病（TB）疫苗——卡介苗（Bacillus Calmette Guerin, BCG）问世之前，结核病是头号致死病因（每10万人口中约有10,000至15,000例）2。随着BCG疫苗的接种以及一线和二线抗结核药物的广泛可及，到2022年，结核病相关死亡人数已显著下降至每年约100万例（即每10万人口中约15–20例）1。然而，在全球结核病流行地区，结核病相关死亡率仍维持在每10万人口约100–550例的水平1。尽管专家们认识到导致这些差异的多种原因，但BCG疫苗介导的保护作用甚至无法持续到生命第一个十年，似乎是其中最主要的原因3,4,5,6,7。因此，鉴于联合国提出的更新版“可持续发展目标”以及世界卫生组织（WHO）的“终结结核病策略”，全球正在协同努力，开发一种远优于BCG的新型疫苗，有望提供对结核病的终身保护。

为实现这一目标，目前多个研究团队正在评估经过修饰或重组的卡介苗（BCG）菌株、除BCG外的非致病性及减毒分枝杆菌物种，以及亚单位候选疫苗8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。通常，亚单位疫苗是选择性地装载了少量纯化的（约1–6种）全长或截短的病原体免疫原性蛋白的脂质体。然而，由于这些蛋白容易错误折叠成非天然构象，和/或所装载蛋白之间发生随机且无功能的相互作用，亚单位疫苗常常缺乏天然且相关的表位，因此无法有效激活免疫系统14,19,20。

因此，细菌的细胞外囊泡（EVs）作为有前景的替代方案，研究进展迅速21,22,23,24,25,26。通常，细菌EVs（bEVs）包含其细胞组分的一部分，包括部分核酸、脂质以及数百种代谢物和蛋白质27,28。与人工加载少量纯化蛋白的脂质体不同，bEVs含有数百种天然加载且正确折叠的蛋白质，更易于激活免疫系统，尤其在无需佐剂或Toll样受体（TLR）激动剂辅助的情况下也具有较强的免疫刺激能力27,28,29。正是基于这一研究方向，我们及其他研究者探索了分枝杆菌EVs作为BCG潜在亚单位增强剂的应用价值30。尽管人们担忧bEVs的抗原载量不均一，但来自减毒Neisseria meningitidis的EVs已成功用于人类，预防B群脑膜炎球菌感染31,32。
至少从理论上讲，能够有效增强BCG作用的最佳细胞外囊泡（EVs）应是来源于致病性细菌的EVs。然而，从致病性分枝杆菌中富集EVs成本高昂、耗时较长且存在安全风险。此外，由病原体产生的EVs可能更具致病性而非保护性。鉴于潜在风险，本文报道了一种经过充分验证的实验方案，用于从体外无菌培养的非致病性分枝杆菌（Msm）所产生的EVs中进行有效富集。
然而，尽管非致病性分枝杆菌编码多种病原体蛋白的直系同源物，但缺乏若干对充分激活免疫系统以实现保护性免疫至关重要的疫苗抗原或致病蛋白表位33。因此，我们还探索通过分子工程手段构建并富集耻垢分枝杆菌（Msm）的重组细胞外囊泡（EVs），使得在Msm中表达并翻译的任何目标致病蛋白的大部分均能被转运至其EVs中。我们假设，将目标蛋白与Msm EVs中丰度最高的10种蛋白中的一种或多种融合表达，将有助于实现此类转运。
在我们实验室开始对分枝杆菌囊泡（mEVs）的富集方法进行标准化时，Prados-Rosales 等人于 2011 年首次报道了在体外对 mEVs 进行可视化和富集的方法in vitro30。随后在 2014 年，该研究团队发表了其 2011 年方法的改进版本34。2015 年，Lee 等人也报道了一种独立标准化的 mEV 富集方法，同样来源于分枝杆菌的纯培养物35。结合上述两种方法34,35，并在充分标准化的基础上引入了一些我们的改进，本文描述了一种可常规用于从分枝杆菌纯培养物中富集 mEV 的实验方案36。
本文重点详细描述了Msm特异性EVs的富集方法，该方法是在已发表的分枝杆菌EVs通用富集方案36基础上的拓展。我们还详细说明了如何构建含有mCherry蛋白（作为红色荧光报告分子）和EsxA（Esat-6）37,38,39的重组mEVs（R-mEVs），其中EsxA是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的主要免疫原和潜在亚单位疫苗抗原。R-mEVs的富集方案与我们此前描述的从Msm中富集天然EVs的方法完全相同。

<table><tbody><tr><td>A2型生物安全柜</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>1300系列</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf, USA</td><td></td><td>5810 R</td></tr><tr><td>BstB1、HindIII、HpaI</td><td>NEB, USA</td><td></td><td>NEB</td></tr><tr><td>细胞密度计</td><td>GE Healthcare, USA</td><td></td><td>Ultraspec 10</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>双蒸水</td><td>Merck, USA</td><td></td><td>~18.2 MW/cm @ 25 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>Bio-Rad, USA</td><td></td><td>2 mm</td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>Bio-Rad, USA</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>EsxA特异性抗体</td><td>Abcam, UK</td><td></td><td>兔多克隆抗体</td></tr><tr><td>柠檬酸铁铵</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>落地式离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>Sorvall RC6 plus</td></tr><tr><td>玻璃器皿</td><td>Borosil, INDIA</td><td></td><td>1 L 三角烧瓶</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>HEPES 和氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>MaxQ 6000 &amp;amp; 8000</td></tr><tr><td>L-天冬酰胺</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>LB液体培养基和琼脂（Miller配方）</td><td>Hi Media, INDIA</td><td></td><td>Hi Media</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Tarsons, INDIA</td><td></td><td>Tarsons</td></tr><tr><td>mCherry特异性抗体</td><td>Abcam, UK</td><td></td><td>兔单克隆抗体</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>LG, INDIA</td><td></td><td>MC3286BLT</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9液体培养基</td><td>BD, USA</td><td></td><td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td></tr><tr><td>Middlebrook ADC 增菌液</td><td>BD, USA</td><td></td><td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>Spectronic 200 UV-Vis</td></tr><tr><td>NEB5a</td><td>NEB, USA</td><td></td><td>DH5a的衍生物</td></tr><tr><td>Optiprep (碘克沙醇)</td><td>Merck, USA</td><td></td><td>以60%水溶液形式提供</td></tr><tr><td>PCR纯化试剂盒</td><td>Hi Media, INDIA</td><td></td><td>Hi Media</td></tr><tr><td>pH计</td><td>Mettler Toledo, USA</td><td></td><td>Mettler Toledo</td></tr><tr><td>质粒DNA小量提取试剂盒</td><td>Hi Media, INDIA</td><td></td><td>Hi Media</td></tr><tr><td>培养板孵育箱</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>New Series</td></tr><tr><td>质粒pMV261</td><td>Addgene, USA *&lt;br/&gt; *该&amp;nbsp;&amp;nbsp;质粒&amp;nbsp;&amp;nbsp;已&amp;nbsp;&amp;nbsp;不&amp;nbsp;&amp;nbsp;再在该质粒库中提供</td><td></td><td>穿梭载体</td></tr><tr><td>高保真DNA聚合酶</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>Phusion DNA Plus Polymerase</td></tr><tr><td>Q5高保真DNA聚合酶</td><td>NEB, USA</td><td></td><td>NEB</td></tr><tr><td>制冷循环水浴锅</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>R20</td></tr><tr><td>Midddlebrook 7H11琼脂基础培养基</td><td>BD, USA</td><td></td><td>BBL Seven H11 Agar base</td></tr><tr><td>SOC培养基</td><td>Hi Media, INDIA</td><td></td><td>Hi Media</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>NEB, USA</td><td></td><td>NEB</td></tr><tr><td>吐温-80</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td></td><td>Optima L100K</td></tr><tr><td>超速离心管 - 14 mL</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td></td><td>聚全氟烷氧基树脂型 &amp;ndash; SW40Ti转子用超透明型</td></tr><tr><td>超速离心管 - 38 mL</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td></td><td>聚丙烯型&amp;ndash; SW28转子用乳白色型</td></tr><tr><td>超声清洗水浴器</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>超声仪 - 台式型号</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 一次性滤器</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>Nunc-Nalgene</td></tr><tr><td>30-kDa Centricon浓缩管</td><td>Merck, USA</td><td></td><td>Amicon Ultra离心滤器 - Millipore</td></tr><tr><td>3X FLAG抗体</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>400 mL离心瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>Nunc-Nalgene</td></tr><tr><td>50 mL离心管</td><td>Corning, USA</td><td></td><td>无菌，预包装</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细菌&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;</td><td>NEB, USA</td><td></td><td>NEB 5-alpha（DH5&amp;alpha;的衍生物）。</td></tr><tr><td>表达cfp29::mCherry的Msm</td><td>本研究</td><td></td><td>MC2&amp;nbsp;155</td></tr><tr><td>表达cfp29::esxA的Msm</td><td>本研究</td><td></td><td>MC2&amp;nbsp;155</td></tr><tr><td>表达&lt;em&gt;cfp29::esxA::3X FLAG&lt;/em&gt;的Msm</td><td>本研究</td><td></td><td>MC2&amp;nbsp;155</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;耻垢分枝杆菌 &lt;/em&gt;(Msm)</td><td>哈佛大学 Sarah M. Fortune 教授，美国</td><td></td><td>&amp;nbsp;MC&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;155</td></tr></tbody></table>

分枝杆菌天然及重组细胞外囊泡的富集

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

大多数细菌，包括分枝杆菌，均可产生细胞外囊泡（EVs）。由于细菌来源的细胞外囊泡（bEVs）含有细胞组分的特定子集，包括代谢物、脂质、蛋白质和核酸，多个研究团队已评估了天然或重组形式的bEVs作为亚单位疫苗候选物的保护效力。与天然EVs不同，重组EVs经过分子工程改造，可包含一种或多种目标免疫原。在过去十年中，不同研究团队已探索了多种生成重组bEVs的方法。然而，本文报道了在分枝杆菌中设计、构建和富集重组分枝杆菌细胞外囊泡（mEVs）的方法。为此，我们采用 Mycobacterium smegmatis (Msm)，一种无致病性的土壤分枝杆菌作为模型系统。我们首先描述了Msm天然EVs的分离与富集方法。随后，介绍了重组mEVs的设计与构建，该体系包含红色荧光报告蛋白mCherry或EsxA（Esat-6），后者是分枝杆菌中一种重要的免疫原蛋白 结核分枝杆菌我们通过将 mCherry 和 EsxA 的N端分别与一种小型 Msm 蛋白 Cfp-29 的C端融合来实现这一目标。Cfp-29 是 MsmEVs 中少数丰度较高的蛋白质之一。生成和富集来自 Msm 的重组 mEVs 的方案与生成和富集 Msm 天然 EVs 的方案相同。

我们使用 M. smegmatis 以耻垢分枝杆菌（Msm）作为模式分枝杆菌，用于展示天然及重组mEVs（R-mEVs）的富集过程。该流程图概括了mEVs富集的操作步骤。图1）也适用于Msm的R-mEVs以及Mtb的天然EVs的富集（具体细节见1.2节方案注释中的微小调整）。富集后的mEVs需通过透射电子显微镜负染色进行观察36 (图2A）。通常，Msm 特异性 EVs 会在 4th-6th 13 mL 6-60% 密度梯度的 1 mL 分级组分（图2B）。大约 80-100 µg 从2 L处于对数中期的无菌Msm培养物中常规获取EVs的蛋白当量。其直径通常在20 nm至250 nm之间图 2C).
我们实验室的一个长期目标是评估不同分枝...

本方案详细描述了从无菌培养的分枝杆菌中富集天然的分枝杆菌胞外囊泡（mEVs）的方法 Mycobacterium smegmatis （耻垢分枝杆菌，Msm）以及如何设计并富集含有mCherry（一种红色荧光报告蛋白）的重组MsmEVs。最后，通过富集含有EsxA蛋白的MsmEVs验证了这一新方法。 结核分枝杆菌

大多数细菌，包括分枝杆菌，均可产生细胞外囊泡（EVs）。由于细菌来源的细胞外囊泡（bEVs）含有部分细胞组分，……

富集分枝杆菌的细胞外囊泡有助于明确其内容物，解析其亚群，并为设计构建和生成主要利用疫苗候选抗原的重组细胞外囊泡提供依据。这些囊泡有六个亚群，来源于细菌表面的不同区域，且不具有保守的标志分子。因此，任何基于亲和力的方法都只能富集细胞外囊泡（EV）中的一部分。相比之下，我们的方法能够捕获所有产生的分枝杆菌EV。演示该实验操作的是我实验室的博士生Mohd Ilyas。首先，将1毫升野生型或重组耻垢分枝杆菌的甘油菌种加入含有10毫升预热的7H9液体培养基的50毫升离心管中。盖紧管盖并轻轻涡旋混匀，随后在37摄氏度、200至220转/分钟的条件下过夜培养。次日，当600纳米处的光密度值达到约1时，在室温下以3,200 ×g离心10分钟，弃去上清液至液体废弃物容器中。加入1 mL预热的Sautons培养基，轻轻重悬以获得均匀的悬浮液。用Sautons培养基定容至10 mL。再次离心，弃去上清液。洗涤后，将细菌细胞重悬于20毫升预热的Sautons培养基中，并在600纳米处测定光密度。将所需体积的细菌悬液接种至含有330毫升Sautons培养基的1至2升锥形瓶中，于37摄氏度、200转/分钟条件下培养，直至光密度达到0.3。第二天，按照之前的方法洗涤细胞一次，并将沉淀重悬于含有1/10 Tween 80的330毫升Sauton培养基中。将50毫升细胞悬液分装至六个1升的锥形瓶中，每个锥形瓶中预先加入280毫升预热的含有1/10 Tween 80的Sauton培养基。于37°C、200 RPM条件下培养，直至菌液光密度达到2至2.5。将两升处于对数中期的培养物加入六个400毫升的瓶子中，在4°C条件下以8,000 G离心20分钟。收集上清液以及预冷的灭菌锥形瓶或烧杯，并保留一份沉淀物用于分析程序。如果EVs为mCherry重组型，沉淀呈红色；若为野生型或非荧光蛋白重组型，则呈棕色。将培养上清液先通过0.45微米的一次性滤器过滤，再通过0.22微米滤器过滤，以彻底去除细菌残留。接着，在4,000 G、4摄氏度条件下，用15毫升双蒸水预清洗30千道尔顿超滤离心管20分钟。然后在相同条件下，用15毫升预过滤的冷萨顿培养基洗涤，以彻底去除化学物质残留。洗涤后，将15毫升过滤后的培养上清液加入浓缩管中，在4,000 G、4摄氏度条件下离心浓缩20分钟。将浓缩液转移至预冷的40毫升Oak Ridge离心管或新的50毫升Falcon离心管中。待全部两升培养滤液浓缩完成后，将浓缩液转移至经双蒸水冲洗并预冷的50毫升聚丙烯离心管中，并进行两步离心处理。先在 4,000 G 条件下离心，然后在 15,000 G 条件下离心。将离心后的浓缩物转移至预冷的 38.5 毫升超速离心管中，在 4 摄氏度下以 100,000 G 离心 4 小时。将上清液收集至预冷的 50 毫升新鲜 Falcon 离心管中。将超速离心管倒置在一张新的无绒吸水纸上，以去除残留的上清液痕迹，并将沉淀物重悬于 600 微升 HEPES 缓冲液中。将重悬的沉淀物小心地铺于一支预冷的13毫升UltraClear聚丙烯超速离心管底部，并与4毫升惰性的60%密度梯度碘克沙醇溶液轻轻混合。随后依次覆盖1毫升40%、30%、20%和10%的碘克沙醇溶液。最后在管顶加入4毫升6%碘克沙醇溶液，使管内液体充满。将离心管小心地放入玻璃烧杯或支架中称重后，轻柔地将其转移至甩平转子的吊桶内，随后放入转子中，在4°C条件下以141,000 G超速离心16小时。超速离心结束后，小心取出离心管，将1毫升组分收集至已灭菌的微量离心管中。透射电镜分析显示分枝杆菌EVs呈圆形，纳米颗粒追踪分析证实存在不同尺寸的EVs，其直径范围在20至250纳米之间。当mCherry的N端与CFP-29的C端进行翻译融合时，部分富集的Msm mEVs呈现粉红色，表明cf-29具有携带外源目的蛋白的能力。随后利用CFP-29评估EsxA向Msm EVs中的递送。在Msm EVs中检测到少量Mtb的EsxA。CFP-29 EsxA 3X FLAG 在 mEVs 中更稳定，并且积累水平更高。通过富集在不同生理条件下培养的分枝杆菌释放的 EVs，有助于了解其内容物的改变以及功能的修饰，这些变化决定了病原体持续的感染性、致病性及传播能力。

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