Name: 枯草芽孢杆菌孢子计数和标记分析在流式细胞术中的改进 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 了解如何使用流式细胞术和计数微球对枯草芽孢杆菌孢子进行高效计数和荧光标记分析。该方法可准确评估休眠与萌发孢子数量，并测定表面蛋白偶联效率，为微生物学研究提供可靠技术支持。

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本研究部分由巴西高等教育人员进修协调机构（CAPES）-资助代码001、亚马孙州政府通过亚马孙州研究支持基金会（FAPEAM）提供的资源以及国家科学技术发展委员会（CNPq）资助。&#160;作者感谢健康工具技术发展计划PDTIS-FIOCRUZ提供设施使用支持。

有关本实验方案中使用的所有材料、仪器和软件的详细信息，请参见材料表。
1. 流式细胞术设置
<ol>
	<li>连接至计算机的流式细胞仪光学参数校准
	<ol>
		<li>登录流式细胞仪软件。</li>
		<li>在软件工作区中，选择 细胞仪 | 启动，等待数分钟，进入 | 清洗模式 | 液体就绪。 
		​注意：在开始采集样本前，细胞仪启动过程中已去除气泡和堵塞物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质量控制
	<ol>
		<li>使用质量控制试剂调节光电倍增管的电压，并评估其灵敏度。
		<ol>
			<li>在聚苯乙烯管中制备质量控制试剂。</li>
			<li>为确定基线，向已标记的试管中加入 0.5 mL 稀释液（10 mM 过滤 PBS，pH 7）和 3 滴微球，制备悬浮微球。</li>
			<li>轻轻翻转混匀微球管。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在软件工作区中，选择 细胞仪 | CST 以连接至 CST 界面。等待数分钟后，观察显示信息 细胞仪已断开连接。</li>
		<li>将含有质量控制试剂的聚苯乙烯管连接至流式细胞仪探针。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞仪配置验证
	<ol>
		<li>在 系统摘要 窗口中，确认细胞仪配置适用于本实验。</li>
		<li>选择相应的设置微球批次编号，以确认所选设置微球批号与当前 CS&amp;T 研究微球批次一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>性能检测
	<ol>
		<li>选择 检测性能 选项，然后点击 运行。</li>
		<li>性能检测完成后，将显示检测结果。查看 细胞仪性能报告。可点击 完成 结束性能检测，或从细胞仪上取下试管，并在 系统摘要 窗口中查看结果。</li>
		<li>观察形态学参数和荧光灵敏度分析的最终结果，该结果将显示在 | 系统摘要 | 细胞仪性能结果 | 中，状态为：PASSED</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 孢子的制备
<ol>
	<li>孢子形成后，用超纯冰水通过离心洗涤孢子3次，每次在17,949 × g 条件下离心10分钟。</li>
	<li>用10 mL超纯水重悬最后一次离心所得的沉淀。</li>
	<li>将孢子在121 ºC条件下高压灭菌45分钟，以灭活营养细胞。 
	注意：本课题组此前比较不同灭活方法的试验结果表明，步骤2.3中所述条件具有高效灭活效果，在LB琼脂培养基平板分析法中未观察到菌落形成。</li>
</ol>
3. 使用流式细胞术定量高压灭菌的孢子
<ol>
	<li>取 50 µL 经高压灭菌的孢子，加入溴化乙锭（EtBr，10 mg/mL 溶于水）至终浓度为 0.05%（v/v），避光孵育 30 分钟（图 1A）。</li>
	<li>用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤孢子 3 次，每次在 17,949 × g 离心 10 分钟，然后将孢子重悬于 1× PBS 中。</li>
	<li>加入 10 µL 微球，稀释比例遵循制造商推荐方案。</li>
	<li>按照步骤 4 所述方法，使用流式细胞仪分析样品。 
	​注意：必须强调，微球应尽可能均匀地移取，因为若此步骤操作不当，会导致计算结果出现偏差。</li>
</ol>
4. 使用流式细胞术进行分析
<ol>
	<li>登录细胞仪软件。</li>
	<li>在软件工作区中，选择 细胞仪 | 清洗模式 | 保持液体。</li>
	<li>调整工作区以确定流式细胞术中的分析。
	<ol>
		<li>根据阴性对照（未标记孢子）的形态学和荧光特性定义分析门控（图2）。
		<ol>
			<li>基于阴性对照（未标记孢子）的颗粒形态学和荧光特性，确定门控策略。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为确定细胞形态学，选择 点图图形，将 FSC-A 参数设为横轴，SSC-A 设为纵轴 进行分析。</li>
		<li>为确定荧光信号，选择 FL3 点图作为纵轴，FL5 作为横轴，并在四个象限中创建门控。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用一个 12 x 75 mm 带塞聚苯乙烯试管，其中含有未标记样本，以及先前用单色 EtBr、单色 APC 和多色 EtBr+APC 标记的样本。</li>
	<li>轻轻混匀含有阴性对照的试管，并将其连接至流式细胞仪探针。</li>
	<li>点击 采集。</li>
	<li>通过导航至 细胞仪 | 参数 | FSC (375) 和 SSC (275) 设置激光功率。</li>
	<li>将阈值设为 (500) 细胞仪 | 阈值。</li>
	<li>为消除自发荧光，分析仅含孢子且不含染料的样本。</li>
	<li>调整滤光检测器的电压：FL3 (603) 和 FL5 (538)，以便根据对照中选定的荧光区分阴性和阳性群体。细胞仪 | 参数。</li>
	<li>细胞仪 | 补偿 | 将 FL5/FL3 设置偏移 设为 1.0。</li>
	<li>完成形态学和荧光分析后，配置仪器进行数据采集，设置为 30,000 个事件 | 实验 | 实验布局 | 采集 |30,000 个事件…。</li>
	<li>参数调整完毕后，在流式细胞仪中采集已标记样本及含微球样本的数据。</li>
	<li>按照制造商说明书中的公式（1）计算孢子浓度。 
	<img alt="细胞计数中的静态平衡；公式：A=(X/Y)×(N/V)；示意图；科学计算。" src="/files/ftp_upload/65141/65141eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">    (1) 
	注：本研究中，将微球定量法与 Petroff-Hausser 计数室分析法进行了比较。此外，还比较了高压灭菌孢子与未高压灭菌孢子的标记效果。</li>
</ol>
5. 使用流式细胞术估算孢子表面的蛋白质偶联指数
<ol>
	<li>取50 µL孢子（103/µL）在17,949 × g条件下离心10分钟，收集孢子，然后用25 µL的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）（300 mM）重悬。</li>
	<li>室温孵育15分钟。</li>
	<li>向孢子悬液中加入25 µL的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠（NHS）（50 mM），室温孵育30分钟。</li>
	<li>用1× PBS按步骤5.1所述方法离心洗涤孢子3次。</li>
	<li>加入荧光蛋白，15 °C过夜孵育。 
	注意：本研究中使用的荧光蛋白为APC标记的抗人IL-10抗体。该抗体作为研究模型使用，但由于EDC/NHS可促进孢子表面蛋白上的-COOH与-NH2基团之间形成共价连接，因此也可应用其他荧光分子。</li>
	<li>按步骤5.3所述方法洗涤孢子。</li>
	<li>加入10 mg/mL溴化乙锭，按1:50稀释，冰上避光孵育1小时（图1B）。</li>
	<li>按步骤5.3所述方法洗涤孢子。</li>
	<li>重复步骤4。</li>
	<li>为检测荧光，调整点图中X轴的FL3和Y轴的FL5参数。</li>
	<li>使用流式细胞仪分析样品，采用蓝色激光（488 nm）检测FL3（670 LP滤光片），以及红色激光（633 nm）检测FL5（660/20滤光片），具体操作如步骤4所述。 
	注意：相同样品也在显微镜下进行载玻片免疫荧光分析，放大倍数为1,000倍，使用以下滤光片：FITC 480/30 nm（绿色）和TRITC 540/25 nm（红色）。</li>
</ol>

<ol><li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+subtilis+endospore%3A+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).</li>
<li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).</li>
<li>Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115(2014).</li>
<li>Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+immobilization+of+recombinant+organophosphorus+hydrolase+on+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).</li>
<li>Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Bacillus+subtilis+spore+isolation+and+quantifying+spore+harvest+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity.</a> Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).</li>
<li>Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholson%2C+WL+%22Molecular+biological+methods+for+Bacillus%22">Molecular biological methods for Bacillus</a>. , John Wiley and Sons, Chichester, UK. (1990).</li>
<li>Mora-Uribe, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adherence+of+Clostridium+difficile+spores%3A+the+integrity+of+the+outermost+layer+affects+adherence+properties+of+spores+of+the+epidemic+strain+R20291+to+components+of+the+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99(2016).</li>
<li>Paidhungat, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ger+proteins+in+nutrient+and+nonnutrient+triggering+of+spore+germination+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).</li>
<li>Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+TruCount+absolute-count+tubes+for+determining+CD4+and+CD8+cell+numbers+in+human+immunodeficiency+virus-positive+adults.+Site+Investigators+and+The+NIAID+DAIDS+New+Technologies+Evaluation+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).</li>
<li>Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , US20040023319A1 https://patentimages.storage.googleapis.com/fa/3c/dc/9e08d9ecd1b315/US20040023319A1.pdf (2003).</li>
<li>Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+isolation+of+Bacillus+subtilis+spores+using+cell+sorting+and+automated+gating%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating.</a> PLoS ONE. 14 (7), e021989(2019).</li>
<li>Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+spore+enumeration+using+flow+cytometry%3A+A+proof+of+concept+for+probiotic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application.</a> Journal of Microbiological Methods. 190, 106336(2021).</li>
<li>Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+permeabilization+and+activity+recovery+of+Bacillus+spores+in+adverse+conditions+for+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth.</a> Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).</li>
<li>Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+bacterial+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of bacterial spore germination.</a> Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).</li>
<li>Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+adsorption+as+a+nonrecombinant+display+system+for+enzymes+and+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens.</a> Journal of Visualized Experiments. 145, e59102(2019).</li>
<li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killed+Bacillus+subtilis+spores+as+a+mucosal+adjuvant+for+an+H5N1+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine.</a> Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

传统方法（如菌落平板计数）不仅耗时，而且需要活细胞，无法对失活的孢子进行定量5。佩特里夫-豪泽计数室是一种替代方法，但其操作需要经验丰富的显微镜技术人员。流式细胞术已被证明是实现该目的的一种有效替代方法。
Genovese 等人12描述了使用流式细胞术结合两种核酸标记物，并通过精确控制所用仪器的流速（体积/分钟），对芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的活细胞和芽孢进行定量分析，该方法可设定具体的数值参数。并非所有流式细胞仪都能严格控制流速（体积/分钟），部分仪器仅能选择最低、中等或最高档位。在此类情况下，可使用计数微球以确保细胞计数的准确性，并实现不同流式细胞仪之间的结果可重复性。通过本方法，本研究成功计算出样品中每毫升所含芽孢（包括萌发和休眠状态）的数量。
根据Godfrey和Alsharif专利中描述的参数10对孢子群体进行计数和分析。这些作者描述了该方法在分...

Bacillus subtilis 是一种杆状的革兰氏阳性细菌，当环境条件不适合细胞生长时，能够形成休眠孢子1。孢子是极为稳定的细胞形态，包括 B. subtilis&#160;在内的多种细菌孢子被广泛用作人和动物的益生菌2。由于其具有抗逆性和安全性，表面展示异源蛋白的 B. subtilis 孢子已被提出可作为黏膜佐剂、疫苗递送系统以及酶固定化平台3,4。
为了获得 B. subtilis的芽孢，必须使用特殊的培养基对其进行营养剥夺处理。在获得并纯化这些芽孢后，必须对其进行定量，以提高检测效率5,6。因此，需采用某些方法来分析所获得芽孢的浓度。可使用平板计数法或Petroff-Hausser计数室（也称为计数板）进行计数。后者最初用于测定血细胞浓度，但也可用于微生物学领域的芽孢计数7,8。尽管该方法是细胞计数的标准方法，但其读数过程较为繁琐，因为该方法完全依赖人工操作，且准确性取决于操作者的经验。
基于流式细胞术（FC）的分析方法此前已被提出，作为快速、可靠且特异地检测标记的芽孢杆菌属（Bacillus spp.）细胞的有效手段。流式细胞术计数微球的使用已在常规检测（如CD4和CD8 T淋巴细胞的绝对计数）以及涉及可被流式细胞术检测和计数颗粒的研究中，确保了细胞计数的可重复性9。Godjafrey和Alsharif建议使用计数微球对未标记的芽孢进行FC定量分析10。已有研究描述通过&#160;标记芽孢DNA，利用流式细胞术监测芽孢杆菌属（Bacillus spp.）的产孢过程10,11,12,13。另有研究采用FC评估芽孢表面荧光标记蛋白的含量15。
本研究旨在利用商用计数微球，通过流式细胞术进行事件计数时确保可重复性的标准。本文建议在流式细胞术（FC）中使用计数微球进行细胞计数，以优化孢子计数并评估荧光标记抗体在孢子表面的偶联效率。

<table><tbody><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide, NHS）</td><td>Sigma</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>抗人荧光抗体</td><td>BioLegend</td><td>501410</td><td>APC 抗人 IL-10</td></tr><tr><td>抗小鼠荧光抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A32723</td><td>Alexa Fluor Plus 488</td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>&amp;nbsp;BD</td><td></td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 细胞仪设置 &amp;amp; 追踪微球试剂盒（与BD FACSDiva软件v 6.x联用）</td><td>BD</td><td>642412</td><td>质控试剂</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 软件 v. 6.1.3</td><td>BD</td><td>643629</td><td>软件</td></tr><tr><td>Centrifuge MegaFuge 8R</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75007213</td><td></td></tr><tr><td>计数微球</td><td>BD</td><td>340334</td><td>TruCount 管</td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>尼康</td><td></td><td>荧光显微镜</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Ludwig Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>塑料微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯管</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td>5 mL 聚苯乙烯试管，12 × 75 mm，无盖，非无菌</td></tr></tbody></table>

bacillus subtilis 芽孢在流式细胞术中计数与标记分析的改进

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

Bacillus subtilis 的孢子已被提议用于多种生物技术和免疫学应用；然而，目前迫切需要开发能够提高固定在孢子表面抗原的检测灵敏度并实现其定量的方法。基于流式细胞术的分析方法此前已被提出，可作为快速、可靠且特异地检测标记的 B. subtilis 细胞的有效手段。本文中，我们提出利用流式细胞术评估荧光抗体（FA）在孢子表面展示效率，并结合计数微球对孢子数量进行定量。
为此，我们使用溴化乙锭作为DNA标记物，以及藻红蛋白别藻蓝蛋白（APC）标记的抗体作为表面标记物，该抗体与孢子偶联。孢子的定量采用计数微球法进行，因为该技术在细胞检测中具有较高的准确性。使用流式细胞仪分析标记后的孢子，以确认偶联效果。结果表明，DNA标记可提高流式细胞术对萌发孢子检测的定量准确性。观察发现，溴化乙锭无法标记休眠状态的孢子；然而，该技术能够更精确地确定表面偶联荧光蛋白的孢子数量，从而有助于推动以孢子作为生物技术平台在不同应用领域中的相关研究。

在灭菌孢子（AS）样品中，2 × 103 孢子/µl 和 1 × 103 孢子/µl 分别通过计数珠和Petroff-Hausser法进行检测（图2).
<img alt="流式细胞术实验设置：溴化乙锭孵育、孢子定量、荧光蛋白偶联。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65141/65141fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：孢子定量的总体方案。（A）经EtBr标记的孢子和（B）双标记孢子。缩写：EDC = 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；NHS = N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠。 <a href="h...

本方案重点介绍使用流式细胞术和计数微球对溴化乙锭标记的细菌孢子进行定量分析。该方法还可高效分析完整孢子表面蛋白质的共价偶联情况。

Bacillus subtilis 芽孢在流式细胞术中计数与标记分析的改进

枯草芽孢杆菌的孢子已被提议用于多种生物技术和免疫学应用；然而，目前对……的需求日益增加

使用传统方法对枯草芽孢杆菌孢子进行细胞计数可能是一项费力的工作，因为这些方法完全依赖人工操作，且准确性取决于操作人员的经验。本方案可实现对休眠和萌发孢子的计数。此外，该技术还可用于测定其表面荧光蛋白结合的百分比。鉴于本方案中存在设置步骤，该演示展示了实施过程中所需的设备条件、技术理解以及细致的操作。首先登录流式细胞仪软件。在软件工作区中，选择流式细胞仪，然后选择流路启动。然后选择清洁模式。最后，启动SIT冲洗。取50 µL的高压灭菌孢子，加入终体积浓度为0.05%（v/v）的溴化乙锭，避光孵育30分钟。用 PBS 洗涤孢子三次，每次在 17,949 G 离心 10 分钟，然后重悬于 PBS 中。接着，根据生产商推荐的稀释比例加入 10 微升微珠，并使用流式细胞仪分析样品。以阴性对照为参考，根据颗粒的形态学参数和荧光特性确定设门策略。然后轻轻混匀试管。将其连接到流式细胞仪探针上，点击“采集”。为设置激光功率，请进入细胞仪窗口中的参数选项卡，将前向散射调整为375，侧向散射调整为275。然后选择阈值选项卡，并将其设置为500。接下来，分析仅含孢子的无染料样品，以消除自发荧光。在参数选项卡中，调节滤光检测器三的电压至603，滤光检测器五的电压至538，以便通过对照中的荧光信号区分阴性和阳性群体。然后点击补偿（Compensation），将滤光检测器5的3倍设置偏移量设为1。为配置设备进行数据采集，选择实验（Experiment），选择实验布局，并将采集参数设置为30,000个事件。调整参数后，在流式细胞仪中对已标记并含有微球的样品进行数据采集。将50微升孢子在17,949 G下离心10分钟。接着，用25微升1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺重悬孢子，并孵育15分钟。随后，向孢子悬液中加入25微升浓度为50毫摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠。将孢子悬液在室温下孵育30分钟。用PBS洗涤孢子三次，每次洗涤均按前述方法进行离心。向样品中加入荧光蛋白，并在15摄氏度下孵育过夜。加入终浓度为10毫克/毫升的溴化乙锭，按1:50稀释后，将样品置于冰上避光孵育1小时。在洗涤孢子并如前所示设定门控后，调整点图中X轴的滤光检测器三和Y轴的滤光检测器五的参数。计数微球法检测到高压灭菌孢子样品中每微升含有2×10³个孢子。对高压灭菌孢子样本进行溴化乙锭染色后，其平均荧光强度高于未高压灭菌孢子的染色结果，表明遗传物质的染色程度更高。高压灭菌孢子表面与APC标记的抗人白细胞介素10抗体结合时，表现出比未高压灭菌孢子更高的偶联效率。孢子对溴化乙锭的通透性表明，在总孢子群体中可能存在已萌发的孢子。根据流式细胞术分析结果，观察到荧光抗体与休眠孢子的结合比例高于与萌发孢子的结合比例。此外，随着荧光抗体浓度的增加，结合孢子的百分比和平均荧光强度也随之升高。为确保通过流式细胞术获得精确的读数和准确的孢子计数，对当前微珠进行充分均质化处理至关重要。标准化连接在孢子上的抗原浓度，加拿大研究分析了利用孢子作为疫苗抗体的应用。

improvement-bacillus-subtilis-spore-enumeration-label-analysis-flow

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

枯草芽孢杆菌孢子计数和标记分析在流式细胞术中的改进

微生物生物膜通常由不同类型的特化细胞亚群构成。对这些亚群进行单细胞分析需要使用荧光报告系统。本文中，我们描述了一种利用荧光显微镜和流式细胞术对B.

使用荧光显微镜和流式细胞术对 Bacillus subtilis 生物膜进行单细胞分析

来源：Chapman, I. J., 等，利用流式细胞术优化分子探针以测定光合生物（Microcystis aeruginosa）的细胞死亡率。J. Vis. Exp. (2016)本视频演示了区分活细胞与死细胞的方法 Microcystis aeruginosa...

细胞活力分析 Microcystis aeruginosa 使用流式细胞术

本视频展示了一种定量检测人白细胞吞噬FITC标记的致病性真菌孢子的方法。通过复染区分被吞噬的孢子与黏附在细胞表面的孢子，随后进行流式细胞术分析。...

定量流式细胞术检测人吞噬细胞对真菌孢子的吞噬作用

双分子荧光互补的流式细胞术分析为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了一种高通量的定量方法。该方法可用于绘制蛋白质结合位点图谱，以及筛选调控蛋白质-蛋白质相互作用的因素。...

双分子荧光互补的流式细胞术分析：一种高通量定量研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法

单细胞微流控分析 Bacillus subtilis

流式细胞术分析已被证明在研究纯培养物和监测微生物群落动态方面具有重要价值。我们分别提供了从取样到数据分析的三个完整工作流程，适用于透明培养基中的纯培养物和复杂群落，以及具有挑战性的基质环境。...

表征微生物组动态——从纯培养到自然群落的基于流式细胞术的工作流程

Bacillus subtilis 芽孢的萌发受体蛋白在内膜中聚集形成“萌发体”。本文介绍了一种利用超分辨率显微镜和荧光报告蛋白来可视化萌发体的实验方案。该方案还可鉴定出优先被膜染料 FM4-64...

萌发体与内膜的可视化 枯草芽孢杆菌 孢子

荧光标记的抗生素是研究抗菌耐药性多个方面的有力工具。本文介绍了荧光标记抗生素的制备方法及其在研究细菌抗生素耐药性中的应用。这些探针可用于通过分光光度法、流式细胞术和显微镜技术研究细菌耐药机制（例如外排作用）。...

利用荧光抗生素探针可视化细菌耐药性

本研究介绍了一种显微镜方法，可对大肠杆菌（Escherichia...

生物噪声的连续测量 大肠杆菌 使用延时显微镜

本方案描述了一种利用成像流式细胞术定量测定微生物自聚集的方法。...

利用成像流式细胞术研究微生物自聚集

本文介绍了一种定量检测酵母样品在胁迫后存活率的实验方案。该检测方法采用两种荧光染料SYTO...

一种优化的LIVE/DEAD染色联合流式细胞术用于定量酵母细胞应激后的存活率

了解如何使用流式细胞术和计数微球对枯草芽孢杆菌孢子进行高效计数和荧光标记分析。该方法可准确评估休眠与萌发孢子数量，并测定表面蛋白偶联效率，为微生物学研究提供可靠技术支持。

Bacillus subtilis 芽孢在流式细胞术中计数与标记分析的改进

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