枯草芽孢杆菌孢子计数和标记分析在流式细胞术中的改进

使用传统方法对枯草芽孢杆菌孢子进行细胞计数可能是一项艰巨的任务，因为这些方法可以完全手动进行，其准确性取决于操作员的经验。该协议使休眠和萌发孢子的计数成为可能。此外，该技术还可以确定荧光蛋白在其表面的应对百分比。

鉴于该协议中存在的设置步骤，该愿景展示了该执行中的设施和技术理解以及护理细节。首先登录流式细胞仪软件。在软件工作区中，选择"流式细胞仪"，然后选择"流体启动"。

然后选择"清洁模式"。最后，启动 SIT Flush。取 50 微升高压灭菌器孢子，用溴化乙锭以 0.05% 体积的稀释因子孵育 30 分钟，避光保存。

用PBS洗涤孢子三次，以17,949G离心10分钟，然后重新悬浮在PBS中。接下来，按照制造商的稀释建议加入 10 微升珠子，并使用流式细胞仪分析样品。使用阴性对照作为参考，根据颗粒的形态测量和荧光特性定义门控策略。

然后轻轻混合试管。将其连接到流式细胞仪探头，然后单击获取。要设置激光功率，请转到流式细胞仪窗口中的参数选项卡，将前向散射调整为 375，将侧向散射调整为 275。

然后选择阈值选项卡并将其设置为 500。接下来，分析仅含有孢子的无染料样品以消除自发荧光。在参数选项卡中，将滤波器检测器三的电压调整为 603，将滤波器检测器五的电压调整为 538，以使用对照中的荧光区分阴性和阳性群体。

然后单击"补偿"，并将滤波检测器 5 x 3 设置偏移量设置为 1。若要配置设备进行采集，请选择"实验"，选择实验布局，并将采集设置为 30， 000 个事件。调整参数后，在流式细胞仪中获取标记并包含珠子的样品的数据。

将50微升孢子以17,949G离心10分钟。接下来，使用 25 微升 1-乙基-3-3-二甲氨基丙基碳二亚胺重新悬浮孢子并孵育 15 分钟。之后，向孢子悬浮液中加入浓度为 50 毫摩尔的 25 微升 N-羟基磺基琥珀酰亚胺。

将孢子悬浮液在室温下孵育 30 分钟。如前所述，通过离心用PBS洗涤孢子三次。将荧光蛋白加入样品中，并在 15 摄氏度下孵育过夜。

每毫升加入 10 毫克稀释至 1 至 50 的溴化乙锭，然后将样品放在冰上一小时，避光保存。如前所述，洗涤孢子并定义门后，在点图的 Y 轴上更改滤波器 3 的参数，并在点 图的 Y 轴上更改滤波器 5 的参数。计数微珠法在高压灭菌器孢子样品中检测到每微升 10 到第三个孢子的两次。

高压灭菌孢子样品的溴化乙锭染色显示出比非高压灭菌孢子染色更高的平均荧光强度，表明遗传物质的染色更高。与非高压灭菌孢子相比，高压灭菌器孢子表面与APC标记的抗人白细胞介素10抗体偶联显示出更高的偶联效率。对溴化乙锭渗透的孢子的存在表明，在总种群中可能存在萌发的孢子。

根据流式细胞术分析，观察到与萌发孢子相比，荧光抗体与休眠孢子的偶联百分比更高。此外，随着荧光抗体浓度的增加，观察到偶联孢子的百分比和平均荧光强度的增加。重要的是对电流磁珠进行彻底的均质化，以确保通过流式细胞术获得精确读数和准确计数孢子。

标准化附着在孢子上的抗原浓度，加拿大研究分析了孢子作为疫苗抗体的使用。