含纳米片生物活性剂的配制与表征
2023年3月17日
在这里，我们描述了含有纳米盘的生物活性剂的生产和表征。以两性霉素B纳米盘为例，逐步描述该方案。
该协议提供了实用知识，可用于配制纳米级颗粒，即纳米盘，其稳定地掺入广泛的疏水性生物活性分子。这种方法有许多实际应用。
赋予其他不溶性生物活性化合物水溶性的能力允许在药物输送应用中使用纳米盘。所描述的方法很简单。优选在所描述的规模上进行研究，五毫克磷脂，两毫克支架蛋白，以便通过目视检查容易地监测纳米盘的形成。
展示该程序的将是Ryan实验室的本科生研究员Michael Karo和Matthew Swackhammer。要制备磷脂等分试样，请称取五毫克DMPC并将其转移到玻璃试管中。通过加入300微升氯仿和100微升甲醇溶解磷脂，比例为三比一。
通过将玻璃试管置于温和的氮气流下10至15分钟来蒸发有机溶剂，使得沿管底部壁形成一层干燥的磷脂薄膜。为了配制两性霉素B或AmpB-纳米盘，将450微升PBS移液到冻干的磷脂等分试样中，并涡旋30秒以分散脂质。将50微升20毫克每毫升储备AmpB溶液移液到分散的磷脂样品中并涡旋。
向含有分散磷脂和AmpB的玻璃试管中加入500微升每毫升4毫克的ApoE4 NT支架蛋白。浴在24摄氏度下超声处理样品，直到溶液澄清。对于AmpB-纳米盘透析，准备一段透析管，将其彻底浸泡在蒸馏去离子水中10分钟。
使用透析管夹，夹住浸泡透析管的一端，确保没有液体逸出。将一个狭窄的颈部漏斗插入透析管的开口端，并将 AmpB-纳米盘样品转移到透析管中。拆下漏斗，并用另一个透析管夹夹住透析管的末端。
将泡沫透析浮子放在透析管的密封端之一上，然后将组装好的透析管放入装有新鲜制备的一升PBS缓冲液的烧杯中。将磁力搅拌棒放入烧杯底部，并将搅拌控制调低，确保不会产生涡流。让透析在四摄氏度下持续过夜。
通过翻转电源开关打开分光光度计，并通过按PC控制连接到相应的支持计算机。在支持计算机上，打开标有UVProbe 2.61的软件，然后单击连接到分光光度计"连接"在左下角。单击频谱，然后单击方法"在顶部工具栏中。
单击测量选项卡，然后在位于波长范围内的开始"文本框中输入 500，在结束"文本框中输入 300。单击标有"扫描速度"的选项卡旁边的下拉菜单，并将其设置为中。通过将一毫升DMSO转移到两个石英比色皿中来制备样品空白。
将两个比色皿装入分光光度计的相应样品端口。点击 自动空白"并通过单击记录从 300 到 500 纳米的光谱 Start 开始"在左下角。对于 AmpB 标准光谱分析，从前样品口取出比色皿，每毫升 AmpB 储备溶液加入 20 微升 1 毫克。
将比色皿装入样品板，然后单击开始"以记录样品吸光度。记录样品吸光度后，取出比色皿并将液体内容物倒入废物容器中。用去离子水洗三次彻底冲洗比色皿，然后用70%乙醇洗涤三次。
对于破碎的AmpB-纳米盘的光谱分析，通过将每毫升AmpB-Nanodisk原液中的20微升1毫克移液到1毫升DMSO中来制备样品，并在记录光谱之前孵育一分钟。将比色皿装入前部样品端口，然后单击开始"以记录样品吸光度。对于PBS缓冲液空白的光谱分析，通过将一毫升PBS转移到两个石英比色皿中来制备空白。
将比色皿装入样品端口。单击自动空白"并记录从300到500纳米的光谱。对于未中断的AmpB-纳米盘样品的光谱分析，从前样品端口取出比色皿，并将20微升每毫升1毫克AmpB-纳米盘样品添加到PBS缓冲液中。
将比色皿装回样品板。单击开始"并记录样品光谱。当样品外观从浑浊转变为透明时，AmpB-纳米盘配方反应被认为是完成的。
显示了DMSO和PBS中AmpB样品的紫外可见吸收光谱。在DMSO中，在372、392和415纳米处观察到三个不同的吸光度最大值，即指示AmpB的峰。PBS中AmpB-纳米盘的吸光度光谱在较短波长处显示出单个主吸光峰。
相比之下，DMSO中AmpB纳米盘的吸光度光谱与储备AmpB的光谱相似。AmpB-纳米盘的生物活性是通过评估酵母生长抑制测定来进行的。PBS、DMSO和重组高密度脂蛋白等对照样品表明，AmpB以外的纳米盘成分对酵母生长没有明显影响。
阳性对照证实AmpB是酵母生长的有效抑制剂。在AmpB-纳米盘的情况下，观察到浓度依赖性生长抑制活性。并非所有的纳米磁盘制备都是一样的。
有些可能需要更多时间、不同的脂质或不同的支架蛋白。它们只是模糊不清}是纳米盘样品的澄清。该技术导致了用于研究阿霉素诱导的心脏毒性、细胞凋亡、配体相互作用的新型纳米颗粒，并递送了许多水性不溶性生物活性分子，包括叶黄素和姜黄素。
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概述
本协议提供了用于制备纳米级颗粒，特别是可以包含疏水性生物活性分子的纳米圆盘的实用知识。该方法允许原本难溶的化合物在水中溶解，使其在药物递送应用中非常有用。
关键研究组成部分
科学领域
- 纳米技术
- 药物递送
- 生物活性剂
背景
- 纳米圆盘是可以稳定疏水性分子的纳米级颗粒。
- 两性霉素B用作协议的例子。
- 该方法允许可视监测纳米圆盘的形成。
- 实际应用包括增强药物溶解度。
研究目的
- 描述一种制备纳米圆盘的简单方法。
- 使疏水性生物活性化合物能够被包含。
- 通过改善溶解度促进药物递送应用。
使用的方法
- 磷脂和支架蛋白的制备。
- 通过目视检查监测纳米圆盘的形成。
- 使用特定的比例以获得最佳结果。
- 将疏水性生物活性分子包含到纳米圆盘中。
主要结果
- 成功地形成了包含两性霉素B的纳米圆盘。
- 展示了赋予疏水性化合物溶解性的能力。
- 协议允许简单地监测该过程。
- 突出了在药物递送中的潜在应用。
结论
- 该方法对生产生物活性纳米圆盘是有效的。
- 纳米圆盘可以增强原本难溶的药物的溶解度。
- 该协议可以应用于各种疏水性生物活性剂。
常见问题
Executive Industry Relevance
Formulation and characterization of nanodisks enable the solubilization and delivery of hydrophobic bioactive agents, addressing a key challenge in early drug discovery and formulation development. This technology supports predictive confidence in compound behavior and facilitates the advancement of otherwise intractable molecules through the R&D pipeline. Nanodisk platforms offer portfolio-wide value by enabling standardized, scalable approaches to nanoparticle-based delivery systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of hydrophobic compound activity in biologically relevant systems.
- Enables functional validation of bioactive agents through improved solubility and delivery.
- Supports predictive confidence in compound selection and triage for further development.
Screening & Assay Development
- Prepares homogeneous, stable nanodisk formulations for reproducible screening assays.
- Standardizes assay inputs by ensuring consistent bioactive agent incorporation and solubilization.
- Enables quantitative assessment of compound activity in cell-based or biochemical assays.
Translational & Preclinical Research
- Permits in vitro and in vivo evaluation of hydrophobic agents in disease-relevant models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling formulation scalability.
- Reduces risk of formulation-related attrition for promising bioactive compounds.
Pipeline & Workflow Integration
Nanodisk formulation and characterization fit within the continuum from early discovery through lead identification and preclinical evaluation, particularly for hydrophobic agents requiring specialized delivery systems.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and mechanistic studies with otherwise insoluble compounds.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible nanodisk preparations for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative UV/Vis absorbance and biological activity readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Supports in vitro and in vivo studies by ensuring formulation stability and bioactive agent availability.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse hydrophobic bioactive agents across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity for hydrophobic agents.
- Operational Value: Standardizes formulation and characterization workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by de-risking formulation challenges early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of challenging bioactive compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle formulation and analytical characterization.
- Needs access to spectrophotometry, chromatography, and electron microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of formulation and assay protocols.
- May require adaptation of lipid and scaffold protein components for different agents.
- Formulation optimization is necessary for each new bioactive agent to ensure homogeneity and stability.
