Name: 含纳米片生物活性剂的配制与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学习纳米片生物活性剂的配制与表征方法，利用磷脂和支架蛋白制备稳定包载疏水生物活性分子的纳米颗粒。该技术可提高难溶性药物的水溶性，在药物递送领域具有重要应用价值。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院资助（R37 HL-64159）。

1. 支架蛋白组分的转化、表达与纯化
<ol>
	<li>含apoE4-NT质粒的BL21细菌转化
	<ol>
		<li>将一管BL21 (DE3)感受态细胞置于冰上解冻10分钟。</li>
		<li>待所有冰融化后，轻轻混匀，并小心吸取50 µL细胞悬液加入预置在冰上的转化管中。</li>
		<li>加入5 µL含有50 ng的质粒DNA（序列见 补充表 1) 加入细胞混合物中，轻轻弹击管壁4到5次以混匀，切勿涡旋震荡。</li>
		<li>将混合物置于冰上30分钟。</li>
		<li>将混合物在恰好 42 °C 下热激 10 秒。</li>
		<li>置于冰上5分钟。</li>
		<li>将950 µL的S.O.C.培养基用移液器加入室温的离心管中。</li>
		<li>将试管置于37 °C摇床培养箱中，以250 rpm振荡孵育60分钟。</li>
		<li>轻轻敲击并倒置混匀细胞，然后取100 µL细胞溶液均匀涂布于含氨苄青霉素（终浓度0.1 mg/mL）的20 mL LB琼脂选择性平板上。</li>
		<li>37 °C 下孵育过夜，或孵育至可见菌落形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用电子移液器，在室温下将25 mL无菌NZCYM培养基转移至一个无菌的250 mL锥形瓶中，并加入氨苄青霉素，使其终浓度为0.1 mg/mL。</li>
	<li>使用无菌接种环，从含有相应转化菌株的筛选平板上挑取单个菌落，并直接接种至含有25 mL NZCYM培养基和氨苄青霉素的锥形瓶中。</li>
	<li>将装有25 mL NZCYM种子培养液的锥形瓶置于37 °C、转速为250 rpm的摇床培养箱中进行振荡培养。 
	注意：建议将该种子培养物过夜培养，以达到合适的细菌浓度（约1.5–2.0个光密度单位），使用分光光度计在波长600 nm条件下测定。</li>
	<li>将250 mL无菌NZCYM培养基转移至四个1 L带挡板的烧瓶中，并加入氨苄青霉素抗生素至工作浓度为0.1 mg/mL。</li>
	<li>在无菌条件下，将5 mL饱和种子培养物转移至四个250 mL的培养瓶中，置于37 ˚C、振荡速度为250 rpm的摇床培养箱中进行培养。 
	注意：此时将该培养物称为扩增培养物，并使用UV1800分光光度计监测其指数生长期。培养持续进行，直至培养物在600 nm处的光密度（OD600) 达到 0.6–0.8 之间的值。</li>
	<li>当扩增培养达到预期的OD值时600 当 OD 值达到 0.6–0.8 时，向每个含有 250 ml 培养液的培养瓶中加入 59.6 mg 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为 1 mM，以诱导蛋白表达。此时，扩增培养物称为表达培养物。开始诱导表达，持续 5 小时。</li>
	<li>在5小时的表达期结束时，从摇床培养箱中取出四个烧瓶，将125 mL培养液分装至六个250 mL离心管中（共750 mL）。</li>
	<li>平衡每个离心管，确保其总质量相互之间差异在±0.5 mg以内。 
	注意：此步骤对于确保离心机设备的安全运行至关重要。</li>
	<li>通过将电源开关拨到开启位置来准备离心机设备。点击标有 &#34;设定/实际&#34; 并调整参数以 &#34;JA-14&#34;, &#34;9,400 x g&#34;，20.00 分钟，4 °C，使用相应的旋钮设置。</li>
	<li>将六个已平衡的离心管装入合适尺寸的离心机转子中，并放入离心机内，确保&#160;遵循任何特定的安全参数。 
	注意：继续此步骤，直至所有细菌培养物均完成离心并收集上清液。</li>
	<li>使用装有0.45微米滤膜的真空过滤装置或等效设备对分离得到的细菌上清液进行过滤，以去除任何残留的碎片。</li>
	<li>重组apoE4-NT支架蛋白的肝素纯化 
	注意：柱纯化步骤在室温下进行。
	<ol>
		<li>用10倍柱体积（50 mL）的10 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.2）以5 mL/min的流速平衡Hi-trap Heparin柱。</li>
		<li>以2.5 mL/min的流速将含apoE4-NT的培养基加载至层析柱，直至1 L培养基完全上样，弃去穿流液。</li>
		<li>用10个柱体积（50 mL）的10 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.2）洗涤层析柱，并弃去穿流液。</li>
		<li>用三倍柱体积（15 mL）的洗脱缓冲液（10 mM 磷酸钠缓冲液 + 1.5 M NaCl，pH 7.2）对柱子进行洗脱，收集洗脱液，以获得目标 apoE4-NT 蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>apoE4-NT 洗脱液的透析
	<ol>
		<li>将一段透析袋（所用透析袋尺寸为长22 cm、内径12 mm、截留分子量10,000 MWCO）在去离子蒸馏水（ddi水）中充分浸泡10分钟。</li>
		<li>在1 L塑料烧杯或等效容器中配制1 L磷酸盐缓冲液（PBS）（10 mM磷酸钠 + 150 mM NaCl，pH 7.2）。</li>
		<li>使用透析管夹夹住浸泡过的透析管一端，确保夹紧且无液体泄漏。</li>
		<li>将窄颈漏斗插入透析管的开口端，然后将15 mL apoE4-NT洗脱液倒入透析管中。 
		注意：此步骤中必须检查是否存在任何泄漏。</li>
		<li>取下漏斗，用另一个透析管夹夹紧透析管末端。</li>
		<li>将泡沫透析浮子置于透析管的一端封闭端，然后将组装好的透析管放入含有1 L PBS缓冲液的烧杯中。</li>
		<li>将磁力搅拌子放入烧杯底部，并调节搅拌控制装置 &#34;低&#34;，确保不形成涡流。</li>
		<li>透析结束后，将截留液倾入50 mL锥形管中，并于-20 °C保存。 
		注意：建议在 4 °C 下过夜进行此透析步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 含生物活性剂的纳米盘的配制
<ol>
	<li>磷脂分装液的制备
	<ol>
		<li>称取5 mg合适的磷脂（例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱[DMPC]），转移至玻璃试管中。</li>
		<li>将5 mg磷脂溶于300 µL CHCl₃中3 和 100 µL 的 CH3OH，总体积比为3:1（v/v）。</li>
		<li>将玻璃试管置于温和的氮气气流下，蒸发有机溶剂2 用气体吹扫10–15分钟，使磷脂在试管底部内壁形成一层薄薄的干燥膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磷脂等分试样的冻干
	<ol>
		<li>用封口膜覆盖玻璃试管开口，制备用于冻干的磷脂等分试样。</li>
		<li>使用24 G针头在Parafilm上穿刺约10-15次。</li>
		<li>将打孔的分装样品放入合适的冻干容器中，并确保橡胶盖正确密封。</li>
		<li>将冻干容器连接至冻干机顶部的真空歧管，并确保所有其他阀门均已紧密关闭。</li>
		<li>打开冻干机的电源开关，然后按下真空初始化按钮。</li>
		<li>系统达到完全真空后，单击制冷初始化按钮，以开始冻干过程。 
		注意：建议将样品冷冻干燥过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>两性霉素B（amp-B）纳米盘的制备
	<ol>
		<li>将0.45 mL PBS加入冻干的磷脂样品中，涡旋振荡约30秒以分散脂质。 
		注意：最终样品将呈现不透明且浑浊的状态。</li>
		<li>将50 µL的20 mg/mL两性霉素B储备液（20 mg两性霉素B溶于1 mL二甲基亚砜[DMSO]中，置于密闭的棕色容器内，-20 °C保存）用移液器加入分散的磷脂样品中，并涡旋混匀。 
		注意：在选择用于配制疏水性生物活性剂储备液的溶剂时，需主要考虑两个因素：1）生物活性剂的溶解度；2）溶剂与制剂中所用水相缓冲液的互溶性。尽管二甲基亚砜（DMSO）常被使用15,16,17,18,19, 二甲基甲酰胺20,21 或四氢呋喃22 也已成功应用23.</li>
		<li>用移液器将0.5 mL载脂蛋白E4-NT支架蛋白（浓度约为4 mg/mL）加入含有分散磷脂和两性霉素B的玻璃试管中。样品的最终体积应约为1 mL。</li>
		<li>在24 °C下超声处理样品，直至溶液澄清（通常为10–15分钟）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纳米盘离心
	<ol>
		<li>将澄清的ampB-纳米盘溶液转移至一支无菌的1.7 mL微量离心管中。</li>
		<li>将试管放入台式微量离心机转子中，并在正对位置加入平衡管。</li>
		<li>拧紧转子盖并关闭离心机盖。</li>
		<li>将离心机设置为在约11,000 x g条件下离心10分钟 g 使用位于微型离心机前部的相应旋钮。 
		注意：此时可能观察到沉淀，该沉淀由未结合的磷脂和/或两性霉素B（ampB）组成。</li>
		<li>移除上清液，并将其转移至另一支洁净的1.7 mL微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>两性霉素B-纳米盘样品的透析
	<ol>
		<li>将一段透析管（透析管尺寸：长度3 cm，内径16 mm，截留分子量10,000 MWCO）在双蒸水中充分浸泡10分钟。</li>
		<li>在1 L塑料烧杯或同等容器中配制1 L PBS缓冲液（10 mM磷酸钠 + 150 mM NaCl，pH 7.2）。</li>
		<li>使用透析袋夹夹住浸泡过的透析袋一端，确保夹紧且无液体泄漏。</li>
		<li>将窄颈漏斗插入透析管的开口端，然后将两性霉素B-纳米盘样品转移至透析管中。</li>
		<li>取下漏斗，用另一个透析管夹夹紧透析管末端。</li>
		<li>将泡沫透析浮子置于透析管的一端封闭端上，然后将组装好的透析管放入含有1 L PBS缓冲液的烧杯中。</li>
		<li>将磁力搅拌子放入烧杯底部，并调节搅拌控制装置 &#34;低&#34;，确保不产生涡流。在4 °C下静置透析过夜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. ampB-纳米盘样品的光谱分析
<ol>
	<li>分光光度计初始化及自动调零
	<ol>
		<li>通过拨动电源开关打开分光光度计，并按下标有 &#34;PC Control&#34; 的按钮，将其连接至相应的支持计算机。</li>
		<li>在支持计算机上，打开标有 &#34;UVProbe 2.61&#34; 的软件，并通过点击左下角标有 &#34;Connect&#34; 的按钮连接至分光光度计。</li>
		<li>在 UVProbe 软件顶部工具栏中，点击标有 光谱 的按钮。</li>
		<li>在顶部工具栏中点击标有 方法 的按钮。</li>
		<li>点击 测量 选项卡，在 &#34;波长范围 (nm)&#34; 下方的 起始 文本框中输入 &#34;500&#34;，在 &#34;终止&#34; 文本框中输入 &#34;300&#34;。</li>
		<li>点击“扫描速度”选项卡旁边的下拉菜单，并将其设置为“中等”。</li>
		<li>通过将 1 ml DMSO 转移至两个石英比色皿（QS 1.000）中，制备样品空白。</li>
		<li>将两个比色皿分别装入分光光度计的样品槽中，点击 自动调零，然后点击左下角的 开始 按钮，记录 300–500 nm 范围内的光谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>两性霉素B标准品的制备与光谱分析
	<ol>
		<li>通过从前部样品槽中取出比色皿，并加入 20 µL 的 1 mg/mL 两性霉素B储备液（共含 20 µg 两性霉素B），制备 20 µg/mL 的两性霉素B标准品。</li>
		<li>将比色皿重新装入分光光度计的样品槽中，点击 开始 以记录样品吸光度。</li>
		<li>从样品槽中取出比色皿，将其中液体倒入适当标记的废液容器中。</li>
		<li>用去离子水彻底冲洗比色皿三次，随后用 70% 乙醇冲洗三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>破坏后的两性霉素B-纳米盘样品的制备与光谱分析
	<ol>
		<li>通过将 20 µL 的 1 mg/mL 两性霉素B-纳米盘储备液加入 1 mL DMSO 中，制备含 20 µg/mL 两性霉素B的破坏后两性霉素B-纳米盘样品。在记录光谱前，孵育至少 1 分钟。</li>
		<li>将比色皿装入分光光度计的前部样品槽中，点击 开始 以记录样品吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PBS 缓冲液空白的制备与光谱分析
	<ol>
		<li>通过将 1 mL PBS 缓冲液转移至两个石英比色皿（QS 1.000）中，制备 PBS 缓冲液空白。</li>
		<li>将比色皿分别装入分光光度计的样品槽中，点击 自动调零，并记录 300–500 nm 范围内的光谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>未破坏的两性霉素B-纳米盘样品的制备与光谱分析
	<ol>
		<li>通过从前部样品槽中取出比色皿，并向 PBS 缓冲液中加入 20 µL 的 1 mg/mL 两性霉素B-纳米盘样品，制备含 20 µg/mL 两性霉素B的未破坏两性霉素B-纳米盘样品。</li>
		<li>将比色皿重新装入分光光度计的样品槽中，点击 开始，并记录样品光谱。 
		&#8203;注意：所有化学废液应按照公认指南倒入适当标记的废液容器中处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 酵母活力检测分析
注意：进行酵母活力检测是为了评估ampB的生物活性，并确定制剂过程或将其掺入纳米盘的过程是否影响其对酵母生长的抑制活性。
<ol>
	<li>按照先前描述的方法（2.3-2.4.1），配制两种ampB-纳米盘样品（终体积 = 1 mL），分别含有每5 mg DMPC中1 mg ampB和每5 mg DMPC中0.1 mg ampB。 
	注意：为制备每5 mg DMPC含1 mg/mL和0.1 mg/mL ampB的样品，分别向每个样品瓶中加入50 µL和5 µL的20 mg/mL ampB DMSO储备液。</li>
	<li>酵母饱和培养物的制备
	<ol>
		<li>将25 mL无菌酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基转移至无菌50 mL锥形管中。</li>
		<li>使用无菌接种环将单个酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，BY4741）菌落转移至25 mL YPD培养基中。</li>
		<li>在30 °C、振荡频率200 rpm条件下，于摇床培养箱中培养酵母18小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单个生长抑制实验样品的制备
	<ol>
		<li>将5 mL无菌YPD培养基转移至30个无菌13 mL培养管中。</li>
		<li>通过分别向三组培养管中加入20、10和5 µL的1 mg/mL ampB-纳米盘样品，使ampB终浓度分别为20、10和5 µg。</li>
		<li>通过分别向三组培养管中加入20、10和5 µL的0.1 mg/mL ampB-纳米盘样品，使ampB终浓度分别为2、1和0.5 µg。</li>
		<li>通过向四组培养管中分别加入20 µL PBS、DMSO、对照rHDL（不含ampB）或20 µg ampB的DMSO溶液处理四组培养管。 
		注意：每组培养管代表一次独立重复实验。因此，按照本方法可获得总体n值为n = 3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酵母活力检测的启动
	<ol>
		<li>通过向每个样品中接种100 µL（2% 体积比）饱和酵母培养物来启动实验。</li>
		<li>在30 °C、振荡频率200 rpm条件下，使用摇床培养箱培养酵母，最长培养18小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>酵母活力测定
	<ol>
		<li>通过拨动电源开关打开分光光度计，然后点击标有Go To WL的按钮，并将波长设置为600 nm。</li>
		<li>将1 mL无菌YPD培养基转移至两个塑料比色皿中，分别装入分光光度计对应的样品槽，并点击Autoblank。</li>
		<li>将每种样品各1 mL转移至塑料比色皿中，确保每次更换新的比色皿，并将比色皿装入分光光度计前端的样品槽中。</li>
		<li>测量并记录各样品在600 nm处的光密度值，随后将使用过的比色皿弃置于正确标识的生物危害废物容器中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).</li>
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<li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Investigational+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li>
<li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li>
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<li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li>
<li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li>
<li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li>
<li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks%3A+Implications+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722(2021).</li>
<li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617(2020).</li>
<li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984(2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

含有生物活性成分的纳米盘制剂提供&#160;了一种便捷的方法，用于增溶原本不溶的疏水性化合物。由于成品生物活性成分纳米盘在水相介质中完全可溶，因此为多种疏水性分子提供了有效的递送方式（表1）。这些分子包括小分子、天然和合成药物、植物营养素、激素等。该制剂策略通常遵循标准操作流程，且必须考虑生物活性成分在有机溶剂中的溶解特性。除了选择合适的有机溶剂以溶解生物活性成分外，还需满足两个额外参数：制备浓度约为20 mg/mL的储备液，并确保该溶剂与水溶液具有良好的混溶性。这是必要的，因为它能够在不引入过量有机溶剂的前提下，向制剂混合物中加入足量的生物活性成分。混溶性至关重要，因为若发生相分离，将阻碍生物活性成分掺入最终的纳米盘产品中。
在选定的缓冲液中，于双层形成性磷脂分散后立即引入生物活性试剂，可使这些组分在添加支架蛋白之前相互作用。在添加支架蛋白之前以及刚添加之后，样品呈现为不透明的悬浮液。然而，当三种组分（磷脂、生物活性试剂和支架蛋白，按5/1/2的质量比）均加入，并在适当温度下进行足够时间的水浴超声处理后，样品外观会从浑浊变为澄清。如果生物活性试剂...

新生盘状高密度脂蛋白（HDL）是人体循环系统中更为丰富的球形HDL的天然前体。这些新生颗粒也被称为前β-HDL，具有独特而显著的结构特性1。事实上，新生HDL并非球形颗粒，而是呈盘状。对天然及重组盘状HDL的大量结构表征研究表明，它们由一层磷脂双分子层构成，其边缘由两亲性可交换载脂蛋白（apo）如apoA-I环绕。在人体脂蛋白代谢过程中，循环中的新生HDL从外周细胞摄取脂质，并在关键蛋白介质（包括ATP结合盒转运蛋白A1和卵磷脂：胆固醇酰基转移酶）的作用下成熟为球形HDL2。该过程是逆向胆固醇转运通路的关键组成部分，被认为对预防心脏病具有保护作用。基于这些认识以及重组盘状HDL的技术能力，研究人员已将这类颗粒用作治疗动脉粥样硬化的干预手段3。本质上，将重组HDL（rHDL）输注给患者可促进胆固醇从斑块沉积中流出，并将其运回肝脏转化为胆汁酸后排出体外。目前已有数家生物技术/制药公司正在推进这一治疗策略4。
与此同时，在实验室中制备这些颗粒的能力已引发大量研究活动，推动了新应用和新技术的发展。其中一个重要的应用是利用重组高密度脂蛋白（rHDL）颗粒作为微型膜结构，为跨膜蛋白提供类似天然的环境5迄今为止，已有数百种蛋白质被成功整合到盘状重组高密度脂蛋白（rHDL）中，研究表明这些蛋白质能够保持其天然构象和生物学活性，发挥受体、酶、转运蛋白等功能。这些颗粒被称为 &#34;纳米盘&#34;，也已被证明适用于结构表征，通常能达到高分辨率6这种方法在跨膜蛋白研究中被认为优于使用去垢剂胶束或脂质体的研究，因此正迅速发展。需要认识到，已有两种不同的方法被报道可用于形成重组高密度脂蛋白（rHDL）。 &#34;胆酸透析&#34; 方法13 因其适用于将跨膜蛋白整合到rHDL双分子层中而广受欢迎5该方法的核心在于将形成双分子层的磷脂、支架蛋白以及目标跨膜蛋白与含有胆酸钠（或脱氧胆酸钠；胶束分子量 [MW] 为 4,200 Da）的缓冲液混合。该去垢剂能有效溶解反应中的各组分，使样品可透析至不含去垢剂的缓冲液中。在透析过程中，随着去垢剂从样品中被去除，重组高密度脂蛋白（rHDL）会自发形成。当此方法用于包埋目标跨膜蛋白时，所获得的颗粒被称为纳米盘（nanodiscs）5. 尝试使用该方法来包载小分子疏水性生物活性物质（MW &#60;1,000 Da）则大多不成功。与跨膜蛋白不同，小分子生物活性物质会随着去垢剂一同从透析袋中逸出，从而显著降低其在重组高密度脂蛋白（rHDLs）中的包封效率。该问题通过在配方混合物中省去除去垢剂得以解决。14。相反，各组分被依次加入水相缓冲液中，首先加入形成双层结构的脂质，从而形成含有生物活性物质的稳定重组高密度脂蛋白，称为纳米盘（nanodisk）。其他研究者已利用重组高密度脂蛋白（rHDL）来包载和运输 体内 成像剂7最近，由载脂蛋白支架和阴离子甘油磷脂心磷脂组成的专业化重组高密度脂蛋白（rHDL）已被用于配体结合研究。这些颗粒为研究心磷脂与多种水溶性配体（包括钙离子、细胞色素c和抗癌药物阿霉素）之间的相互作用提供了平台。8.
本研究的重点在于制备能够稳定掺入疏水性生物活性物质（即纳米盘）的重组高密度脂蛋白（rHDL）。这些物质有效整合至盘状rHDL颗粒的脂质环境的能力，使其具备水溶性。因此，纳米盘具有以下潜力 在体内 治疗应用。在制备纳米盘时，需要特定的孵育/反应条件，才能成功地将特定疏水性生物活性物质掺入最终颗粒中；本报告旨在提供详细的实用信息，可作为针对特定应用开发新型纳米盘颗粒的基础模板。因此，在本论文中，“nanodisc”与“nanodisk”这两个术语不可互换。其中，nanodisc指的是一种重组高密度脂蛋白（rHDL），其脂质双分子层中嵌入有跨膜蛋白5，纳米盘是指一种重组高密度脂蛋白（rHDL），其设计用于掺入低分子量（&#60; 1,000 Da）的疏水性生物活性物质，如两性霉素B14.
获取合适支架蛋白的方法有多种。可从生产商处购买支架蛋白［例如载脂蛋白A-I（SRP4693）或载脂蛋白E4（A3234）］，但成本可能成为限制因素。更优选的方法是在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达重组支架蛋白。已有文献报道人载脂蛋白A-I9、载脂蛋白E410以及昆虫血淋巴蛋白载脂蛋白III（apolipophorin-III）11的表达方案。在本文所述实验中，使用了重组人载脂蛋白E4的N端（NT）结构域（氨基酸1-183）。编码人载脂蛋白E4-NT的核苷酸序列经合成后，插入至pET-22b(+)表达载体中，紧邻载体编码的pelB信号肽序列。该构建体可表达pelB信号肽与载脂蛋白E4-NT的融合蛋白。蛋白合成后，细菌pelB信号肽将新合成的蛋白导向周质空间，由信号肽酶切除pelB序列。最终获得的载脂蛋白E4-NT蛋白不含任何序列标签或尾部，可从细菌中释放并积累于培养基中11,12，从而简化后续纯化步骤。

<table><tbody><tr><td>两性霉素B</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>11636</td><td>ND制剂 &amp;和标准制备</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP17925</td><td>转化 &amp;扩增与扩增</td></tr><tr><td>ApoE4-NT 质粒</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>转化</td></tr><tr><td>带挡板锥形瓶</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>N/A</td><td>扩增 &amp;与表达</td></tr><tr><td>BL21 感受态大肠杆菌</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>转化</td></tr><tr><td>离心管</td><td>Nalgene</td><td>3140-0250</td><td>表达</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>G607-4</td><td>ND制剂</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td>标准制备</td></tr><tr><td>二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱</td><td>Avanti Lipids</td><td>850345P</td><td>ND配方</td></tr><tr><td>锥形瓶</td><td>Bellco Biotechnology</td><td>N/A</td><td>扩增 &amp;和表达</td></tr><tr><td>Falcon 管</td><td>Sarstedt Ag &amp;amp; 公司</td><td>D51588</td><td>酵母活力检测</td></tr><tr><td>玻璃硼硅酸盐管</td><td>VWR</td><td>47729-570</td><td>ND制剂</td></tr><tr><td>GraphPad（软件）</td><td>Dotmatics</td><td>N/A</td><td>酵母活力检测</td></tr><tr><td>加热超声波清洗浴</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>ND配方</td></tr><tr><td>加热与氮气模块</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>TS-18822</td><td>ND 配方</td></tr><tr><td>HiTrap Heparin HP（5 mL）</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0407-03</td><td>纯化</td></tr><tr><td>异丙基 &amp;beta;D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755</td><td>表达</td></tr><tr><td>J-25 离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>J325-IM-2</td><td>表达</td></tr><tr><td>JA-14 转子</td><td>贝克曼库尔特</td><td>339247</td><td>表达</td></tr><tr><td>冻干机</td><td>Labconco</td><td>7755030</td><td>ND制剂</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>ND制剂</td></tr><tr><td>氮气</td><td>普莱克斯</td><td>UN1066</td><td>ND配方</td></tr><tr><td>NZCYM 培养基</td><td>RPI 研究产品</td><td>N7200-1000.0</td><td>扩增 &amp;与表达</td></tr><tr><td>Pet-22B 载体</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>转化</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875718</td><td>转化 &amp;扩增与扩增</td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Fisher Brand</td><td>14385 928A</td><td>光谱分析</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>M1344-0004</td><td>转化、扩增 &amp;与表达</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 浮标</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>66430</td><td>纯化</td></tr><tr><td>SnakeSkin 透析管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>68100</td><td>纯化</td></tr><tr><td>SnakeSkin透析管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88243</td><td>纯化</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271</td><td>纯化</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>纯化</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-500</td><td>纯化</td></tr><tr><td>Spectra/POR 加权封口器</td><td>Spectrum Medical Industries</td><td>132736</td><td>纯化</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>岛津 UV-1800</td><td>220-92961-01</td><td>光谱分析</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>366816</td><td>ND 配方</td></tr><tr><td>UVProbe 2.61（软件）</td><td>岛津</td><td>N/A</td><td>光谱分析</td></tr><tr><td>真空过滤器</td><td>默克密理博</td><td>9004-70-0</td><td>表达 &amp;纯化</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>GAST 制造公司</td><td>DOA-P704-AA</td><td>表达 &amp;纯化</td></tr><tr><td>涡旋混合</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td>ND 配方</td></tr><tr><td>酵母</td><td>N/A</td><td>BY4741</td><td>酵母活力检测</td></tr><tr><td>酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖</td><td>BD</td><td>242820</td><td>酵母活力检测</td></tr></tbody></table>

含生物活性剂纳米盘的制备与表征

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

纳米盘（nanodisk）指的是一种由双层形成脂质、支架蛋白和整合的生物活性物质组成的离散型纳米颗粒。纳米盘的结构为盘状脂质双层，其周边由支架蛋白环绕，该蛋白通常属于可交换载脂蛋白家族。许多疏水性生物活性物质通过整合入颗粒脂质双层的疏水微环境中，已在纳米盘中实现高效增溶，从而产生直径在10–20 nm范围内、高度均一的颗粒群体。纳米盘的制备需要精确控制各组分的比例，按适当顺序依次加入各组分，随后对混合物进行水浴超声处理。两亲性支架蛋白会自发结合并重组分散的脂质双层/生物活性物质混合物，形成离散且均一的纳米盘&#160;颗粒。在此过程中，反应混合物的外观从不透明、浑浊逐渐转变为澄清的溶液，在优化充分的情况下，经离心后不会产生任何沉淀。表征研究包括测定生物活性物质的增溶效率、电子显微镜分析、凝胶过滤色谱、紫外-可见（UV/Vis）吸收光谱和/或荧光光谱分析。随后通常还需利用培养细胞或小鼠进行生物学活性检测。对于携带抗生素（如大环内酯类多烯抗生素两性霉素B）的纳米盘，可测定其在不同浓度或时间条件下抑制酵母或真菌生长的能力。由于纳米盘制备简便、组分灵活、颗粒尺寸处于纳米级、本身具有稳定性且可在水相中溶解，因此适用于多种体外（in vitro）和体内（in vivo）应用。本文中，我们描述了一种通用的方法，用于制备和表征以两性霉素&#160;B作为疏水性生物活性物质的纳米盘。

生物活性物质纳米盘制剂制备过程 
在所述的两性霉素B（ampB）-纳米盘制剂制备过程中，当样品外观由浑浊变为澄清时，即认为反应已完成（图1）。该变化表明纳米盘已形成，且生物活性物质已被溶解。许多生物活性物质在可见光波长范围内具有吸光性（例如ampB、姜黄素、叶黄素、辅酶Q10），在此类情况下，样品会呈现该生物活性物质的颜色。一旦样品澄清完成（通常需5–20分钟水浴超声处理），将样品转移至1.7 ml微量离心管中，在11,000 × g 条件下离心5分钟，以沉淀不溶性物质。若无可见沉淀物，可作为有力证据表明生物活性物质已成功包载于纳米盘中；反之，若出现沉淀物，则表明生物活性物质部分或完全未被包载。如有必要或有助于分析，可平行制备仅含双层形成脂质和支架蛋白的对照制剂，并通过肉眼观察或使用分光光度计进行定量比较，评估两种样品的澄清程度。无论何种情况，在含有生物活性物质的纳米盘样品完成离心后，均需将其对磷酸盐缓冲液（PBS）或其他适当缓冲液进行透析，以去除残留溶剂。
<p class="jove_c...

本文介绍了含有纳米盘的生物活性物质的制备与表征方法。以两性霉素B纳米盘为例，逐步描述了该实验方案。

纳米盘（nanodisk）是指一类由形成双分子层的脂质、支架蛋白和整合的生物活性物质组成的离散型纳米颗粒。

本方案提供了制备纳米级颗粒（即纳米盘）的实用知识，可稳定地包载多种疏水性生物活性分子。该方法具有广泛的实用价值。赋予原本不溶于水的生物活性化合物以水溶性的能力，使得纳米盘可用于药物递送应用。所述方法简便易行。建议在所述规模下进行研究，即五毫克磷脂和两毫克支架蛋白，以便通过肉眼观察直接监测纳米盘的形成。演示该实验步骤的是瑞安实验室的本科学生研究员 Michael Karo 和 Matthew Swackhammer。准备磷脂分装液时，称取 5 毫克 DMPC 并转移至玻璃试管中。加入 300 微升氯仿和 100 微升甲醇（体积比为 3:1），溶解磷脂。将玻璃试管置于温和的氮气气流下10至15分钟，蒸发有机溶剂，使磷脂在试管底部内壁形成一层薄薄的干燥磷脂膜。为制备两性霉素B或AmpB-纳米盘，用移液器向冻干的磷脂样品中加入450微升磷酸盐缓冲液（PBS），涡旋振荡30秒以分散脂质。再向分散的磷脂样品中加入50微升浓度为20毫克/毫升的两性霉素B储备液，随后涡旋振荡。向含有分散的磷脂和两性霉素B的玻璃试管中加入500微升浓度为4毫克/毫升的ApoE4 NT支架蛋白。在24摄氏度下进行水浴超声处理，直至溶液澄清。对于两性霉素B-纳米盘透析，取一段透析管，用去离子蒸馏水充分浸泡10分钟以进行准备。使用透析管夹将浸泡过的透析管一端夹紧，确保无液体泄漏。将细颈漏斗插入透析管的开口端，将两性霉素B-纳米盘（AmpB-Nanodisk）样品转移至透析管内。取出漏斗，用另一个透析管夹将透析管的开口端夹紧。将一个泡沫透析浮子套在透析管的一端封闭端上，将组装好的透析管放入含有新配制的一升 PBS 缓冲液的烧杯中。将磁力搅拌子放入烧杯底部，并将搅拌速度调至低速，避免产生涡流。在 4 °C 下静置透析过夜。通过拨动电源开关打开分光光度计，并通过按下“PC控制”按钮连接至相应的支持计算机。在支持计算机上，打开标记为 UVProbe 2.61 的软件，然后单击左下角的“连接”按钮以连接至分光光度计。单击“光谱”选项，然后在顶部工具栏中单击“方法”。单击“测量”选项卡，在波长范围下方的“起始”文本框中输入 500，在“结束”文本框中输入 300。单击标有“扫描速度”选项卡旁边的下拉菜单，将其设置为“中等”。通过将一毫升 DMSO 转移至两支石英比色皿中，制备样品空白对照。将两个比色皿分别放入分光光度计对应的样品槽中。点击“自动调零”，然后单击左下角的“开始”按钮，记录300至500纳米范围的光谱。进行两性霉素B标准光谱分析时，从前面的样品槽中取出比色皿，加入20微升浓度为1毫克/毫升的两性霉素B储备液。将比色皿重新放入样品架中，点击“开始”以记录样品的吸光度。记录完样品吸光度后，取出比色皿并将其中液体倒入废液容器中。用去离子水彻底冲洗比色皿，重复冲洗三次，随后用70%乙醇再冲洗三次。对于破坏后的AmpB-纳米盘进行光谱分析，通过移液将20微升浓度为1毫克/毫升的AmpB-纳米盘储备液加入1毫升DMSO中制备样品，并在记录光谱前孵育1分钟。将比色皿放入前方样品槽中，点击“开始”以记录样品吸光度。对于PBS缓冲液空白样的光谱分析，取1毫升PBS加入两个石英比色皿中制备空白样。将比色皿装入样品孔中。点击“自动调零”，记录300至500纳米范围内的光谱。对于未破碎的AmpB-Nanodisk样品的光谱分析，从前面的样品孔中取出比色皿，并向PBS缓冲液中加入20微升浓度为1毫克/毫升的AmpB-Nanodisk样品。将比色皿重新放入样品架中。点击“开始”并记录样品光谱。当样品外观由浑浊变为澄清时，视为两性霉素B-纳米盘制剂反应完成。展示了两性霉素B（AmpB）样品在DMSO和PBS中的紫外-可见吸收光谱。在DMSO中，观察到372、392和415纳米处三个明显的吸收峰，这些峰是AmpB的特征峰。AmpB-纳米盘在PBS中的吸收光谱则显示在较短波长处有一个单一的主要吸收峰。相比之下，DMSO 中 AmpB-纳米盘的吸收光谱与储存液 AmpB 的光谱相似。通过评估酵母生长抑制实验来检测 AmpB-纳米盘的生物活性。PBS、DMSO 和重组高密度脂蛋白等对照样品表明，除 AmpB 外，纳米盘的其他组分对酵母生长无明显影响。阳性对照证实两性霉素B（AmpB）可有效抑制酵母生长。对于AmpB-纳米盘，观察到浓度依赖性的生长抑制活性。并非所有纳米盘制备物都具有相同的活性。某些情况可能需要更长的时间、不同的脂质或不同的支架蛋白。唯一不明确的是纳米盘样品的澄清步骤。该技术已推动了新型纳米颗粒的开发，用于研究阿霉素诱导的心脏毒性、细胞凋亡、配体相互作用，并成功递送了多种水难溶性生物活性分子，包括叶黄素和姜黄素。

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Research

科研

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Biochemistry

生物化学

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含生物活性剂纳米盘的制备与表征

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