Name: 评估纳米乳剂佐剂疫苗对耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌 （MRSA）感染的免疫反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 了解纳米乳剂佐剂疫苗的制备与免疫评估方法，用于MRSA感染研究。该方案采用低能乳化法制备疫苗，通过ELISA检测抗体滴度，评估体内保护效果，为疫苗开发提供可靠框架。

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本研究得到中国国家重点研发计划项目 No. 2021YFC2302603、国家自然科学基金项目 No. 32070924 和 32000651，以及重庆市自然科学基金项目计划 No. 2019jcyjA-msxmx0159 的资助。

动物实验根据实验动物使用与护理手册进行，并经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。本研究使用6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。实验动物购自商业来源（见材料表）。
1. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌HI抗原蛋白的制备
<ol>
	<li>获取 IsdB 和 Hla 来自商业来源的克隆（参见 材料表），进行聚合酶链式反应（PCR）扩增以扩增 IsdB 和 Hla 基因，并将其产物连接至PGEX-6P-2质粒（商业获取；参见 材料表）。使用Xl/blue菌株的载体进行筛选 大肠杆菌10.</li>
	<li>将阳性克隆转化进入 E. coli BL21 感受态细胞（参见 材料表）并用鲨鱼培养物进行扩增10.</li>
	<li>使用异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside）诱导表达抗原，并采用多模式色谱（MMC）纯化试剂盒进行分离11（参见 材料表).</li>
	<li>表征抗原蛋白并使用全自动纯化仪进行纯化11.
	<ol>
		<li>使用市售的亲和层析树脂从澄清裂解液中亲和纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签蛋白（参见 材料表).</li>
		<li>通过MMC纯化重组蛋白11.</li>
		<li>采用Triton X-114相分离法去除内毒素11简而言之，将1% Triton X-114与重组蛋白洗脱液在0 °C下混合5分钟，以确保形成均一溶液，随后在37 °C孵育5分钟，使两相形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用细菌内毒素检测方法11 使用 Turtle 试剂盒（参见 材料表）检测内毒素浓度。该蛋白抗原的内毒素含量为 0.06 EU/µg，低于国际标准（1.5 EU/µg）。10.
	<ol>
		<li>进行干扰试验以消除测试产品对内毒素检测可能产生的影响11. 
		注：根据《中华人民共和国药典》2020年版附录12，内毒素含量应低于5 EU/剂量。根据计算，鲎试剂的灵敏度（λ0.25 EU/mL）和最大有效稀释倍数为33.312 基于 MVD = cL/λ，其中 L 为供试品的细菌内毒素限值，c 为供试品溶液的浓度，当 L 以 EU/m 表示时，c 等于 1.0 mg/mL。λ 为凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将抗原（通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳[SDS-PAGE]测定为48 kDa）以1.5 mg/mL浓度在无内毒素的无菌水或磷酸盐缓冲液（PBS）（二氯化钠法）中重悬11. 
	&#8203;注意：蛋白峰时间为13.843 min，纯度为99.4%（高效液相色谱法），蛋白保存于-70 °C10从提取的基因组DNA S. aureus 菌株 MRSA252（参见 材料表) 用作PCR模板。该 IsdB 使用上游引物 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG 扩增基因 
	C-39 和反向引物 59-TTTTCCTTTTGCGG 
	CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTTC-39。该 Hla 使用上游引物 PHLAF（GCGGATCCGATTCTGATATTAATATTAAAACC）和下游引物 PHLAR（TAAGCGGCCGCTTAT）对目的基因进行扩增 
	CAATTTGTCATTTCTTC</li>
</ol>
2. 纳米乳液疫苗的制备
<ol>
	<li>按照1:6:3（w/w）的质量比，依次向HI抗原蛋白溶液（10 mg/mL）中加入三种辅料（肉豆蔻酸异丙酯、聚氧乙烯蓖麻油和丙二醇；参见材料表），充分搅拌。然后，逐步加入灭菌纯水至终体积为10 mL，并在500 rpm、25 °C条件下搅拌约20分钟。 
	注：本方案制备的纳米乳剂体积为10 mL，三种辅料的质量分别为0.34 g、2 g和1 g。此处的蛋白溶液为工作液，其浓度为最终溶液浓度的10倍。</li>
	<li>采用低能乳化法13制备纳米乳剂佐剂疫苗（蛋白浓度为1 mg/mL），得到澄清透明的液体溶液。 
	&#8203;注：空白纳米乳剂（BNE）的制备方法类似，仅以HI替代水。常规乳化方法通常需将内相和外相加热至约80 °C进行乳化，随后逐步搅拌冷却。该过程消耗大量能量，最终获得乳剂。</li>
</ol>
3. 纳米乳佐剂疫苗的物理表征与稳定性
<ol>
	<li>粒径、Zeta 电位和聚合物分散指数（PDI）表征。
	<ol>
		<li>取 100 µL 纳米乳佐剂疫苗，用注射用水稀释 50 倍。加入 2 mL 样品用于检测。</li>
		<li>使用 Nano Zetasizer（ZS；参见材料表）在 25 °C 下测定粒径、Zeta 电位和 PDI。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电子显微镜（TEM）
	<ol>
		<li>取 10 µL 纳米乳疫苗，用纯水稀释 50 倍，滴加至碳支持膜覆盖的 100 目铜网上，室温下用 1% 磷钨酸（参见材料表）染色 5 分钟。</li>
		<li>用滤纸吸除多余的磷钨酸溶液。</li>
		<li>在透射电子显微镜下观察形态（参见材料表）。检查终产物在电镜视野中是否接近稳定且呈圆形，以及是否具有良好的分散性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描电子显微镜（SEM）
	<ol>
		<li>取 10 µL 纳米乳佐剂疫苗，用纯水稀释 50 倍，取 10 µL 预稀释样品滴于硅片上，置于 37 °C 恒温培养箱中孵育 24 小时。</li>
		<li>对制备好的硅片进行铂喷镀 40 秒，冷却至室温。</li>
		<li>在高分辨率扫描电子显微镜下观察所制备样品的形貌特征（参见材料表）。确定样品在电镜视野中是否接近稳定、呈球形且分散良好。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>形态稳定性
	<ol>
		<li>将 1 mL 纳米乳疫苗样品置于微量离心管中，在室温（25 °C）下以 13,000 × g 离心 30 分钟，评估新鲜样品的稳定性。</li>
		<li>观察这些新鲜样品的外观，随后进行六次温度循环的热力学稳定性测试（一个循环：4 °C 保存 48 小时，25 °C 保存 48 小时，37 °C 保存 48 小时）。</li>
		<li>离心后，让样品静置 15 分钟，观察是否存在丁达尔效应（样品在光照下是否清澈透明），以及是否发生破乳现象（破乳后出现明显分层）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SDS-PAGE 和 Western blot
	<ol>
		<li>振荡样品，将 0.6 mL 无水乙醇与 0.3 mL 疫苗混合，室温（25 °C）下以 13,000 × g 离心 30 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至洁净离心管中，用 0.3 mL 水溶解沉淀。经无水乙醇和蒸馏水处理后，分别获得上清液和沉淀溶液（包括空白纳米乳和疫苗），均进行 50 倍稀释。</li>
		<li>混合 2.5 mL 分离胶 A 和 2.5 mL 分离胶 B（参见材料表），加入 50 µL 10% 过硫酸铵，迅速用移液器将溶液注入玻璃板中。混合 1 mL 浓缩胶 A 和 1 mL 浓缩胶 B，加入 20 µL 10% 过硫酸铵至玻璃板中，插入合适大小的梳子，静置至凝固。</li>
		<li>向步骤 3.5.2 获得的稀释样品中加入共 5 µL 的 5× 蛋白上样缓冲液，沸水浴加热 5 分钟。</li>
		<li>将 10 µL 加热后的蛋白样品加入对应加样孔，5 µL 蛋白 Marker 加入 Marker 孔。</li>
		<li>连接电极，开启电泳仪（参见材料表），调节电压至 300 V。当电泳前沿距离 PAGE 胶底部 1 cm 时关闭电源。</li>
		<li>取出凝胶，用 ddH2O 冲洗。加入考马斯亮蓝 G-250 染色液（参见材料表）染色 10 分钟。倒出染色液，用 ddH2O 冲洗凝胶两次。</li>
		<li>加入市售脱色液，微波加热凝胶 1 分钟。摇床震荡 10 分钟，反复更换脱色液直至背景清晰。然后进行凝胶成像（参见材料表）。 
		NOTE: Western blot 的前期处理如步骤 3.5.1–3.5.6 所述。</li>
		<li>用转膜电泳缓冲液浸湿三块滤纸。将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜在甲醇中浸泡 30 秒，使用半干式转膜仪进行转膜（两层滤纸、PVDF 膜、电泳胶、一层滤纸）。以 23 V 电压转膜 23 分钟。</li>
		<li>转膜后取出 PVDF 膜，用含吐温 20 的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBST）洗涤一次。</li>
		<li>将 PVDF 膜置于封闭液（5% 脱脂奶粉溶液）中，4 °C 过夜封闭。</li>
		<li>取出 PVDF 膜，用 TBST 洗涤三次，每次 10 分钟。</li>
		<li>与一抗（来自免疫后血清阳性的小鼠）孵育。将待测一抗11（参见材料表）用 TBST 稀释 500 倍（或 100 倍）。将封闭后的 PVDF 膜放入一抗溶液中，37 °C 孵育 1 小时。</li>
		<li>取出 PVDF 膜，用 TBST 洗涤三次，每次 10 分钟。</li>
		<li>与二抗孵育（参见材料表）。将碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗小鼠二抗用 TBST 稀释 5,000 倍。将 PVDF 膜放入二抗溶液中，37 °C 孵育 40 分钟。</li>
		<li>取出 PVDF 膜，用 TBST 洗涤四次，每次 10 分钟。</li>
		<li>将 PVDF 膜浸入碱性磷酸酶底物氮蓝四唑（NBT）和 BCIP（5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸对甲苯胺盐）的混合液中（用量以刚好浸没膜为宜）进行显色（参见材料表）。阳性结果呈紫色。 
		&#8203;NOTE: 结果必须显示清晰的紫色条带，且样品条带与抗原的分子量应在标记位置一致。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肌肉注射后对该疫苗抗体免疫反应的评估
注意：小鼠通过肌肉注射纳米乳液疫苗进行免疫，方法参照已发表的文献11。以注射PBS的小鼠作为阴性对照。完成三次免疫后1周，采集小鼠血清11。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量检测血清中IgG及其亚类IgG1、IgG2a和IgG2b的水平。
<ol>
	<li>抗原包被：用包被液将HI蛋白抗原稀释至10 µg/mL，每孔加入100 µL至ELISA板中，4 °C孵育过夜。 
	注意：包被液的配制方法是将1.6 g无水碳酸钠和2.9 g碳酸氢钠溶解于1 L去离子水中。</li>
	<li>封板：洗涤平板（3次循环，每次循环300 µL）。每孔加入300 µL封闭液，37 °C封闭2 h。 
	注意：封闭液的配制是在 PBS 中加入 Tween-20 和牛血清白蛋白（BSA）。PBST 溶液中 BSA 的含量为 1%。</li>
	<li>血清稀释：用PBST将小鼠血清样本稀释100倍（取3 µL血清加入297 µL PBST中，涡旋混匀），每份血清样本使用100 µL。将阳性血清和阴性对照血清用PBST稀释100倍，方法为加入4 µL血清&#160;加入396 µL PBST，然后涡旋混匀。</li>
	<li>双倍稀释：将200 µL上述稀释的实验血清加入包被的ELISA板的第一行，除第一列和第12列外，其余各孔均加入100 µL PBSTth 逐行操作。从第一行开始进行1:2的系列稀释：将移液器调整至100 µL，从第一行吸取100 µL转移至第二行，用移液器吹打混匀10次。</li>
	<li>将血清以多个比例稀释至第11行，并弃去100 µL液体。</li>
	<li>根据样本模板，将稀释后的阴性血清和阳性血清分别加入第12行的相应孔中（参见 表1-100 µL/孔。</li>
	<li>用塑料膜密封ELISA板，在37 °C下孵育1小时。</li>
	<li>稀释二抗抗小鼠IgG-HRP（参见 材料表) 用 PBST 以 1:10,000 稀释。</li>
	<li>洗涤平板（3个循环，每个循环300 µL）。然后，向每孔加入100 µL稀释的二抗，在37 °C孵育40分钟。</li>
	<li>染色&#160;终止反应：洗涤酶标板（5个循环，每个循环300 µL）。加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）显色液（100 µL；参见 材料表)加入到每个孔中。将培养板置于37 °C避光孵育10分钟，然后立即加入50 µL的2 M HCl终止反应2SO4.</li>
	<li>检测光密度（OD450）值，通过酶标仪检测（读取OD450 终止后15分钟内测量数值。</li>
</ol>
5. 评估 体内 新型佐剂疫苗的效果
注意：该纳米乳剂疫苗的保护效果在商业获取的致死性 MRSA252 小鼠模型中进行评估（见材料表）。根据我们研究团队先前的研究结果14，每只小鼠接种 1 × 108 菌落形成单位（CFU）是评估 MRSA252 细菌感染致死模型保护效果的最佳剂量。
<ol>
	<li>菌株复苏：取一管冻存的 MRSA252，接种细菌于 Mueller Hinton（MH）（A）平板上（参见 材料表）由 &#34;三线法&#34;，并在37 °C下培养过夜。执行以下步骤： &#34;三线法&#34; 如下所述：
	<ol>
		<li>右手持接种环，灼烧灭菌后冷却，以获取一环菌液。</li>
		<li>将琼脂平板用左手持握（皿盖置于桌面上），放置于酒精灯火焰左前方，使平板开口朝向火焰，以防止细菌进入空气中。右手持沾有菌液的接种环，在琼脂表面以密集但不重叠的方式前后划线，覆盖平板总面积的约1/5–1/6区域，此为第一区。 
		注意：接种环与琼脂应以30°–40°的角度轻轻接触；通过用手腕力量滑动可避免划伤琼脂。</li>
		<li>灼烧接种环上多余的细菌（是否需要灼烧或灭菌每个区域取决于标本中细菌的量）。冷却后，重复倒数第二行的第2-3步，在末端划第二个区域（约占平板面积的1/4）。</li>
		<li>第二个区域完成后，烧灼环，以相同方式绘制第三个区域，直至填满整个培养皿。</li>
		<li>画线后，将平板倒置于培养皿盖上，标记平板，并在37 °C培养箱中孵育18–24 h，观察琼脂表面菌落的分布情况。重点注意是否有单个菌落被分离，并观察菌落特征（如大小、形状、透明度和色素产生）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌活化：次日，取两个50 mL摇瓶，各加入20 mL MH（B）培养基（参见 材料表) 各加入一个。用10 µL枪头挑取两个单菌落并加入摇瓶中。37 °C、220 rpm条件下过夜培养。</li>
	<li>二次活化：次日，取两个50 mL摇瓶，每瓶含20 mL MH（B）培养基。从含有初次活化菌液的摇瓶中取出200 µL菌液，加入上述两个含20 mL MH（B）培养基的新摇瓶中，在37 °C、220 rpm条件下振荡培养5 h。</li>
	<li>将第二次活化的细菌溶液收集至50 mL离心管中，在3,000 x g 20 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀的细菌重悬于40 mL生理盐水中。</li>
	<li>测量OD600 细菌溶液的值，并用生理盐水调整至1。此时，实验中MRSA252的细菌数量为2 x 109 CFU/mL</li>
	<li>用OD稀释细菌溶液600 从1稀释至浓度为1 × 109 CFU/mL</li>
	<li>将48只Balb/c小鼠随机分为四组（n=12）。 
	注：第 I 组：PBS 组；第 II 组：BNE 对照组；第 III 组：天然抗原（蛋白）组；第 IV 组：纳米乳剂佐剂疫苗组。</li>
	<li>通过腹腔注射100 mg/kg的1%戊巴比妥钠麻醉小鼠。</li>
	<li>使用红外理疗灯照射小鼠（参见 材料表约1分钟，以引起尾静脉血管扩张。</li>
	<li>通过尾静脉注射稀释后的细菌溶液（步骤5.7），每只小鼠注射100 µL，以进行攻毒。</li>
	<li>将小鼠置于红外理疗灯下，直至其恢复正常的活动能力。</li>
	<li>每12小时观察并记录小鼠存活情况，持续10天。</li>
	<li>通过腹腔注射每公斤体重100 mg的1%戊巴比妥钠，处死在攻击后存活的小鼠。</li>
</ol>

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<li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLS+and+zeta+potential-What+they+are+and+what+they+are+not%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">DLS and zeta potential-What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li>
<li>Francis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+vaccine+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Clinics+of+North+America.+Small+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Recent advances in vaccine technologies.</a> The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).</li>
<li>Tripathi, N. K., Shrivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+recombinant+protein-based+dengue+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1919(2018).</li>
<li>Wilder-Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+vaccine+development%3A+status+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Bundesgesundheitsblatt+Gesundheitsforschung+Gesundheitsschutz%22%5BJournal%5D)">Dengue vaccine development: status and future.</a> Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).</li>
<li>Korneev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+sepsis+and+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of sepsis and septic shock.</a> Molecular Biology. 53 (5), 799-814 (2019).</li>
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作者声明本研究不存在任何利益冲突。

IsdB一种细菌细胞壁锚定且受铁调控的表面蛋白，在获取血红素铁的过程中发挥重要作用15. Hlaα毒素是已知耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）中最有效的细菌毒素之一，可在真核细胞上形成孔道，并干扰细胞黏附及上皮细胞功能。16在本研究中，基于抗原基因，利用基因工程技术构建并表达了一种新型重组MRSA抗原蛋白（HI）。 IsdB 和 Hla然后，采用低能乳化法制备了一种纳米乳液疫苗，并对该疫苗的稳定性和有效性进行了评估。例如，某些特性，如长期稳定性、结构、形态、吸收及效应 体内，受乳液液滴的大小影响很大7结果表明，粒径是影响纳米乳剂转运的重要因素。 体内 及其被抗原呈递细胞的吞噬作用17关于细胞吞噬作用，尺寸小于1 µm的纳米颗粒更容易被树突状细胞（DCs）和巨噬细胞吞噬，也最有可能激发全身性免疫反应18</...

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一种机会性病原体，在全球重症监护病房（ICU）病房1、心血管科和烧伤科中具有最高的感染率之一。MRSA感染率高、病死率高且具有广泛的耐药性，给临床治疗带来极大困难2。在世界卫生组织（WHO）于2017年发布的抗生素耐药细菌全球优先清单中，MRSA被列为最优先的类别3。因此，迫切需要研发一种针对MRSA感染的疫苗。
铝佐剂已被长期使用，其佐剂辅助机制相对明确，具有安全性高、效果良好且耐受性好的特点4。目前，铝佐剂是一类广泛应用的佐剂。普遍认为，吸附在铝盐颗粒上的抗原可提高稳定性，并增强注射部位对抗原的摄取能力，实现良好的吸附和缓慢释放5。目前，铝佐剂的主要缺点在于其对某些候选疫苗抗原缺乏佐剂效应，或仅表现出较弱的佐剂效应6。此外，铝佐剂可诱导IgE介导的超敏反应5。因此，有必要开发新型佐剂以激发更强的免疫应答。
纳米乳佐剂是由油相、水相、表面活性剂和助表面活性剂组成的胶体分散体系7。此外，这类佐剂具有热力学稳定性与各向同性，可通过高压灭菌或高速离心进行稳定处理，并可在温和的制备条件下自发形成。目前已有多种乳剂类佐剂（如MF59、NB001-002系列、AS01-04系列等）上市或处于临床研究阶段，但其粒径均大于&#160;160 nm8，因而无法充分發揮纳米级（1–100 nm）药物制剂的优势（即较大的比表面积、小粒径、表面效应、高表面能、小尺寸效应以及宏观量子隧穿效应）。在本实验方案中，报道了一种基于纳米乳技术、粒径为1–100 nm的新型佐剂，其表现出良好的佐剂活性9。我们测试了重组亚单位疫苗抗原蛋白HI（α-溶血素突变体[Hla]与铁离子表面决定因子B[IsdB]亚单位N2活性片段融合蛋白）；建立了一系列流程，用于检测该佐剂的物理性质与稳定性，评估其在肌内注射后诱导的特异性抗体反应，并利用小鼠全身感染模型验证疫苗的保护效果。

<table><tbody><tr><td>5424-小型高速离心机 FA-45-24-11</td><td>Eppendorf, Germany&amp;nbsp;</td><td>5424000495</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Corning Incorporated, USA</td><td>CLS3922</td><td></td></tr><tr><td>AFM Dimension FastScan</td><td>BRUKER, Germany&amp;nbsp;</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>酒精灯</td><td>深圳易霸迅科技有限公司，中国</td><td>YBS-AA-11408</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c小鼠&amp;nbsp;</td><td>北京华阜生物科技股份有限公司&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>福州迈新生物技术开发有限公司，中国</td><td>BCIP/NBT</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 6.0酶标仪</td><td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>BL21感受态细胞</td><td>Merck millipore, Germany</td><td>70232-3CN</td><td></td></tr><tr><td>BSA-100G</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>B2064-100G</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf, Germany&amp;nbsp;</td><td>5811000398</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝G-250染色液</td><td>MIKX，中国</td><td>DB236</td><td></td></tr><tr><td>脱色液</td><td>BOSTER，中国</td><td>AR0163-2</td><td></td></tr><tr><td>电热恒温培养箱 HH-B11-420</td><td>上海跃进医疗器械厂，中国</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>电泳仪</td><td>北京六一仪器厂，中国</td><td>DYCZ-25D</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Tanon, USA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽-Sepharose亲和层析树脂 GST</td><td>美5生物，中国</td><td>affinity chromatography resin</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>成都科试化工有限公司，中国</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>HI重组蛋白</td><td>第三军医大学，中国</td><td>110-27-0</td><td></td></tr><tr><td>HRP-山羊抗小鼠IgG</td><td>百奥龙，中国</td><td>BF03001</td><td></td></tr><tr><td>HRP-山羊抗小鼠IgG1</td><td>百奥龙，中国</td><td>BF03002R</td><td></td></tr><tr><td>HRP-山羊抗小鼠IgG2a</td><td>百奥龙，中国</td><td>BF03003R</td><td></td></tr><tr><td>HRP-山羊抗小鼠IgG2b</td><td>百奥龙，中国</td><td>BF03004R</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>海门飞越有限公司，中国</td><td>YR-JZH-1UL</td><td></td></tr><tr><td>IsdB和Hla克隆</td><td>上海杰瑞生物技术有限公司，中国</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>异丙基肉豆蔻酸（药用辅料）</td><td>SEPPIC, 法国</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-1-巯基半乳糖吡喃糖苷</td><td>fdbio，中国</td><td>FD3278-1</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤培养基</td><td>北京奥博兴生物技术有限公司，中国</td><td>02-136</td><td></td></tr><tr><td>红外理疗灯</td><td>广州润曼医疗设备有限公司，中国</td><td>7600</td><td></td></tr><tr><td>低温冷冻离心机</td><td>Eppendorf, Germany&amp;nbsp;</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Malvern NANO ZS</td><td>Malvern Instruments Ltd., 英国</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>MH(A)培养基</td><td>北京奥博兴生物技术有限公司，中国</td><td>02-051</td><td></td></tr><tr><td>MH(B)培养基</td><td>北京奥博兴生物技术有限公司，中国</td><td>02-052</td><td></td></tr><tr><td>405 LSRS酶标洗板机</td><td>Bio Tek Instruments,Inc Highland&amp;nbsp; Park, USA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Mini-TBC紧凑型转膜仪</td><td>北京东方瑞利有限公司，中国</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>MMC填料</td><td>东曹（上海）有限公司</td><td>0022818</td><td></td></tr><tr><td>MRSA252</td><td>美国ATCC</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop紫外分光光度计</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>New FlashTM Protein any KD PAGE蛋白电泳凝胶试剂盒</td><td>达科为，中国</td><td>8012011</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>biosharp，中国</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>PCR扩增仪</td><td>Thermal Cycler, USA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-目的基因重组质粒</td><td>上海杰瑞生物技术有限公司，中国</td><td>B3528G</td><td></td></tr><tr><td>磷钨酸</td><td>G-CLONE，中国</td><td>CS1231-25g</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf, Germany&amp;nbsp;</td><td>3120000844</td><td></td></tr><tr><td>聚氧乙烯蓖麻油（药用辅料）</td><td>阿拉丁，中国</td><td>K400327-1kg</td><td></td></tr><tr><td>一抗</td><td>实验室自制：来自免疫小鼠的阳性血清</td><td>null</td><td>详见参考文献11</td></tr><tr><td>丙二醇（药用辅料）</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P4347-500ML</td><td></td></tr><tr><td>蛋白Marker</td><td>Thermo Scientufuc, USA</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PVDF转印膜</td><td>Invitrogen, USA</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>JEOL, 日本</td><td>JSM-IT800</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Merck, Germany</td><td>Tc-P8411</td><td></td></tr><tr><td>Talos L120C透射电子显微镜</td><td>Thermo Fisher, USA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>TMB显色液</td><td>天根，中国</td><td>PA107-01</td><td></td></tr><tr><td>龟试剂盒</td><td>厦门佰安德科技有限公司</td><td>ES80545</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Macklin，中国</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

评估一种纳米乳剂佐剂疫苗针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）感染的免疫应答

Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection

纳米乳佐剂疫苗因其粒径小、热稳定性高以及能够有效诱导免疫应答而受到广泛关注。然而，建立一套全面的评估新纳米乳佐剂疫苗免疫反应的实验方案至关重要。因此，本文介绍了一种严谨的方法，用于测定疫苗的理化特性（通过透射电子显微镜[TEM]、原子力显微镜[AFM]和动态光散射[DLS]），疫苗抗原及体系的稳定性（通过高速离心试验、热力学稳定性试验、SDS-PAGE和Western blot），以及特异性免疫应答（IgG1、IgG2a和IgG2b）。采用该方法，研究人员可对 准确地&#160;一种新型纳米乳剂佐剂疫苗在致死性MRSA252小鼠模型中的保护作用。通过这些方案，可筛选出佐剂效应最显著的纳米乳剂疫苗佐剂，同时该方法有助于优化新型疫苗的后续研发。

纳米乳佐剂疫苗的制备方案 体外 和 体内 对该疫苗进行了检测。采用透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和动态光散射（DLS）技术，测定该样品表面的zeta电位和粒径等关键特性（图1）。SDS-PAGE 和 Western 印迹结果显示，沉淀和上清液中的抗原含量在离心后未发生显著降解，表明该疫苗结构完整、具有特异性和免疫原性（图2）。纳米乳佐剂疫苗显著提高了总IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度，疫苗的免疫原性显著增强。图3A-C）。抗原组在450 nm处的血清IgG2b OD值最高（用PBS按1:500稀释）（图3D）。致死性MRSA252小鼠模型最直接地反映出，纳米乳剂佐剂疫苗具有良好的保护作用，能有效抑制MRSA252细菌感染，提高感染小鼠的存活率（<strong class="xf...

本方案制备并评估物理特性、免疫反应及 体内 一种新型纳米乳剂佐剂疫苗的保护作用

评估一种纳米乳剂佐剂疫苗针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的免疫应答

纳米乳佐剂疫苗因其粒径小、热稳定性高以及能够诱导……而受到广泛关注

本实验方案强调了评估新型病毒佐剂对免疫应答作用的直接且有效的实验方法及详细步骤。该方案不仅为佐剂疫苗提供了基本的免疫学评价方法，还可用于测定其批量稳定性。首先，取10 mg/mL的工作浓度MRSA HI抗原蛋白溶液，依次加入三种辅料：肉豆蔻酸异丙酯、聚氧乙烯蓖麻油和丙二醇，保持其质量比为1:6:3。充分搅拌混合物，然后逐渐加入灭菌纯水，使体系体积达到10毫升。采用低能乳化法制备纳米乳剂疫苗时，于25摄氏度下以500转/分钟的速度搅拌约20分钟。随后得到含有1毫克/毫升蛋白质的纳米乳剂疫苗，呈澄清透明液体状。对于酶联免疫吸附测定（ELISA）板的抗原包被，用包被液将HI蛋白抗原稀释至每毫升10微克，并在ELISA板的每个孔中加入100微升稀释后的抗原。将板在4摄氏度下孵育过夜。孵育结束后，用每孔300微升的PBST洗涤板。每孔加入300微升封闭液，在37摄氏度下封闭2小时，然后将各实验组小鼠血清3微升用PBST稀释100倍（加入297微升PBST），涡旋混匀稀释后的血清。每孔加入100微升稀释后的血清至包被的ELISA板中。同样，将阳性与阴性对照血清用PBST稀释100倍，即在396微升PBST中加入4微升阳性或阴性对照血清，随后涡旋混匀。进行倍比稀释时，将200微升先前稀释过的实验血清加入已包被的ELISA板的第一行，然后除第一行和第12行外，向所有孔中加入100微升PBST。接着，将移液器调整至100微升，从第一行取100微升血清转移至含有PBST的第二行。使用移液器将第二行中的液体混合10次。类似地，将血清进行一至两次连续稀释，直至第11行。完成后，从第11行弃去100 µL液体。按照样本模板，向第12行各对应孔中分别加入100 µL稀释后的阴性血清和阳性血清。用塑料膜密封酶联免疫吸附试验（ELISA）板，在37摄氏度下孵育1小时。同时，用PBST将二抗抗小鼠IgG HRP稀释10,000倍。孵育1小时后，每孔加入300微升PBST洗涤ELISA板，以去除未结合的抗体，然后每孔加入100微升稀释后的二抗，在37摄氏度下继续孵育40分钟。每孔加入 300 微升 PBST 洗涤，然后每孔加入 100 微升 TMB 显色液。将酶标板置于 37 摄氏度、避光条件下反应 10 分钟。随后，每孔加入 50 微升 2 摩尔硫酸，立即终止反应。终止反应后15分钟内，使用酶标仪在415纳米处检测光密度（OD值）。采用透射电子显微镜和原子力显微镜分析新型纳米乳剂疫苗的物理特性。利用动态光散射法测定样品的粒径分布及zeta电位。SDS-PAGE 和蛋白质印迹结果显示，离心后沉淀和上清液中的抗原量无显著差异，表明该疫苗结构完整、具有特异性和免疫原性。纳米乳剂佐剂疫苗显著提高了小鼠的总 IgG、IgG1 和 IgG2a 抗体滴度。蛋白疫苗的免疫原性得到显著增强。当 PBS 以 1:5,000 稀释度使用时，血清 IgG2b 在 450 纳米处的 OD 值最高。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA 252）小鼠致死模型显示，纳米乳液疫苗具有良好的保护作用，能有效抑制 MRSA 252 细菌感染，并提高感染小鼠的存活率。纳米乳液的制备以及将血清添加至植物中的步骤最为关键。此外，在检测抗体滴度时，应注意将其校正至更广范围并基于液体进行稀释。除了佐剂外，该方法还可用于其他材料阵列的免疫进化研究，例如塑料或递送系统。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

评估纳米乳剂佐剂疫苗对耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌 （MRSA）感染的免疫反应

本视频展示了一种高效的均质化技术，用于制备抗原-佐剂乳剂，以在小鼠模型中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。该乳剂的水相中含有自身抗原——髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG），周围由包含灭活病原菌的连续油相包裹。该乳剂可实现抗原的持续释放，从而引发持久的免疫反应。...

制备抗原-佐剂乳剂以诱导自身免疫性脑脊髓炎

本视频展示了一种用于评估预先免疫小鼠对新型纳米乳剂佐剂疫苗抗体免疫应答的方法。通过测定IgG抗体滴度，证实免疫接种可增强抗体应答。...

测量小鼠血清中针对试验性疫苗的免疫球蛋白G水平

本视频展示了纳米乳剂肿瘤疫苗的制备过程。通过低能量纳米乳化法，可制备出含有合成肽和佐剂的稳定油相储库，该方法在肿瘤免疫治疗中具有重要应用前景。...

纳米乳佐剂疫苗的制备

我们介绍了在小鼠疫苗接种模型中，利用纳米颗粒免疫后，通过整体动物成像和基于流式细胞术的技术来监测抗原特异性CD8+...

纳米颗粒疫苗接种后抗原特异性CD8+ T细胞应答的全动物成像与流式细胞术分析技术

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体外 细胞活性评价纳米乳疫苗佐剂麦冬皂苷D

本文详细介绍了鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备与评价方法 体外 和...

鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备、特性、毒性及有效性评价 体外 和 体内

为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种多发性硬化症的动物模型），需用含有自身抗原和完全弗氏佐剂的油包水乳剂对小鼠进行免疫。尽管目前已存在多种乳剂制备方案，本文介绍了一种快速、简便且标准化的乳剂均质化制备方法。...

一种快速、简单且标准化的匀浆方法用于制备抗原/佐剂乳剂以诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎

我们介绍四种利用纳米颗粒和纳米结构表面评估其抗菌活性的方法 体外...

纳米颗粒与纳米结构表面抗菌活性的评估 体外

在本方案中，我们开发了一种阳离子纳米乳剂包裹的视黄酸（RA），用作佐剂以促进抗原特异性的全身和黏膜免疫应答。通过将美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用的视黄酸添加到纳米乳剂中，在肌肉注射该纳米乳剂后，可促进阴道和小肠中的抗原特异性分泌型IgA（sIgA）产生。...

阳离子纳米乳液包裹的视黄酸作为佐剂促进OVA特异性全身及黏膜免疫应答

详细介绍了利用滴流反应器和旋转盘反应器构建开放式系统流动生物膜的实验方案。...

用于Staphylococcus aureus生物膜分析的滴流式与旋转盘反应器的使用

了解纳米乳剂佐剂疫苗的制备与免疫评估方法，用于MRSA感染研究。该方案采用低能乳化法制备疫苗，通过ELISA检测抗体滴度，评估体内保护效果，为疫苗开发提供可靠框架。

评估一种纳米乳剂佐剂疫苗针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的免疫应答

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