通过仪器工程实现柑橘接穗加工自动化以进行下游病原体检测

本方法采用一种低成本仪器，可快速处理富含韧皮部的柑橘组织，无需依赖劳动密集型操作流程和专用实验设备。这有助于快速进行后续检测，并有效管理柑橘类植物的类病毒、病毒和细菌。该方法有望提高检测通量，改善检测服务的质量与一致性，从而惠及柑橘产业，并可能辅助苗圃及田间作业中病害的诊断与防治。

柑橘类植物受病原体感染，导致全球范围内严重的经济损失。为大规模培育柑橘树生产经过病原体检测的繁殖材料，必须采用先进的病原体检测技术，例如芽条组织提取器（Budwood Tissue Extractor，简称 BTE）。尽管该方法已使用柑橘样品进行了测试和验证，但也可应用于其他多种作物的诊断实验室和田间操作中。

初学者在进行该技术操作时，必须熟悉实验方案，严格遵循操作说明，并保持耐心。首先，使用手机应用程序 Test Tracker 选择一棵果树，并将一个近场通信（NFC）项圈标签贴近手机，以将果树信息载入该标签中。随后，将三到四份柑橘接穗样本插入与接穗组织提取器（BTE）兼容的塑料袋载体中，并用夹子密封封口。

按照文中所述步骤确保样本质量后，使用手机应用程序 Test Tracker 扫描树木的 NFC 项圈标签，并将其与样本袋上的 NFC 夹子标签进行关联。在经过适当消毒的通风橱内，拨动组织提取仪底座背面的开关，确保盒子左侧的开关被按至顶部位置，并等待闪烁的绿色 LED 指示灯表明腔室已准备就绪。

准备BTE室时，使用O形圈将一个空的样品袋固定在腔室背面的喷嘴上。检查刀片是否有磨损或损坏迹象，例如刀片上的切口延伸至塑料部分，或刀尖处有切口。确保刀片上的箭头与单个锁紧符号对齐，并且腔室底部的排气口朝向O符号。

将透明盖子盖在腔室开口上。利用腔室右侧的轨道，将透明的BTE滑块推入腔室，同时将腔室底部的锁扣尽可能推入滑块中。确保柱塞帽已安装在滑块顶部。

将BTE腔室安装到BTE底座上时，应将准备好的腔室放置在底座上，使BTE底座的喷嘴伸入腔室后部。通过将NFC夹子标签上的白色标签以缓慢的环形运动移至盒子右侧的Z处，直到黄灯开始闪烁，从而将样品加载到BTE底座上。将样品连接到底座后，确保样品袋无任何孔洞。

然后将O形圈套在样品袋上，以将其固定在BTE喷嘴的前端。安装未使用的注射器组时，首先撕开注射器组的包装，然后将未使用的注射器组放置在称重秤支架上。

当红灯开始闪烁或天平显示为零时，取下注射器组件。将带有滤膜的推杆从注射器中取出，同时确保液体仍保留在下方的注射器中。将推杆放置在纸巾或支架上，确保其不接触任何表面。

最后，将注射器连接到载玻片出口端口，将出口端口插入注射器并旋转90度。开始处理接穗样品时，按下顶部黑色按钮以启动仪器。从袋中取出一根接穗枝条，将其从BTE喷嘴顶部插入。

用另一只手握住芽条棒在室的另一侧，缓慢地将其向下推进刀片中。在推进的同时，缓慢地前后移动芽条并旋转它。当听到轻微的嗡嗡声时，将枝条进一步推入机器，以集中处理韧皮部。

完成所有分支的操作后，按下顶部的黑色按钮以停止处理，并等待指示灯再次开始黄色闪烁。为确认样品重量，将注射器旋转90度并向下拉出。将活塞重新放回注射器上，然后将注射器放置于塔架上。

当电子天平自动检测到样品后，绿色LED灯闪烁表示样品重量在正常范围内。若红灯闪烁，表示样品重量过低，需重复样品处理步骤；若重量过高，则需移除部分样品，此时黄色LED灯的闪烁频率将逐渐变慢。

为使样品均质化，先将装有样品的注射器中的活塞取出。推动液体进入注射器后，重新插入活塞。推动活塞，使缓冲液和植物汁液通过橡胶管经由滤网进入空的注射器中。

通过将缓冲液和植物汁液在两个注射器之间来回推注三到四次，使样品混合，直至样品变为均一的绿色液体。充分匀浆后，将植物汁液样品推入不含滤网的注射器中，并拆下橡胶管及带滤网的注射器。然后将植物汁液样品从注射器中排出，收集至一个2 mL无菌微量离心管中。

使用永久性记号笔用袋子编号标记样品后，将其储存在零下20摄氏度，直至进一步使用。在处理完第10个样品后，若绿色LED灯持续闪烁而未变为蓝色，则需对BTE可拆卸腔室进行消毒。为拆卸腔室并清除所有污染物，请取下透明塑料盖、透明腔室滑块以及腔室滑块上的堵塞口。

然后将腔室底部的排气阀转向打开的锁扣标记。将腔室组件放入超声波清洗仪的装置中后，把腔室放入清洗槽内，并将盖子置于其下方，以防止盖子漂浮。运行超声波清洗仪15分钟。

将腔室组件放入水浴中冲洗至少30秒，然后将其转移至干燥工位。开始干燥时，将气枪对准腔室上端开口的凹槽，按压气枪扳机，吹气约30秒。将气枪转向腔室顶部的喷嘴，按压扳机后，缓慢沿每个喷嘴入口描画完整的三圈。

将气枪置于BTE的中心位置，从最内侧开始按住扳机，移动气枪直至其指向载玻片。快速将气流吹过整个腔室的前后面，以去除表面外侧的水分。BTE与传统实验室方案在柑橘组织处理中的比较表明，通过在260纳米处测量吸光度所确定的两种方法提取的核酸浓度相当。

通过BTE提取的核酸纯度以260和280纳米处吸光度的比值确定，结果显示纯度较高，蛋白污染较低。通过靶向柑橘NADH脱氢酶基因mRNA的RT-qPCR分析，BTE与标准手工方法提取的核酸完整性非常相似。传统的实验操作每份样品手工切碎需耗时近7至10分钟，而组织处理（包括冷冻干燥、研磨和离心）所需时间更长。

然而，BTE 处理每个样本进行核酸提取仅需三分钟，包括准备、称重和清洗步骤。首次 BTE 样本处理中的 72 个健康样本均未产生所检测柑橘病原体的扩增曲线，从而验证了 BTE 对柑橘组织处理的有效性。在第二次 BTE 样本处理中，引入了两个混合感染样本，提取的核酸显示第一组和第五组中存在不同的柑橘病毒和类病毒。

然而，未检测到不同样本头之间存在交叉污染，也未出现假阳性或假阴性结果。在处理过程中，若将组织长时间停留在同一位置，可能导致对组织切割过深，增加堵塞风险，并收集到无细胞的纤维状物质。处理完成后，所得样品即可用于大多数DNA和RNA提取与纯化流程，并可用于任何针对植物病原体的分子检测分析。

开发芽条组织提取器为高通量、大面积及全果园范围的筛查打开了大门。结合叶片组织提取器，现在能够大规模处理此前被认为难以处理的植物组织，例如根和果梗。