新生小鼠耳蜗全组织外植体作为 体外 模型

本方案采用一种简便的方法来简化培养步骤，获得高质量的耳蜗组织外植体，有助于探索和揭示耳蜗细胞的分子机制。该技术的主要优势在于通过协调解剖步骤、合适的聚合物表面包被、优化的培养基体积以及外植体的贴附时间，最大限度减少对器官的直接操作。该技术是一种研究感音神经性听力损失的常用体外方法。

可用于建立耳毒性模型、进行结构分析、评估信号通路以及开展药物筛选研究。原则上，该方法可适用于不同的组织外植体。此外，还可应用于内耳研究，以深入了解胚胎发育阶段。

首先，将断头大鼠的头部置于无菌垫上。使用剪刀和镊子去除下颌骨，然后提起皮肤并从颅骨上剥离。将镊子插入眼眶以固定颅骨。

使用锋利的手术刀片，沿矢状缝小心切开颅骨，然后切开冠状缝区域，注意不要损伤耳蜗。现在将脑组织从两侧颅骨中取出。在显微镜下定位颞骨中的耳蜗，并松解耳蜗与颞骨之间的周围组织。

然后将镊子置于上半规管中。轻轻将颞骨从耳蜗处拉开，并用镊子夹住与前庭相连的耳蜗及颞骨。将镊子尖端插入可见为一条白线的耳蜗顶区，逐块去除软骨性耳蜗囊，以暴露耳蜗管。

将镊子置于耳蜗下方，将其从前庭器官和颞骨上分离。将耳蜗转移至一个新的含有冰冻 PBS 的 60 毫米培养皿中。为分离柯蒂氏器组织块，用手持住耳蜗底部及基底钩区域的耳蜗管，从蜗轴上轻轻展开耳蜗管，注意不要撕裂。

然后在基部握住耳蜗导管，分离并移除螺旋韧带和血管纹。为分离耳蜗外植体，使用镊子将螺旋神经节从骨性螺旋板上分离，并在分离过程中展开蜗轴。用镊子夹住钩状区域，去除带有血管纹的螺旋韧带。

此外，逐片剥离前庭膜。转移耳蜗外植体时，将实验铲浸入盛有外植体的培养皿中，用实验铲轻轻晃动，连同少量几微升 PBS 液体一起将外植体连同毛细胞面朝上抬起。

用移液铲在培养基中轻轻晃动，将外植体放入八孔培养板中，使其滑入孔内。使用100微升移液器吸取并弃去80微升培养基。

在显微镜下检查毛细胞和螺旋神经节神经元细胞的可见性。如有必要，使用镊子分开重叠的组织。移除孔中剩余的培养基。

外植体现在将更平整地贴附在培养室表面。10秒后，用移液器将一至两滴培养基加到外植体附近，剩余的培养基则加在较远的位置，以避免外植体脱落。添加培养基时，确保外植体不发生移动。

将培养 chamber 置于培养箱中孵育两小时，以使器官牢固附着于 chamber 底部。孵育结束后，吸除培养基。然后使用 100 或 200 微升移液器，小心加入 300 微升新鲜的预热完全培养基。

转盘共聚焦显微镜图像显示，大鼠耳蜗柯蒂氏器外植体在正常和应激条件下均保持了其结构完整性和总长度。此外，扫描共聚焦显微镜显示了来自小鼠器官的外植体中存活的毛细胞以及正在进行凋亡的毛细胞。该方案通过使用适当的细胞膜通透性探针和转盘共聚焦显微镜，实现了对活体耳蜗细胞中生物过程的实时监测。

耳蜗外植体的培养有助于分析毛细胞与螺旋神经节细胞之间的相互作用。通过毛细胞标志物 MYO7A 检测耳蜗植入物中的毛细胞。同样，利用神经元标志物 Tuj 1 鉴定健康和受损的螺旋神经节细胞胞体及其神经突起。

在放大的概览图像中，可见用 MYO7A 抗体标记的毛细胞胞体。可识别出外毛细胞的静纤毛以及用鬼笔环肽标记的单个内毛细胞静纤毛的去卷积图像。在显微镜下操作时必须格外小心，尤其是在将螺旋神经节从骨性螺旋板分离时。

应小心转移并正确排列完整的外植体。本方案优化了内耳外植体的体外研究。这些研究的结果，如信号通路和药物毒性，可为后续体内研究的设计提供指导。