Name: 渗透压微型泵植入增加小鼠脑脊液中葡萄糖浓度 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: 了解渗透压微型泵植入技术，通过立体定位手术在小鼠脑脊液中特异性升高葡萄糖浓度而不影响血糖水平。该方法为研究神经退行性疾病和认知功能障碍提供了重要的动物模型。

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美国国立卫生研究院资助项目 DK124619，授予 KHC。
启动资金及试点研究奖，纽约罗切斯特大学医学院，授予 KHC。
罗切斯特大学德蒙特神经科学研究所试点研究奖，授予 KHC。
纽约罗切斯特大学研究副校长办公室授予 KHC 大学研究奖。
MUR 设计并实施了该方法，分析了结果，绘制了图表，并撰写和修改了论文。KHC 构思并监督了本研究，分析了结果，并撰写和修改了论文。KHC 是本研究的负责人。所有作者均批准了论文的最终版本。

所有小鼠操作均经罗切斯特大学机构动物照护与使用委员会批准，并依照美国公共卫生服务局关于实验动物人道照护与使用的指南进行。本研究所用的6周龄C57BL/6J雄性小鼠购自商业供应商。所有动物均以每笼5只的群居方式饲养于12小时昼夜循环环境中，并可自由获取食物和饮水。ad libitum。在小鼠植入用于向侧脑室输注葡萄糖的导管后，改为单只单独饲养，以防止其他小鼠对植入装置造成损伤。
1. 渗透压微型泵的组装
<ol>
	<li>根据以下步骤配制人工脑脊液（aCSF）。将 NaCl（8.66 g）、KCl（0.224 g）、CaCl2·2H2O（0.206 g）和 MgCl2·6H2O（0.163 g）溶解于 500 mL 无菌水中，配制成溶液 A。将 Na2HPO4·7H2O（0.214 g）和 NaH2PO4·H2O（0.027 g）溶解于 500 mL 无菌水中，配制成溶液 B。然后将溶液 A 和溶液 B 按 1:1 体积比混合，得到 aCSF。 
	注意：该配方的 aCSF 不含葡萄糖。</li>
	<li>配制 50% 葡萄糖溶液时，将 50 g 葡萄糖加入盛有 50 mL aCSF 的烧杯中。将烧杯置于加热板上，将悬液温度升至 60 °C。使用磁力搅拌器搅拌，直至葡萄糖完全溶解。</li>
	<li>向烧杯中加入 aCSF，使最终体积达到 100 mL。用孔径为 0.22 µm 的滤膜过滤溶液，以实现灭菌。</li>
	<li>配制 0.9% 生理盐水（NaCl 溶液），并通过 0.22 µm 滤膜过滤。</li>
	<li>将微型泵及输注套件的所有组件置于无菌托盘中，使用无菌剪刀将脑部输注套件的导管剪至 1 英寸长度。用无菌止血钳夹住导管，将其套在套管一端的顶端。将导管另一端连接至流量调节器的顶部。在导管两端涂少量胶水，以增强连接牢固性。</li>
	<li>将 27 G 针头连接至 1 mL 注射器，并吸入 aCSF 或葡萄糖溶液。将 27 G 针头插入一小段导管中，然后将该导管连接至流量调节器的开放端，用相应溶液充满导管，直至溶液从套管末端开始滴出。排除导管中残留的任何气泡。</li>
	<li>为微型泵注液时，将泵垂直持握，将注射器针头插入泵体，注入相应溶液，直至泵体开口处出现液滴。</li>
	<li>缓慢将流量调节器插入泵体，注意避免在组装过程中引入气泡。</li>
	<li>微型渗透泵组装完成后，将其转移至 50 mL 锥形管中。向管内加入无菌生理盐水，使泵体完全浸没，但确保套管部分不接触盐水。每个 50 mL 锥形管中可放置四个组装好的微型泵。</li>
	<li>将管盖轻轻盖上（不拧紧），在 37 °C 条件下孵育至少 48 小时，以启动泵体。</li>
</ol>
2. 植入渗透压泵的手术操作
<ol>
	<li>术前准备
	<ol>
		<li>将手术器械在高压灭菌器中灭菌，并在使用前至少冷却30分钟。灭菌条件为121 °C湿热灭菌30分钟。</li>
		<li>用70%乙醇对手术区域进行消毒。擦拭旋钮、耳杆和立体定位仪表面。 
		注意：手术应在无菌环境中进行，注意避免在操作过程中接触非无菌表面。若怀疑手套被污染，应立即更换。</li>
		<li>将小鼠放入麻醉诱导舱中，用含3%异氟烷的空气麻醉3-5分钟。随后将小鼠从舱中取出，置于无菌手术巾上，并通过鼻罩维持1.5%-2%的异氟烷麻醉。</li>
		<li>轻捏小鼠后肢足垫，观察是否存在反射，以确认麻醉深度。</li>
		<li>皮下注射5 mg/kg卡洛芬以提供镇痛。</li>
		<li>使用清洁的毛发剪修剪小鼠头部手术区域的毛发。先用聚维酮碘溶液擦拭头皮，再用酒精棉片彻底擦拭至少2分钟。此过程至少重复三次。</li>
		<li>涂抹眼用润滑剂，防止手术期间眼睛干涩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作
	<ol>
		<li>将小鼠固定于立体定位仪上，使其门齿挂于门齿杆。鼻部覆盖鼻罩，并用无菌手术巾覆盖以固定手术区域。</li>
		<li>将异氟烷气流切换至鼻罩，继续以&#160;1.5%-2%异氟烷维持麻醉。</li>
		<li>在小鼠身下放置加热垫，以维持其体温。</li>
		<li>戴上新的无菌手套，使用手术刀在头皮正中线处做一长约10-15 mm的切口。用刮匙暴露颅骨表面，同时用棉签清除出血。 
		注意：若出现大量出血（罕见），可使用电凝器止血。</li>
		<li>用蘸有3%过氧化氢的棉签擦拭，以暴露颅骨缝线。</li>
		<li>记录前囟（bregma）和后囟（lambda）位置，用于确定颅骨坐标。将所有坐标在前囟处设为零点。 
		注意：这些坐标数据来源于小鼠脑图谱14。图谱中前囟-后囟参考距离为4.21 mm。为校正因年龄和性别差异导致的颅骨大小变化，测量每只小鼠的前囟-后囟距离，并除以4.21 mm，得到一个乘法校正因子。例如，若某小鼠前囟与后囟距离为4.65 mm，则除以4.21 mm后得到校正因子1.10。随后将图谱中所有坐标乘以该因子，以确定实际钻孔坐标。以上例而言，所得前后（AP）和内外侧（ML）坐标分别为0.55 mm和1.1 mm（即1.1 × 0.5 或 1 mm）。</li>
		<li>使用电动钻在以下坐标位置钻孔：前囟后方0.5 mm，中线向右1 mm处。&#160; 
		注意：钻颅骨孔时需小心，避免刺破硬脑膜。确保钻头已灭菌，可与其他器械一同置于同一高压灭菌袋中进行灭菌。</li>
		<li>将止血钳插入切口皮肤下方，并推送至微型渗透泵拟植入位置。轻柔开合止血钳，以形成容纳泵体的皮下囊袋。</li>
		<li>使用无菌止血钳从流量调节器末端夹取&#160;已预充的微型渗透泵，并将其经皮肤切口推入囊袋中。 
		注意：操作过程中应避免泵体和导管接触任何非无菌表面。</li>
		<li>在导管底面涂抹少量胶水，并将其固定于导管固定座中。缓慢将导管经钻孔插入，深入颅骨表面下方2 mm。保持该位置至少5分钟，使胶水充分固化。</li>
		<li>在将导管插入脑组织前，需确认导管未堵塞，且溶液流动通畅。 
		注意：由于流速极低，葡萄糖可能在导管尖端沉积，从而阻塞液体流动。</li>
		<li>借助剪刀剪除导管顶端多余部分，注意避免其从颅骨表面移位。</li>
		<li>在导管周围覆盖一层牙科水泥，以提供额外支撑。</li>
		<li>使用尼龙缝线（5-0规格，长度30英寸）缝合伤口，并在伤口处涂抹局部抗生素以预防感染。</li>
		<li>关闭异氟烷气流，让动物从麻醉中恢复，随后将其转移至新的清洁笼具中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后护理
	<ol>
		<li>术后至少连续观察小鼠1周。</li>
		<li>术后连续三天，每天皮下注射5 mg/kg卡洛芬一次。</li>
		<li>待伤口完全愈合后，于术后7-10天拆除缝线。 
		&#8203;注意：观察发现，脑脊液葡萄糖水平较高的小鼠愈合时间较长。修剪小鼠后肢指甲可减少因抓挠行为导致切口部位受伤的风险。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 更换微型泵
注意：由于本研究中使用的微型泵仅能持续工作4周，因此也测试了微型泵的更换方法，以延长葡萄糖输注时间，这在长期研究中可能是必要的。该过程包括以下步骤。
<ol>
	<li>按照上述步骤准备小鼠进行手术。</li>
	<li>在泵上方稍偏位置的皮肤上做一个约1 cm的垂直小切口。</li>
	<li>将止血钳插入切开的皮下，将泵拉出。</li>
	<li>将泵从管路中移除，并将一个新的已预充泵连接至管路。</li>
	<li>将泵重新置入皮下，并缝合皮肤。</li>
	<li>术后护理遵循上述相同的指导说明。</li>
</ol>
4. 脑脊液采集步骤
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>使用微量移液器拉制仪将直径为1 mm的玻璃毛细管拉制成尖端直径为0.5 mm的毛细管。仪器参数设置为：加热温度 = 800，拉力 = 15，速度 = 5，时间 = 200单位。将拉制好的毛细管置于无菌盒中备用。</li>
		<li>将27 G针头连接至1 mL注射器上。将拉制好的毛细管插入针头，并用少量胶带固定连接处。</li>
		<li>将注射器牢固地固定在显微操作仪的毛细管夹持器中。</li>
		<li>接下来，按照上述术前操作步骤准备小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作
	<ol>
		<li>将小鼠置于立体定位仪上。如前所述固定头部后，旋转旋钮使头部倾斜，使鼻部朝下。使用无菌&#160;手术巾覆盖以固定手术区域。</li>
		<li>在背侧表面做一小切口，从耳间平面开始向尾侧延伸。 
		注意：切口时需小心，避免损伤导管。</li>
		<li>移除小鼠身体下方的支撑物，使小鼠垂直放置，以便颈部充分向背侧伸展。</li>
		<li>借助弯头钝头镊子，从正中线轻轻分离后颈部肌肉，形成一个小窗口。&#160;然后使用湿润的棉签轻轻将颈部肌肉从&#160;正中线&#160;向周围推开。</li>
		<li>观察小脑延髓池是否暴露，其表现为一个具有透明硬脑膜的三角形区域。</li>
		<li>将显微操作仪组件放置在立体定位仪上小鼠旁边，确保毛细管尖端不接触任何表面。</li>
		<li>轻轻折断毛细管尖端，同时不扰动整体装置。</li>
		<li>在放大镜（放大倍数2.25倍）下观察，旋转显微操作仪上的相应旋钮，缓慢调整并移动毛细管尖端对准小脑延髓池。</li>
		<li>当毛细管尖端接触小脑延髓池膜时会感到一定阻力。借助旋钮非常缓慢地将尖端压向膜面。 
		注意：需小心避免损伤膜内的任何血管。此步骤至关重要，以防止脑脊液中出现血液污染。</li>
		<li>极其轻柔地刺穿膜。由于毛细管内存在负压，脑脊液将立即开始流入毛细管。</li>
		<li>保持装置静置数分钟，直至毛细管中收集约10 µL脑脊液。</li>
		<li>随后，缓慢将毛细管从小脑延髓池中抽出，并用无菌棉签轻轻按压小脑延髓池开口处，以阻止脑脊液泄漏。</li>
		<li>小心地将毛细管从注射器上取下，并连接至微毛细管吹吸装置。按压吹吸球，将脑脊液转移至无菌微量离心管中。</li>
		<li>在小鼠下方放置支撑物，并旋转立体定位仪旋钮使头部恢复水平。</li>
		<li>使用尼龙缝线缝合伤口。</li>
		<li>在将小鼠移出装置前，皮下注射300 µL无菌生理盐水。</li>
		<li>按照上述方法对动物进行术后护理&#160;，直至拆线时间——术后约7–10天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 葡萄糖检测
<ol>
	<li>按照葡萄糖比色测定试剂盒中所述的方案进行操作。</li>
	<li>用超纯水将试剂盒中提供的磷酸钠缓冲液母液稀释至 50 mM 浓度。</li>
	<li>用试剂盒中提供的 1,000 mg/dL 母液在稀释后的缓冲液中配制浓度为 0、2.5、5、7.5、10、15、20、25 和 50 mg/dL 的葡萄糖标准品。</li>
	<li>用缓冲液对脑脊液（CSF）样本进行 7 倍&#160;稀释。&#160;例如，若采集的脑脊液总体积为 10 µL，则 7 倍稀释后的体积为 70 µL。</li>
	<li>在 96 孔板中，每孔加入 15 µL 葡萄糖标准品和稀释后的脑脊液样本，每个样本设复孔。</li>
	<li>在含有标准品和脑脊液的各孔中，每孔加入 85 µL 稀释缓冲液。</li>
	<li>向葡萄糖比色酶反应混合物小瓶中加入 6 mL 稀释缓冲液，涡旋震荡数秒以充分混匀。</li>
	<li>向每孔中加入 100 µL 酶反应混合液以启动反应。</li>
	<li>用封板膜密封板孔，轻轻敲击板面以混匀试剂。</li>
	<li>将板置于 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟。葡萄糖浓度较高的小瓶会立即开始变为紫色。</li>
	<li>孵育 10 分钟后，移除封板膜，使用酶标仪在 500–520 nm 波长下测定吸光度。</li>
	<li>根据标准曲线插值计算脑脊液样本中的葡萄糖浓度。</li>
</ol>
6. 血糖检测
<ol>
	<li>使用剃须刀片在小鼠尾部做一小侧切口，取一滴血，按照血糖仪说明书的操作步骤测量血糖水平。</li>
</ol>

<ol><li>Moheet, A., Mangia, S., Seaquist, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+diabetes+on+cognitive+function+and+brain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Impact of diabetes on cognitive function and brain structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1353, 60-71 (2015).</li>
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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本文报道了一种通过将渗透压微型泵连接至植入侧脑室的导管来提高小鼠脑脊液葡萄糖水平的详细实验方案。通过该方法在小鼠脑内进行葡萄糖的慢性灌注，将有助于阐明长期高脑脊液葡萄糖对认知功能、全身葡萄糖代谢和能量平衡的影响&#160;，并有助于更深入理解糖尿病并发症的发病机制&#160;。
慢性糖尿病会导致脑损伤，从而中断大脑与外周器官之间的通信15。糖尿病还会增加神经退行性疾病的风险，包括阿尔茨海默病3,4。链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病一直是糖尿病研究中的标准啮齿类动物模型16；STZ会损伤胰腺中的β细胞，导致类似1型糖尿病的病理变化。此外，在一种改良版本中，联合使用STZ与烟酰胺可诱导出2型糖尿病。另一种在动物中产生类似2型糖尿病表型的方法是通过高脂饮食喂养16。然而，在研究高血糖对脑功能影响的背景下，这些技术在控制大量因素...

1型和2型糖尿病均会损害大脑功能1,2,3。例如，糖尿病会增加认知功能下降和神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病）的风险3,4。此外，糖尿病患者大脑中的葡萄糖感知功能存在缺陷5,6。这种缺陷可导致低血糖感知障碍以及对低血糖缺乏足够的反向调节反应7,8，若不立即治疗，可能危及生命。
鉴于糖尿病会升高血液以及脑脊液（CSF）中的葡萄糖水平9，确定其中一个或两个因素是否导致脑功能受损显得尤为重要。糖尿病是否仅由脑脊液中高葡萄糖水平引起脑损伤，还是与胰岛素缺乏或胰岛素抵抗等其他因素共同作用所致，目前仍是一个未解的问题。1型和2型糖尿病的动物模型除了表现出能量平衡和外周葡萄糖代谢异常外，还显示出认知功能下降和神经退行性病变10,11,12,13。然而，利用这些模型难以区分高脑脊液葡萄糖水平与高血糖水平在介导糖尿病对脑功能影响中的独立作用。
本方案描述了建立高脑脊液葡萄糖小鼠模型的方法，用于研究长期高脑脊液葡萄糖水平对脑功能、能量平衡及葡萄糖稳态的影响。通过该技术建立的小鼠模型为探讨葡萄糖稳态失调在神经和行为功能异常中的病因学作用提供了研究工具。
因此，该研究方法将有助于理解脑脊液葡萄糖水平升高在各种病理生理条件下的直接效应。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>膜溶液</td><td>SFPES030022S</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 无菌注射器（鲁尔锁头）</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1 mL TB 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>100 mL 玻璃烧杯</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇（Koptec）</td><td>DLI</td><td>UN170</td><td>使用 70% 稀释液清洁手术区域</td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>对准指示器</td><td>KOPF</td><td>1905</td><td></td></tr><tr><td>Alzet 脑部输注套件</td><td>DURECT</td><td>Kit # 3; 0008851</td><td>将套件中的管路剪成 1 英寸长度</td></tr><tr><td>Alzet 渗透压泵</td><td>DURECT</td><td>2004</td><td>流速 0.25 &amp;micro;L/h</td></tr><tr><td>麻醉系统</td><td>Kent Scientific</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Avrio Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; · 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>套管固定器</td><td>KOPF</td><td>1966</td><td></td></tr><tr><td>中心定位镜</td><td>KOPF</td><td>1915</td><td></td></tr><tr><td>牙科水泥液体</td><td>Lang Dental</td><td>REF1404</td><td></td></tr><tr><td>牙科水泥粉末</td><td>Lang Dental</td><td>REF1220-C</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>电动钻</td><td>KOPF</td><td>1911</td><td>钻孔时避免刺破硬脑膜</td></tr><tr><td>眼用润滑剂（Optixcare）</td><td>CLC Medica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠灭菌器（Germinator 500）</td><td>VWR</td><td>101326-488</td><td>将器械置于无菌水中冷却后再进行手术</td></tr><tr><td>葡萄糖检测试剂盒</td><td>Cayman chemical</td><td>10009582</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>H1009-500ml</td><td>在颅骨表面使用 3% H2O2 以使颅缝清晰可见。</td></tr><tr><td>毛发剪刀</td><td>WAHL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Heatpax</td><td>19520483</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Fluriso）</td><td>Zoetis</td><td>NDC1385-046-60</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>0395-500g</td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>WPI</td><td>M1</td><td></td></tr><tr><td>带放大功能的台灯</td><td>Brightech</td><td>LightView Pro Flex 2</td><td></td></tr><tr><td>金属刮刀</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; · 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器（右手型）</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>带数字显示的显微操作器</td><td>KOPF</td><td>1940</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; · 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5Kg</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; · H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>新孢霉素（Neosporin）</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>N/A</td><td>涂抹外用软膏以预防感染</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td>DM-999</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl（卡洛芬）50 mg/mL</td><td>Zoetis</td><td>N/A</td><td>5 mg/kg，皮下注射，用于镇痛</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>立体定位对准系统</td><td>KOPF</td><td>1900</td><td></td></tr><tr><td>无菌 27 号针头</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签（Solon）</td><td>AMD Medicom</td><td>56200</td><td></td></tr><tr><td>无菌尼龙缝线（5.0）</td><td>Oasis</td><td>MV-661</td><td>使用不可吸收缝线关闭伤口</td></tr><tr><td>无菌锐利剪刀&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>无菌外科刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>外科手套（腈类）</td><td>Ammex</td><td>N/A</td><td>如怀疑污染，应更换手套</td></tr><tr><td>托盘</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

渗透压微型泵植入法用于提高小鼠脑脊液中的葡萄糖浓度

Osmotic Minipump Implantation for Increasing Glucose Concentration in Mouse Cerebrospinal Fluid

糖尿病会增加认知功能下降的风险，并损害大脑功能。高血糖与认知缺陷之间是否存在因果关系，目前尚不明确。此外，这些缺陷是否由脑脊液（CSF）和/或血液中葡萄糖水平升高所介导，同样尚不清楚。由于现有的糖尿病模型尚不足以回答此类研究问题，因此极少有研究探讨高脑脊液葡萄糖水平对中枢神经系统（CNS）功能，尤其是学习与记忆功能的直接影响。本文介绍了一种通过在小鼠侧脑室内使用渗透压微泵持续输注葡萄糖，从而在4周内长期升高脑脊液葡萄糖水平的方法。该方案通过检测脑脊液中的葡萄糖浓度进行了验证。在以0.25 µL/h流速输注50%葡萄糖溶液后，脑脊液葡萄糖水平升至约328 mg/dL，而接受人工脑脊液（aCSF）的小鼠脑脊液葡萄糖浓度约为56 mg/dL。此外，该方案对血糖水平无影响。因此，该方法可用于独立于血糖变化，研究高脑脊液葡萄糖对脑功能或特定神经通路的直接作用。总体而言，本文所述方法将有助于建立动物模型，以检验高脑脊液葡萄糖在介导阿尔茨海默病和/或糖尿病相关其他神经退行性疾病特征中的作用。

雄性小鼠被植入与渗透压微型泵连接的导管（图 1)以持续向其侧脑室灌注人工脑脊液（aCSF）或50%葡萄糖溶液（图2手术后10天采集脑脊液（CSF）。图3) 以验证该操作的有效性。结果显示，输注50%葡萄糖的小鼠脑脊液葡萄糖水平（平均值：327.7 mg/dL）高于输注aCSF的小鼠（平均值：56.5 mg/dL）。与对照组同窝小鼠相比，实验组小鼠脑脊液葡萄糖水平约升高了六倍（图 4A各组之间的血糖水平无差异（图4B).
<img alt="渗透泵装置，包含管路、套管和用于启动实验分析的流量调节器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65169/65169fi...

本文介绍了一种提高小鼠脑脊液（CSF）中葡萄糖浓度的详细实验方案。该方法可用于研究高脑脊液葡萄糖水平对小鼠神经退行性病变、认知功能及外周葡萄糖代谢的影响。

糖尿病会增加认知功能下降的风险，并损害大脑功能。高血糖与认知缺陷之间是否存在关联……

该技术可在不影响小鼠血糖浓度的情况下提高其脑脊液（CSF）中的葡萄糖水平，有助于研究高脑脊液葡萄糖水平对动物脑功能的直接作用。该方法可用于建立动物模型，以探索脑脊液葡萄糖水平升高在认知功能障碍中的病理生理作用。从而发现新的分子靶点以改善认知功能。该方法还将有助于确定小鼠脑脊液中高葡萄糖水平是否足以介导神经退行性疾病的表型。必须注意导管装置的正确组装与预处理，以及将导管在正确坐标位置插入脑内。开始进行渗透压微型泵植入手术时，将麻醉后的小鼠置于立体定位仪上。将动物头部固定于门齿杆上。用鼻罩覆盖小鼠鼻部以维持麻醉，并以每分钟1.5%至2%的浓度向鼻罩输送异氟烷。在小鼠身下放置加热垫以维持其体温。消毒手术区域后，切开并用刮匙暴露颅骨表面，并用棉签擦拭可能存在的血液。若出血较多，使用电凝器止血。用浸有3%过氧化氢的棉签擦拭，以暴露颅骨缝。在显微镜下操作时，注意观察前囟和后囟以确定颅骨坐标。将前囟处的所有坐标设为零。使用电动钻在前囟后方0.5毫米、中线右侧1毫米的位置小心钻孔，注意不要损伤硬脑膜。插入止血钳，轻轻开合以形成用于微型泵的囊袋。从流量调节器的尖端握住泵，将其通过切开的皮肤推入已创建的囊袋中。在导管底面涂抹少量胶水，并将其固定在导管固定器中。确保导管无堵塞，溶液流动正常。然后将导管缓慢穿过钻孔，深入至颅骨表面腹侧两毫米处。至少留置五分钟，以使胶水充分固化。使用剪刀剪断套管顶端，确保其不会从颅骨表面移位。用一层牙科水泥覆盖套管以提供额外支撑。采集脑脊液（Cerebrospinal Fluid 或 CSF）时，将适当麻醉的小鼠置于立体定位仪上。如先前所示，将头部固定在框架上后，旋转旋钮以倾斜头部，使鼻部朝下。消毒手术区域并做切口后，移除小鼠身体的支撑物，让小鼠垂直放置，使颈部充分向背侧伸展。使用弯头钝性镊子，从后颈部中线轻轻分离肌肉，形成一个小窗口。然后使用湿润的棉签轻轻将颈部肌肉从中线向外围移开。观察小脑延髓池是否暴露为一个具有透明硬脑膜的三角形区域。将显微操作器组件放置在靠近小鼠的立体定位仪框架上，同时确保毛细管尖端不接触任何表面。轻轻折断毛细管尖端，同时不干扰装置。旋转显微操作仪上相应的旋钮，缓慢调整并对准，将毛细管尖端移向小脑延髓池。当毛细管尖端接触小脑延髓池膜时，会感受到一定阻力。非常缓慢地借助旋钮将尖端抵住膜，注意不要损伤膜中的任何血管。当膜被刺穿后，由于毛细管负压的作用，脑脊液会立即流入毛细管中。保持装置静置数分钟，直至毛细管中收集约10微升脑脊液。小心地将毛细管从注射器上取下，并连接到微毛细管吸头加样器上。按压吸头，将脑脊液转移到无菌的微量离心管中。将支撑物置于小鼠下方，旋转立体定位仪的旋钮以调平头部。使用尼龙缝线关闭伤口。在将小鼠移出仪器前，皮下注射300 µL无菌生理盐水。术后对动物进行护理，直至术后约7至10天拆线。术后10天采集的脑脊液显示，与脑脊液输注组小鼠相比，50%葡萄糖输注组小鼠的葡萄糖水平升高约6倍。然而，两组之间的血糖水平无显著差异。在将套管插入脑内时，应将其回撤并检查是否有脑脊液从孔中流出。正确识别小脑延髓池并防止脑脊液被血液污染也至关重要。该技术还可用于递送任何无法穿过血脑屏障的药物，以检测其对脑功能的影响。目前可用于糖尿病研究的动物模型数量极为有限，且这些模型会干扰外周环境中的葡萄糖稳态。然而，该模型有助于研究葡萄糖调节对神经功能的脑特异性变化。

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渗透压微型泵植入增加小鼠脑脊液中葡萄糖浓度

随着神经科学研究日益深入，对脑结构和神经回路的探究需要更高的精确度和分辨率。我们开发了一种利用尖端直径为50微米的硼硅酸盐微导管制备和植入脑内慢性输注系统的方法。...

用于持续递送神经活性物质的微型输注系统的构建与植入

开发了一种微流控胰岛灌注装置，用于评估多个胰岛的动态胰岛素分泌，同时进行钙离子内流和线粒体膜电位变化的荧光成像。...

一种用于微流控灌注装置的多参数胰岛灌注系统

在本视频中，我们演示了微型渗透泵脑部输注系统的组装，以及其在小鼠颅骨中的手术植入。该系统可实现潜在药物的持续递送，有助于研究这些药物对脑组织及脑功能的影响。...

小鼠模型中的连续给药系统：在小鼠脑内植入微型渗透泵给药系统的外科手术操作，用于实现持续药物递送

本视频展示了持续向小鼠脑内输注药物对血糖水平的影响。通过采集禁食小鼠尾部的血液，测定口服葡萄糖给药前后血糖水平，以评估葡萄糖代谢情况。通过向小鼠注射胰岛素并在特定时间间隔记录血糖水平，以评估胰岛素耐受性。...

评估持续向小鼠脑内输注药物对周围血糖水平的影响

来源：Wang, X. et. al.，基于渗透泵的药物递送用于中枢神经系统体内再髓鞘化研究。J. Vis. Exp.

基于渗透泵的神经治疗药物递送在脱髓鞘小鼠模型中的应用

通过从成年小鼠特定脑区分离神经元，并利用荧光膜电位染料成像技术，可研究成年小鼠单个神经元的活动。通过检测神经元对葡萄糖浓度变化的反应，该技术可用于研究成年小鼠腹内侧下丘脑神经元对葡萄糖的敏感性。...

成年小鼠腹内侧下丘脑神经元膜电位染料成像用于研究葡萄糖感应

为了研究病理条件下大脑的重组，我们使用微型渗透泵将蛋白质直接递送至大脑，从而绕过血脑屏障。随后注射示踪剂，以研究在该蛋白质影响下大脑连接性的改变。...

在病理生理条件下研究大脑重组的微型渗透泵植入与示踪剂递送

本方案通过使用微型渗透泵脑内灌注系统将拮抗剂MetCCL5递送至小鼠脑内，研究趋化因子（C-C模体）配体5（CCL5）在下丘脑中的作用。这种对CCL5活性的短暂抑制会中断下丘脑胰岛素信号传导，导致葡萄糖耐受不良和外周系统性胰岛素敏感性下降。...

利用小鼠脑部连续药物输注系统研究下丘脑胰岛素信号对周围性葡萄糖耐受不良的影响

通过植入渗透泵长期给予异丙肾上腺素已被广泛用于模拟小鼠的晚期心力衰竭。本文中，我们详细描述了微型泵植入手术的方法，以实现连续3周的异丙肾上腺素给药，以及通过超声心动图评估模型成功建立的方法。...

植入异丙肾上腺素微型泵以诱导小鼠心力衰竭

我们提供了一种通过将导管植入基底神经节和小脑并连接至渗透压泵，以建立药理学DYT/PARK-ATP1A3肌张力障碍小鼠模型的实验方案。本文描述了通过施加运动刺激诱导类肌张力障碍样运动，并利用行为评分系统对表型进行特征分析的方法。...

植入渗透压泵并诱导应激以建立症状性药理学小鼠模型用于 DYT/PARK-ATP1A3 肌张力障碍研究

脱髓鞘现象发生在多种中枢神经系统疾病中。体内药物递送技术的可靠性对于促进髓鞘再生药物的测试至关重要。本方案描述了一种基于渗透泵的方法，可实现药物直接向脑实质的长期递送，提高药物的生物利用度，在髓鞘再生研究中具有广泛的应用前景。...

基于渗透泵的药物递送 在体实验 中枢神经系统髓鞘再生研究

了解渗透压微型泵植入技术，通过立体定位手术在小鼠脑脊液中特异性升高葡萄糖浓度而不影响血糖水平。该方法为研究神经退行性疾病和认知功能障碍提供了重要的动物模型。

渗透压微型泵植入法用于提高小鼠脑脊液中的葡萄糖浓度

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