Name: 斯普拉格道利大鼠脂肪组织间充质干细胞的分离和鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 了解从斯普拉格道利大鼠脂肪组织中分离和鉴定间充质干细胞的方法，用于胰腺再生和糖尿病治疗研究。该技术为细胞治疗策略提供了重要的实验基础。

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作者感谢墨西哥社会保障研究所（IMSS）、墨西哥费德里科·戈麦斯儿童医院（HIMFG）以及IMSS研究协调部门动物实验中心工作人员对本项目提供的支持。感谢国家科学与技术委员会提供的AOC（815290）奖学金，以及安东尼奥·杜阿尔特·雷耶斯在音视频资料方面提供的技术支持。

所有实验操作均遵循墨西哥动物护理指南，该指南基于国际实验动物护理评估与认证协会的建议（墨西哥官方标准 NOM-062-200-1999，墨西哥）。本方案已提交并获得卫生研究伦理委员会的审查、批准和注册&#160;墨西哥社会保险研究所（R-2021-785-092）
1. 通过手术切除法去除大鼠的脂肪组织
<ol>
	<li>准备两个锥形管，每管加入20 mL无菌1×磷酸盐缓冲液-抗生素-抗真菌溶液（1×PBS，庆大霉素[20 µg/mL]，两性霉素[0.5 µg/mL]），置于冰上保存。</li>
	<li>选择两只成年雄性Sprague Dawley大鼠 （挪威褐鼠）&#160;健康状况良好。确保大鼠年龄在3至4个月之间，体重为350-450 g。</li>
	<li>以20 mg/kg的盐酸赛拉嗪进行镇静，5分钟后，腹腔注射120 mg/kg的盐酸氯胺酮进行麻醉。&#160;用眼膏润滑双眼&#160;以防止干燥。然后，&#160;通过脚趾反射消失确认麻醉深度。&#160;</li>
	<li>剃除腹部和腹股沟区域的毛发，并用碘溶液消毒。&#160;使用手术巾以维持无菌环境。然后，从胸骨至睾丸区域做一正中纵向切口。</li>
	<li>用无菌镊子去除附着在附睾和肾脏周围的脂肪组织，并置于1x PBS-AA溶液中。将样品置于冰上保存。</li>
	<li>缝合切口 若需要则关闭&#160;的&#160;机构指南&#160;以40 mg/kg的戊巴比妥钠经心内注射处死动物。确认死亡后，处理尸体&#160;随后&#160;机构程序 
	注意：死亡&#160;引发&#160;影响免疫表型、分化能力的信号机制&#160;间充质细胞的旁分泌效应。因此，&#160;在实施安乐死前进行组织采集。&#160;</li>
</ol>
2. 从脂肪组织中分离间充质细胞
<ol>
	<li>在生物安全柜内使用无菌镊子去除脂肪组织，并将其置于直径100 mm培养皿中的无菌滤纸上，以吸收多余的PBS。</li>
	<li>将脂肪组织转移至另一个培养皿中，使用10 mL移液器加入10 mL 1× PBS-AA溶液，洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>使用剪刀和解剖刀将组织机械性地切碎成约1 cm2大小的片段。</li>
	<li>在20 mL未添加补充物的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中配制IV型胶原酶（0.075%），经0.22 µm注射器滤器过滤后，置于37 °C环境中保温备用。</li>
	<li>将步骤2.4中配制的胶原酶溶液（20 mL）加入含有组织碎片和磁力搅拌子的烧杯中，密封容器后于37 °C下缓慢持续振荡孵育。 
	注意：酶消化过程约需90分钟（保持缓慢搅拌以维持细胞膜完整性）。</li>
	<li>将消化后的匀浆液通过置于100 mm培养皿上的不锈钢40目（孔径0.38 mm）滤网过滤，收集细胞悬液至无菌50 mL锥形离心管中。</li>
	<li>加入20 mL预热的含补充物DMEM培养基（含10%胎牛血清[FBS]、2 mM谷氨酰胺、2 mM丙酮酸钠、100×非必需氨基酸溶液和100×抗生素-抗真菌溶液[AA]），轻轻悬浮基质血管组分（SVE）。</li>
	<li>将细胞悬液在290 × g条件下离心10分钟，用25 mL移液器弃去上清液，再用40 mL未添加补充物的DMEM培养基轻柔洗涤细胞一次。</li>
	<li>重复此步骤一次。每次操作之间更换新的无菌锥形离心管，以尽量减少细胞碎片和脂肪残留的转移。</li>
	<li>用5 mL移液器将细胞沉淀重悬于5 mL含补充物的DMEM培养基中，转移至T-25 cm2培养瓶，于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
	<li>次日，用5 mL预热的1× PBS-AA溶液洗涤3次，再用未添加补充物的DMEM洗涤2次，以去除细胞碎片和非贴壁细胞。用5 mL移液器加入5 mL新鲜预热的含补充物DMEM培养基，并每3–4天更换一次培养基。</li>
</ol>
3. ASC 原代培养物的维持与扩增
<ol>
	<li>当细胞达到 90%–100% 汇合度（8 ± 2 天）时，用 5 mL 未添加补充物的 DMEM 洗涤两次。加入 1 mL 预热的 0.025% 胰蛋白酶-2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），在 37 °C 下孵育 5–7 分钟。</li>
	<li>当细胞单层脱落时，加入 4 mL 添加补充物的 DMEM，并轻轻吹打使细胞悬浮液分散均匀。</li>
	<li>将细胞悬浮液转移至 15&#160;mL 锥形离心管中，加入 5 mL 预热的添加补充物的 DMEM，轻轻混匀以使细胞重悬均匀。</li>
	<li>在 290 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 mL 添加补充物的 DMEM 轻轻重悬细胞沉淀。经台盼蓝染色后，使用血细胞计数板（Neubauer 计数室）进行细胞计数。</li>
	<li>最后，以 1:4 的传代比例，在 T-75 培养瓶中以 2.5&#160;× 103 个细胞/cm2 的密度接种细胞。此步骤可确保克隆形成及高增殖率。</li>
</ol>
4. ASC 原代培养物的形态学表征
<ol>
	<li>在倒置显微镜下观察ASCs的形态。 
	注意：在进行组织学制片和ASC鉴定之前，需用1%明胶溶液处理盖玻片，并用紫外线照射15分钟。
	<ol>
		<li>将盖玻片从70%乙醇溶液中取出，室温下晾干5分钟。</li>
		<li>将盖玻片浸入无菌的1%明胶溶液中，沥干后于室温（RT）下干燥。</li>
		<li>将每片盖玻片放入6孔板的各个孔中，并用紫外线照射15分钟。</li>
		<li>在孔中央接种含有25 × 103个细胞的液滴，静置1分钟后加入1 mL含补充物的DMEM培养基。在37 °C、5% CO2条件下孵育96小时。</li>
		<li>移除培养基，使用移液管以1× PBS-AA溶液洗涤三次。</li>
		<li>向每个孔中加入1 mL 3.5%中性甲醛溶液，在室温下孵育1小时。小心移除甲醛溶液，再向每个孔中加入1 mL冷的70%乙醇。</li>
		<li>用封口膜密封培养板，防止干燥，待后续使用。 
		注意：ASCs的细胞形态也可通过不同传代阶段的苏木精-伊红染色进行评估。</li>
		<li>从各孔中移除70%乙醇，用蒸馏水水化细胞5分钟。同时，过滤染色液。</li>
		<li>移除水后，在轻柔振荡条件下用Harris苏木精染色液染色15分钟。</li>
		<li>移除染色液，用1× PBS洗涤两次。</li>
		<li>在轻柔振荡条件下用伊红染色液染色1分钟，随后移除染色液并用1× PBS洗涤两次。</li>
		<li>小心地从各孔中取出盖玻片，将其置于一滴PBS-甘油封片剂（体积比1:1）上进行封片。</li>
		<li>在盖玻片周围涂一圈指甲油，然后在光学显微镜下观察组织学切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 通过免疫荧光检测ASCs的表达标志物
<ol>
	<li>配制含1× PBS-0.05% Tween 20的洗涤缓冲液。在室温下轻轻振荡洗涤，每孔加入2 mL缓冲液，共洗涤3次（每次孵育3分钟）。</li>
	<li>每孔加入1 mL封闭试剂（1:10稀释），在轻微振荡条件下孵育20分钟。</li>
	<li>向每孔加入200 µL以下一抗（1:50稀释）：CD9（单克隆小鼠来源）、CD34（多克隆兔来源）和抗CD63（多克隆山羊来源），于4 °C过夜孵育。</li>
	<li>再次洗涤3次，每孔加入200 µL以下二抗（1:50稀释）：FITC标记的山羊抗小鼠IgG、DyeLight 550标记的驴抗山羊IgG，以及Cy3标记的山羊抗兔IgG。</li>
	<li>用1× PBS-0.05% Tween 20洗涤3次，每孔加入100 µL DRAQ-7（将17 µL DRAQ-7溶于1 mL双蒸水中，稀释比例为17 µL/mL），避光孵育20分钟以复染细胞核。</li>
	<li>再洗涤3次，按照步骤4.1.12–4.1.13进行封片。样品避光冷冻保存，直至使用。</li>
	<li>使用适合该设备的设置和推荐软件，通过倒置荧光共聚焦显微镜观察样品。</li>
</ol>
6. 通过流式细胞术检测 ASCs 的表达标志物
<ol>
	<li>将经胰酶消化或冻存复苏的细胞（传代3或4代）调整为单细胞悬液，浓度为1 × 106 个细胞/mL的1×PBS-5% FBS溶液。取100 µL含10万个细胞的悬液分装至1.5 mL离心管中。留一份未标记的样品作为自发荧光对照。</li>
	<li>根据生产商说明书，向其余样品中加入适量的Anti-CD105 AF-594和Anti-CD31 AF-680抗体。4 °C避光孵育20分钟。</li>
	<li>加入1 mL 1×PBS-5% FBS洗涤未结合的染料，250 × g离心5分钟，弃上清，沉淀用300 µL 1%甲醛溶液重悬。</li>
	<li>在流式细胞仪上进行样本检测。细胞设门策略基于FSC-A vs. SSC-A设门，再通过SSC-H vs. SSC-A圈选单细胞，随后进行FSC-A vs. FSC-H分析。</li>
	<li>CD105 AF-594使用Y610-mCherry-A检测器，CD31 AF-680使用R660-APC-A检测器。</li>
</ol>
7. ASCs 向脂肪生成谱系的分化
<ol>
	<li>在6孔板中，接种1 x 104 细胞（P-4）/厘米2 并在37 °C、5% CO₂条件下孵育2，直至细胞融合度达到60%-80%（约72-96小时）。诱导分化时，直接向培养基中添加：4 µM 胰岛素、1 µM 地塞米松21-乙酸酯（Dxa）和0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（MIX）。每2-3天更换一次分化培养基。</li>
	<li>配制800 µM胰岛素储备液：将20 µL 1 N HCl加入2 mL无菌超纯水中，确保胰岛素完全溶解，储存于-20 °C。取已按1:100稀释的胰岛素储备液10 µL，每孔以2 mL终体积加入10 µL。</li>
	<li>配制1 mM Dxa的储备液：将Dxa溶于5 mL无菌超纯水中（注意：不会完全溶解），4 °C保存。每孔加入40 µL Dxa储备液的1:4稀释液。</li>
	<li>在2.5 mL 0.1 N NaOH中配制100 mM MIX储备液，涡旋混匀，再加入40 µL 1 N NaOH以确保完全溶解。于-70 °C保存。每孔加入10 µL MIX储备液。</li>
	<li>使用0.22 µm无菌注射器滤器过滤储备液，然后储存。</li>
	<li>第12天，用1×PBS洗涤细胞3次，加入500 µL 4%甲醛溶液，室温孵育1 h。用蒸馏水洗涤每孔2次，再用60%异丙醇处理5 min，然后晾干。</li>
	<li>加入用60%异丙醇稀释的0.5%油红O溶液（每孔500 µL），室温孵育20分钟。用1 mL蒸馏水洗涤三次，在倒置显微镜下观察。 
	注意：有关所需的试剂、仪器和材料，请参见文末列表 材料表.</li>
</ol>

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

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<li>Maumus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+human+adipose+stromal+cells%3A+localization%2C+morphology%2C+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype.</a> International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).</li>
<li>Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+primary+isolation+and+culture+of+adipose-derived+stem+cells+and+their+phenotypic+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Alexandria+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile.</a> Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).</li>
<li>He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+mesenchymal+stem+cells+from+rat+bone+marrow+and+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue.</a> Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

自发现间充质干细胞（MSCs）以来的近四十年中，多个研究团队已描述了从不同组织和物种中获取MSCs的方法。使用大鼠作为动物模型的优势之一在于其易于饲养、发育迅速，并且易于从脂肪组织中获取MSCs。已有研究报道了多种获取脂肪间充质干细胞（ASCs）的组织来源，包括内脏脂肪、肾周脂肪、附睾脂肪和皮下脂肪12,13,14,15,16。
关于本研究所采用的提取方法，作者建议大鼠体重应控制在350–450 g之间，该体重范围可在出生后前4个月内达到。当动物体重在450–600 g、年龄不超过8个月时，每只大鼠的脂肪组织量（5.5 ± 2.1；均值 ± 标准差）更高；然而，脂肪间充质干细胞（ASCs）的数量并未相应增加（数据未显示）。这些观察结果与González<sup...

间充质干细胞（MSCs）因其强大的自我更新、增殖、迁移以及向不同细胞谱系分化的能力，对再生医学产生了深远影响1,2。目前，大量研究正聚焦于其在多种疾病治疗与诊断中的潜在应用。
间充质细胞的来源多种多样，包括骨髓、骨骼肌、羊水、毛囊、胎盘和脂肪组织等。这些细胞可从不同物种中获得，包括人类、小鼠、大鼠、狗和马3。多年来，骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）一直是再生医学中干细胞的主要来源，也是胚胎干细胞应用的一种替代选择4。然而，脂肪组织来源的间充质干细胞（ASCs），即脂肪源性干细胞，因其易于采集和分离，以及每克脂肪组织可获得较高的细胞产量，已成为一种具有显著优势的重要替代来源5,6。据报道，ASCs的收获率通常高于BMSCs7。最初认为ASCs的修复/再生能力源于其向其他细胞谱系分化的潜能8。然而，近年来的研究进一步强调了ASCs释放的旁分泌因子在其修复潜力中的主导作用9,10。
脂肪组织（AT）除了作为能量储备外，还与内分泌系统、神经系统和心血管系统相互作用。它还参与出生后的生长发育、组织稳态的维持、组织修复及再生过程。脂肪组织由脂肪细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、前脂肪细胞以及ASCs构成。其中，ASCs由于具有较低的免疫原性，在再生医学中发挥着重要作用11,12。ASCs可通过酶消化结合机械处理法或脂肪组织外植块法获得。ASCs的原代培养易于维持、生长和扩增。对ASCs进行表型表征至关重要，可通过免疫荧光和流式细胞术等方法检测特定膜表面标志物的表达，以确认细胞身份13。国际脂肪治疗与科学联合会（IFATS）和国际细胞治疗学会（ISCT）规定，ASCs应表达CD73、CD90和CD105，而不表达CD11b、CD14、CD19、CD45和HLA-DR14。因此，这些阳性与阴性标志物被公认为ASCs表征的可靠依据。
本项目旨在描述一种从大鼠脂肪组织（AT）中分离和鉴定成体间充质细胞的方法，因为与胚胎干细胞不同，这种细胞来源不存在伦理问题。由于获取方便且相较于骨髓来源的干细胞更具微创性，该方法成为一种可行的选择。
来源于该组织的间充质细胞因其免疫调节能力和较低的免疫排斥反应，在再生医学中具有重要作用。因此，本研究是未来探索其分泌组及其在包括糖尿病等代谢性疾病在内的多种疾病中作为再生治疗应用的基础性工作。

<table><tbody><tr><td>两性霉素B</td><td>HyClone</td><td>SV30078.01</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Sartorius</td><td>AX224</td><td></td></tr><tr><td>抗CD9抗体（C-4）</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-13118</td><td></td></tr><tr><td>抗CD34抗体（C-18）</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-7045</td><td></td></tr><tr><td>抗C63抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-5275</td><td></td></tr><tr><td>抗内皮糖蛋白/CD105（P3D1）Alexa Fluor 594</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18838A594</td><td></td></tr><tr><td>抗CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18916AF680</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）Cy3抗体</td><td>Novus</td><td>NB 120-6939</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊IgG（H+L）DyLight 550抗体</td><td>Invitrogen</td><td>SA5-10087</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠IgG FITC标记的山羊F(ab&amp;acute;)抗体</td><td>RD Systems.</td><td>No. F103B</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶滤器（无菌）</td><td>CORNING</td><td>10718003</td><td></td></tr><tr><td>细胞与组织培养瓶</td><td>BIOFIL</td><td>170718-312B</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪：带细胞计数板载玻片的Bright-Line血细胞计数板</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板：6孔板带盖</td><td>CORNING</td><td>25810</td><td></td></tr><tr><td>离心管（锥形）</td><td>HeTTICH</td><td>ROTANA460R</td><td></td></tr><tr><td>离心管（Eppendorf管）</td><td>Fischer Scientific</td><td>M0018242_44797</td><td></td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白</td><td>Worthington</td><td>LS004186</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>SPL Life Science</td><td>43112</td><td></td></tr><tr><td>培养管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>191180</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert 2.0</td><td>Beckman Coulter</td><td>免费版本</td><td></td></tr><tr><td>CytoFlex LX流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>FLOW-2463VID03.17</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>DraQ7染料</td><td>Thermo Sc.</td><td>D15106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>伊红黄</td><td>Hycel</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>96%乙醇</td><td>Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon管（15 mL）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Falcon管（50 mL）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>128111163</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>GIBCO</td><td>15750045</td><td></td></tr><tr><td>甘油（高纯度）</td><td>Herschi Trading</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>AMRESCO</td><td>0701-25G</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Sc.</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮宠物（盐酸氯胺酮）</td><td>Aranda</td><td>SV057430</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>GIBCO/ Thermo Sc.</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LSM软件 Zen 2009 V5.5</td><td></td><td>免费版本</td><td></td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td>NuAire</td><td>12082100801</td><td></td></tr><tr><td>荧光倒置显微镜</td><td>Zeiss Axiovert 100M</td><td>21.0028.001</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus CK40</td><td>CK40-G100</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸（100倍浓缩）</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（2 mL）</td><td>Sarstedt</td><td>72695400</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL）</td><td>Sarstedt</td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>移液器（0.2–2 &amp;mu;L）</td><td>Finnpipette</td><td>E97743</td><td></td></tr><tr><td>移液器（2–20 &amp;mu;L）</td><td>Finnpipette</td><td>F54167</td><td></td></tr><tr><td>移液器（20–200 &amp;mu;L）</td><td>Finnpipette</td><td>G32419</td><td></td></tr><tr><td>移液器（100–1000 &amp;mu;L）</td><td>Finnpipette</td><td>FJ39895</td><td></td></tr><tr><td>液氮罐</td><td>Taylor-Wharton</td><td>681-021-06</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>SLBC3029V</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>GIBCO/ Thermo Sc.</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用培养皿</td><td>CORNING Inc</td><td>480167</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Axygen Scientific</td><td>301-03-201</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠（Pisabental）</td><td>PISA Agropecuaria</td><td>Q-7833-215</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>J.T.Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>J.T Baker</td><td>2139900</td><td></td></tr><tr><td>S1移液器辅助器</td><td>Thermo Sc</td><td>9531</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（5 mL）</td><td>PYREX</td><td>L010005</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（10 mL）</td><td>PYREX</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>J.T Baker</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>J.T.Baker</td><td>15368426</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>J.T Baker</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>GIBCO BRL</td><td>11840-048</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器（无菌）</td><td>CORNING</td><td>431222</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>PerkinElmer Lambda 25</td><td>L6020060</td><td></td></tr><tr><td>培养板振荡器</td><td>LAB-LINE</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Samco/Thermo Sc</td><td>728NL</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染色液</td><td>GIBCO</td><td>1198566</td><td></td></tr><tr><td>猪胰蛋白酶</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>102H0234</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>通用封闭试剂（10倍浓缩）</td><td>BioGenex</td><td>HK085-GP</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪2%（盐酸赛拉嗪）</td><td>Pet&amp;#39;s Pharma</td><td>Q-7972-025</td><td></td></tr></tbody></table>

分离与鉴定源自sprague dawley大鼠脂肪组织的间充质干细胞

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

近年来，成体间充质细胞彻底改变了分子与细胞生物学领域。除了具有强大的自我更新、迁移和增殖能力外，它们还能分化为多种特化的细胞类型。脂肪组织是间充质细胞最易获取且侵入性最小的来源之一。已有报道表明，与其他来源相比，脂肪组织不仅能获得更高的细胞产量，还具有更优越的免疫调节特性。近期，已有多种从不同组织来源和动物物种中获取成体间充质细胞的方法被发表。在评估部分研究者所采用的标准后，我们建立了一种适用于多种用途且易于重复的标准方法。通过收集肾周和附睾周围脂肪组织的基质血管组分（SVF），我们成功建立了形态和功能均理想的原代细胞培养体系。细胞在接种后24小时即可见贴附于塑料培养表面，呈现成纤维细胞样形态，具有突起并倾向于形成集落。采用流式细胞术（FC）和免疫荧光（IF）技术检测了细胞膜标志物CD105、CD9、CD63、CD31和CD34的表达情况。此外，还通过诱导因子混合物（4 µM 胰岛素、0.5 mM 3-甲基-异丁基-黄嘌呤和1 µM 地塞米松）评估了脂肪源性干细胞（ASCs）向脂肪细胞谱系分化的潜能。诱导48小时后，细胞逐渐失去成纤维细胞样形态；至第12天，油红染色证实脂滴形成。综上所述，本研究提出了一种可获得形态良好且功能完整的ASC培养物的操作流程，适用于再生医学领域的应用。

脂肪组织取自3至4月龄、体重为401 ± 41 g（几何平均值 ± 标准差）的成年Sprague Dawley大鼠。在15次实验提取分析中，附睾脂肪和肾周脂肪组织的平均质量为3.8 g。培养24小时后，细胞群体仍贴附于塑料表面，并呈现异质性形态。首次传代在培养8 ± 2天后进行，在总共八次实验中，细胞收获量为1.4 ± 0.6 × 106 个。通过明场直接观察（图1）和苏木精-伊红染色（图2）可在光学显微镜下进行形态学表征。细胞可见广泛的细胞质，具有细长的突起和丰富的细胞内微丝，这是间充质基质细胞的典型特征。
在不同次级传代（1、3、7 和 9 代）中，通过间接免疫荧光法特异性地可视化检测到 ASCs 表达的表面标志物（图 3）。在所有检测的次级传代中，ASCs 对 CD9 表面标志物的阳性率均为 100%。该百分比是基于在五个随机选取的显微照片中计数的总细胞数中阳性细胞所占的比例。...

本方案描述了一种从Sprague Dawley大鼠中分离和鉴定脂肪组织来源的间充质干细胞（MSCs）的方法。

分离与鉴定源自Sprague Dawley大鼠脂肪组织的间充质干细胞

成体间充质细胞在近几十年来彻底改变了分子与细胞生物学。它们可分化为多种特化的细胞类型，在……

间充质干细胞由于其旁分泌功能，在细胞通讯中具有非常广泛的作用。本方案获得的脂肪来源间充质干细胞具有形态学、免疫表型及足够的功能特性，可用于胰腺再生和糖尿病治疗研究。近年来，细胞疗法在糖尿病治疗中的应用日益增多。这些疗法包括异体胰腺细胞移植、自体干细胞分化的胰岛素生成细胞产物，以及利用生物墨水进行3D打印的胰腺组织。大多数研究主要关注分泌组分及其在调控不同细胞过程中的作用。微阵列和新一代测序等新技术可用于研究miRNA的功能。该领域的一个挑战是实现对间充质细胞更强效的刺激，达到分泌组中精确的分子组成，并将其导向特定疾病的治疗。我们将评估miRNA如何促进暴露于氧化应激下的胰腺组织退化。本研究将涉及使用脂肪组织来源的干细胞。

isolation-identification-mesenchymal-stem-cells-derived-from-adipose

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

斯普拉格道利大鼠脂肪组织间充质干细胞的分离和鉴定

本视频展示了一种从小鼠主动脉弓周围脂肪组织中分离和培养荧光标记的神经嵴来源脂肪干细胞（ADSCs）的技术。分离后，通过荧光激活细胞分选技术检测并分选NCADSCs，随后将其接种于培养板中进行培养，以促进细胞增殖。...

从小鼠主动脉周围脂肪组织中分离脂肪来源的干细胞

本方案描述了一种通过酶消化、密度梯度分离、贴壁筛选以及CD146+磁珠分选技术，从大鼠中分离获取原代肺组织驻留型间充质基质细胞的方法。...

从大鼠肺组织中分离CD146+ 驻留型肺间充质基质细胞

本方案描述了从猪皮下脂肪组织中分离猪脂肪源性干细胞（pADSC）并检测其多向分化潜能的方法。这种具有多向分化潜能的pADSC可用于阐明脂肪细胞分化过程，并研究其向中胚层间充质或其他外胚层和内胚层谱系细胞的转分化，以用于再生医学研究。...

从猪皮下脂肪组织中分离与分化脂肪源性干细胞

本方案提供了一种无需使用酶消化的方法，通过组织块法从腹部整形术和吸脂术样本中分离间充质干细胞。该方法避免了剧烈的酶处理或离心步骤，所获得的干细胞更符合临床应用需求，可用于体外研究或重新返回临床应用。...

一种无需酶解法分离与扩增人脂肪源性间充质干细胞的方法

本文中，我们描述了采用酶消化法分离恒河猴来源的脂肪源性干细胞（ADSCs）的实验步骤。接下来，介绍了ADSC的增殖过程，包括细胞消化、计数和接种。最后，描述了使用特异性成脂诱导剂诱导ADSC分化的方法。此外，我们还介绍了用于确认分化的染色技术。...

恒河猴脂肪源性干细胞的分离、增殖与分化

脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）可能是分化为胰岛素生成细胞（IPCs）的一种潜在MSC来源。在本方案中，我们提供了分离和鉴定大鼠附睾Ad-MSCs的详细步骤，随后采用一种简单、快速的方案，由相同的大鼠Ad-MSCs诱导生成IPCs。...

分离大鼠脂肪组织间充质干细胞并诱导其分化为胰岛素生成细胞

脂肪组织是间充质干细胞的优良来源。本文详细介绍了从小鼠附睾脂肪组织中分离、培养和鉴定脂肪组织来源干细胞（ADSCs）的逐步操作方法。...

从小鼠附睾脂肪组织中分离、体外扩增及表征间充质干细胞

在此，我们介绍一种高效分离脂肪来源干细胞和脂肪细胞的标准方法，其特征在于...

高效分离猪脂肪组织来源的间充质干细胞和脂肪细胞

本方案描述了在不使用动物血清的情况下，分离并随后扩增间充质基质细胞和内皮集落形成细胞，以生成用于实验性移植的自体配对细胞。...

人脐带来源的间充质基质细胞（MSCs）和内皮集落形成祖细胞（ECFCs）的分离及无动物血清扩增

从大鼠股骨和胫骨中分离出MSCs，并通过磁性细胞分选进行富集。通过流式细胞术确认分选细胞表面标志物的表达。这些细胞还在克隆密度下培养以形成单个克隆，然后使用克隆环分离这些克隆。...

大鼠间充质干细胞（MSCs）的分离与富集及单克隆来源MSCs的分离

了解从斯普拉格道利大鼠脂肪组织中分离和鉴定间充质干细胞的方法，用于胰腺再生和糖尿病治疗研究。该技术为细胞治疗策略提供了重要的实验基础。

分离与鉴定源自Sprague Dawley大鼠脂肪组织的间充质干细胞

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