Name: 小鼠新生儿脑的显微CT成像和形态分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 学习使用显微CT结合卢戈氏液对小鼠新生儿脑进行高分辨率成像和三维形态分析的方法。该技术可精确量化脑结构发育，为发育神经科学研究提供可靠的数据支持。

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感谢 Wei Liu 提供的技术支持。本工作由 ANPCyT PICT 2017-2497 和 PICT 2018-4113 项目资助。

所有实验操作均遵循加拿大动物护理委员会的指南。
1. 样品采集与制备
<ol>
	<li>配制 500 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液。
	<ol>
		<li>在通风柜内的通风橱中，将 20 g PFA 粉末加入装有 250 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）的 1 L 玻璃烧杯中。将烧杯置于磁力搅拌器上，并放入搅拌子。</li>
		<li>边加热边搅拌。使用温度计持续监测溶液温度，确保温度低于 60 °C。</li>
		<li>用塑料巴斯德吸管向溶液中逐滴加入 1 M NaOH，以溶解 PFA。待 PFA 粉末完全溶解后，将溶液冷却至室温（RT）。</li>
		<li>用 1×PBS 定容至 500 mL。用塑料巴斯德吸管逐滴加入 1 M HCl，调节 pH 至 7.2–7.3。</li>
		<li>使用滤纸和玻璃漏斗，将溶液过滤至 1 L 玻璃瓶中。</li>
		<li>盖紧玻璃瓶，从通风柜中取出，于 -4 °C 冰箱中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集脑组织样本。
	<ol>
		<li>为获取样本，在出生后次日早晨（出生后 0.5 天，P 0.5）处死新生小鼠，使用手术剪进行断头。</li>
		<li>固定小鼠身体，将手术剪插入新生鼠颈部，进行一次干净利落的剪切。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 PFA 固定样本。
	<ol>
		<li>在 50 mL 锥形管中加入 40 mL 的 4% PFA。</li>
		<li>将每个头部浸入含 PFA 的锥形管中进行固定。操作时可使用帕顿刮匙或小勺。</li>
		<li>将锥形管置于 -4 °C 冰箱中固定 48 小时，随后更换为含 0.1% 叠氮化钠作为防腐剂的 40 mL 1×PBS 溶液，并继续在 -4 °C 冰箱中保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品染色
<ol>
	<li>配制卢戈氏碘液（3.75% w/v）。
	<ol>
		<li>在通风柜内的通风条件下，于1 L玻璃烧杯中，将10 g碘化钾（KI）和5 g碘单质（I2）溶于400 mL蒸馏水中，使用磁力搅拌器持续搅拌至溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每个样本头部浸入含有40 mL卢戈氏碘液的50 mL锥形管中。
	<ol>
		<li>对于体重大约为1.3 g的新生个体，使用旋转摇床持续振荡处理15–20小时。</li>
		<li>扫描前，将样本转移至含有10 mL 1%琼脂糖的15 mL锥形管中，静置30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 微型计算机断层扫描
注意：微型计算机断层扫描（micro-CT）需要特定设备。此类扫描仪有多种选择，采集参数的具体设置取决于所用设备的特性。Hallgrímsson 博士的实验室配备了多种可选的微型CT扫描仪。本方案基于一种基本的台式扫描仪，这是全球许多实验室中较为普及的小动物成像设备之一。如果扫描目标为颅骨，请跳过本方案第2节中的步骤，直接进入第3节。完成颅骨扫描后，可对同一标本进行染色处理并扫描脑组织，以同时获得该标本的脑和颅骨图像。
<ol>
	<li>将样品放入微计算机断层扫描（micro-CT）样品 holder 中。
	<ol>
		<li>将样品放入一个 50 mL 锥形管中。固定样品以防止在扫描过程中发生移动。为此，可使用一些聚氨酯材料填充管中的空余部分。</li>
		<li>打开设备，将装有样品的锥形管放入 micro-CT 的样品 holder 中。</li>
		<li>登录 micro-CT 控制面板并注册待扫描的样品。系统将自动生成一个样品编号。除编号外，还需填写 &#34;名称&#34;字段。样品名称和编号均应另行记录（例如在电子表格中），以便日后需要时重新获取原始数据。</li>
		<li>启动扫描程序。输入样品名称或编号，并选择一个 Control 文件，该文件应包含扫描参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描样品。
	<ol>
		<li>在 micro-CT 软件界面上设置以下参数：各向同性体素尺寸为 0.012 mm，45 kVp，177 µA，积分时间为 800,000 ms，每 180° 采集 500 个投影。</li>
		<li>通过选择 Scout View 来设定扫描区域。参考图像出现后，点击 Reference Line 以设定区域。将实心绿色线移动至样品边缘，然后按住 Shift 键并拖动光标，将扫描区域延伸至样品的另一边缘。</li>
		<li>点击 OK 开始扫描。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估并导出扫描结果。
	<ol>
		<li>打开 micro-CT 扫描仪的评估程序，点击 Select Sample 和 Measurement。在 Filter 字段中输入样品名称，选择相应的样品及其测量文件。</li>
		<li>文件将以切片形式加载，切片数量取决于初始扫描范围。点击 Load All 按钮，以加载所有切片，便于后续在不同切片间切换浏览。</li>
		<li>选择 Tasks &#62; Evaluation 3D ，以在切片周围初始化一个裁剪框。此时将弹出一个 3D 评估对话框，包含多个字段，如 Task/Evaluation, VOI (感兴趣体积), Start X, Y, Z 和 Dimension X, Y, Z。</li>
		<li>将 Task &#62; Evaluation 3D 字段设置为适当的脚本，因为可执行多种评估任务，例如重建、分割、形态计量学分析（如骨密度测量）以及文件转换或传输。可参考 Default Evaluation 脚本进行设置。</li>
		<li>选择脚本后，在主图像上调整 VOI 框。从第一张切片开始，确保该框包含需要评估的解剖结构。通过右键单击框边缘附近的小白色方块来移动 VOI，使用鼠标中键调整其大小；或者直接在 Dimension 字段中以数值方式调整。</li>
		<li>使用图像下方的滚动条浏览整个样品，确保所有解剖结构均已被包含在 VOI 框内。点击软件左上角附近的 XY、XZ 或 YZ 按钮以切换视图方向。</li>
		<li>点击 Start Evaluation。根据所选的任务评估脚本，系统将生成一个带有相应 .txt 头文件的 3D .aim 图像文件。此外，可在脚本中指定路径，通过文件传输协议（FTP）将图像传输至特定位置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 图像处理
<ol>
	<li>在图像处理软件中打开图像。 
	注意：图像处理可使用多种软件完成。本方案包含一种广泛应用的商业软件中的基本步骤，该软件在相关领域被广泛接受，并提供用于基础和高级处理的多功能工具。此外，重建的微计算机断层扫描（micro-CT）图像有多种可接受的格式。此方面通常取决于采集所用设备及其配套软件。本文中图像处理使用 .bmp 格式图像。相同流程也可应用于 .tiff 图像及其他类型。由于采集是在默认格式为 .aim 的扫描仪上进行的，因此首先介绍从 .aim 转换为 .bmp 的方法。
	<ol>
		<li>要打开 .aim 文件，请选择 文件 &#62; 打开数据 并选择相应文件。随后将弹出标题为“文件格式选择”的窗口。选择 原始数据。</li>
		<li>将弹出标题为“原始数据参数”的窗口。在此窗口中，根据每个 .aim 文件生成的头文件（.txt）中的信息填写参数。对于 数据类型，若头文件中“图像数据起始字节偏移量”后有具体数值，则选择 16 位。同时，使用头文件（.txt）中的信息设置图像尺寸和体素大小。参数填写完成后，点击 确定。</li>
		<li>如需将 .aim 转换为 .bmp，请在 主面板 &#62; 项目视图 中右键单击 .aim 对象，选择 转换 &#62; 转换图像类型。在 属性 中，将 输出类型 设置为 8 位，然后选择 应用。</li>
		<li>右键单击新生成的 8 位对象，选择 另存为，选择 .bmp 格式并保存。</li>
		<li>要打开 .bmp 文件，请选择 文件 &#62; 打开数据 并选择相应文件。随后将弹出图像参数窗口。确认参数无误后点击接受。</li>
		<li>在 主面板 &#62; 项目视图 中，将创建一个以 .bmp 文件命名的新对象。右键单击该对象并选择 正交切片。在 属性 中，选择要查看的切片编号和方向平面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取完整头部的三维体积。
	<ol>
		<li>在 主面板 &#62; 项目视图 中右键单击图像对象，选择 交互式阈值分割选项 &#62; 创建。在 属性 中，调整 最小 RGB 和 最大 RGB 的值，直到选中对应动物头部的图像区域，然后选择 应用。</li>
		<li>在 主面板 &#62; 项目视图 中将创建一个经过阈值分割的对象。右键单击该对象，在 属性 中选择 等值面。在 属性 中选择一个阈值以可视化表面，然后点击 应用。该阈值需通过经验确定，可能需要尝试多个不同值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数字化点坐标
	<ol>
		<li>三维点坐标既可基于切片，也可基于提取的表面进行数字化。对于第一种方法，右键单击图像选项并选择 切片。在 平移 中选择轴向平面上所需的切片。如果平面未正确放置，可在 属性 中点击 选项 &#62; 旋转 以确定正确的方向。</li>
		<li>要数字化标志点，右键单击 主面板 &#62; 项目视图，选择 创建对象 &#62; 点 和 线 &#62; 标志点。右键单击新生成的 标志点对象，选择 标志点视图。在 标志点视图 中，于 大小 处修改点的尺寸。在 编辑模式 下，使用 添加 选项在 属性 中添加标志点。 
		注意：对于新生儿，已有研究发表了一组围绕脑部轴向和矢状曲线的标志点和半标志点14。</li>
		<li>首先，选择穿过嗅球最前端点和大脑皮层最后端点的轴向平面。</li>
		<li>选择 标志点对象，在 属性 中选择 标志点编辑器。使用箭头点击需要数字化的点位。</li>
		<li>在建议的标志点集中，共在选定的轴向平面上数字化 24 个点。第一个点应位于脑部中线的最后端点。</li>
		<li>在曲线上等距数字化五个点（半标志点），直至到达中脑与皮层交界处的下一个标志点。</li>
		<li>随后，在大脑皮层周围数字化八个点（半标志点）。</li>
		<li>在皮层与嗅球交界处数字化一个新的标志点，然后在嗅球周围数字化四个点（半标志点）。</li>
		<li>在嗅球最前端点的中线上数字化一个新的标志点，然后在两个嗅球之间数字化两个点（半标志点）。</li>
		<li>在嗅球最后端点的中线上数字化一个新的标志点。</li>
		<li>对于矢状方向的点，建立一个位于脑右侧的旁矢状切片，选择脑部向后最突出的位置。</li>
		<li>在建议的标志点集中，共在选定的旁矢状平面上数字化 33 个点。第一个点位于间脑与后脑的交界处，随后在脑腹侧边界数字化九个点（半标志点）。</li>
		<li>在嗅球最前端点处数字化一个新的标志点，然后在嗅球周围数字化三个点（半标志点）。</li>
		<li>在嗅球与皮层交界处数字化一个新的标志点，然后在嗅球周围数字化三个点（半标志点）。</li>
		<li>在嗅球与皮层交界处数字化一个新的标志点，然后在皮层周围数字化七个点（半标志点）。</li>
		<li>在皮层与中脑交界处数字化一个新的标志点，然后在皮层周围数字化七个点（半标志点）。</li>
		<li>在皮层与中脑交界处数字化一个新的标志点，然后在中脑周围数字化六个点（半标志点）。</li>
		<li>在中脑与小脑交界处数字化一个新的标志点，然后在小脑周围数字化两个点（半标志点）。</li>
		<li>在小脑与后脑交界处数字化一个新的标志点。</li>
		<li>保存已数字化的点。右键单击 标志点对象，选择 保存数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析点坐标。 
	注意：当一组样本的点坐标完成数字化后，可使用几何形态测量学工具进行基本分析，以获得大小（重心大小）和形状变量（形状或普氏坐标）。分析在一种免费开源的软件环境中进行，该环境特别适用于统计分析。
	<ol>
		<li>使用记事本构建一个包含所有已数字化样本坐标的文件。为此，请遵循 TPS 格式，具体说明见&#160;https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm。</li>
		<li>打开统计软件。选择 文件 &#62; 更改目录，选择保存 .tps 文件的目录。</li>
		<li>选择 包 &#62; 安装包。选择一个 CRAN 镜像。查找 geomorph 并安装。</li>
		<li>在控制台中输入以下命令以加载包：library(geomorph) 和 library(Morpho)。</li>
		<li>在控制台中输入以下命令以加载数据集：dataset &#60;- readland.tps(file=&#34;NAME_OF_FILE.tps&#34;, specID=&#34;ID&#34;)。</li>
		<li>在控制台中输入以下命令执行广义普氏分析：GPA&#60;- gpagen(dataset)。</li>
		<li>在控制台中输入以下命令获取重心大小：CS&#60;-GPA$Csize。</li>
		<li>在控制台中输入以下命令获取普氏坐标：ProcCoord&#60;- GPA$coords。</li>
		<li>在控制台中输入以下命令绘制普氏坐标和平均形状：plotAllSpecimens(ProcCoord)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感兴趣区域（ROI）的分割 
	注意：为分割脑组织并获得三维重建，需在每一切片中手动识别脑组织。相同流程也可用于特定感兴趣区域（ROI），例如嗅球、皮层等。
	<ol>
		<li>右键单击 主面板 &#62; 项目视图，选择 创建对象 &#62; 标签场。</li>
		<li>选中 标签场 对象，在 属性 中点击 分割编辑器 选项。</li>
		<li>在 材料 中添加一种新材料，如有需要，可将其重命名为“Brain”。</li>
		<li>在 选择 中选择 当前切片 选项，以在每一切片中分割对应脑组织的区域。</li>
		<li>使用 工具 中提供的选项，在每一切片中选择脑组织。本案例中，魔棒 和 画笔 工具最为适用。</li>
		<li>完成每一切片的选择后，在 选择 中点击 添加。</li>
		<li>当所有切片的选择完成后，返回 主面板 中的 项目视图，右键单击 标签场，选择 生成表面，然后点击 应用。</li>
		<li>获得表面后，通过应用 提取表面 将其导出。</li>
		<li>为获取分割结构的体积，在 主面板 &#62; 项目视图 中选择包含标签的对象，右键单击，选择 测量 和 分析 &#62; 体积分数，然后点击 应用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Mouse Neonatal Brain Micro-CT Scanning and Image Processing

<ol><li>Altman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+skeletal+growth%2C+modeling%2C+and+remodeling+by+in+vivo+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography.</a> Bone. 81, 370-379 (2015).</li>
<li>Wehrle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+characterization+of+fracture+healing+patterns+and+assessment+of+biomaterials+by+time-lapsed+in+vivo+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8660(2021).</li>
<li>Arístide, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+shape+convergence+in+the+adaptive+radiation+of+New+World+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).</li>
<li>Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+hyperossification+expands+skull+diversity+in+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).</li>
<li>de Crespigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+micro-CT+imaging+of+the+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">3D micro-CT imaging of the postmortem brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).</li>
<li>Gignac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+iodine-based+contrast-enhanced+computed+tomography+%28diceCT%29%3A+an+emerging+tool+for+rapid%2C+high-resolution%2C+3-D+imaging+of+metazoan+soft+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues.</a> Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).</li>
<li>Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+mouse+embryo+atlas+based+on+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT.</a> Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).</li>
<li>Gonzalez, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+protein+restriction+in+mice+impacts+placental+function+and+maternal+body+weight+before+fetal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth.</a> PLoS One. 11 (3), 0152227(2016).</li>
<li>Watanabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+endocasts+good+proxies+for+brain+size+and+shape+in+archosaurs+throughout+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny.</a> Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).</li>
<li>Gignac, P. M., Kley, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+diceCT+imaging+for+high-throughput+comparative+neuroanatomical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies.</a> Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).</li>
<li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+rapid+imaging+of+adult+mouse+brains+with+microCT+using+iodine-based+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast.</a> PLoS One. 10 (11), e0142974(2015).</li>
<li>Gignac, P. M., O'Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+imaging+of+the+rat+brain+using+an+integrated+diceCT+and+histology+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow.</a> Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).</li>
<li>Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+stabilization+of+tissue+for+embryo+phenotyping+using+micro-CT+with+iodine+staining%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining.</a> PLoS One. 8 (12), e84321(2013).</li>
<li>Barbeito-Andrés, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+Zika+syndrome+is+associated+with+maternal+protein+malnutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition.</a> Science Advances. 6 (2), (2020).</li>
<li>Handschuh, S., Glösmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+phenotyping+using+X-ray+microCT%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184(2022).</li>
<li>Turnbull, D. H., Mori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+in+mouse+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">MRI in mouse developmental biology.</a> NMR in Biomedicine. 20 (3), 265-274 (2007).</li>
<li>Qiu, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+MRI+shows+brain+areas+relatively+larger+in+males+emerge+before+those+larger+in+females%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females.</a> Nature Communications. 9, 2615(2018).</li>
<li>Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+phenotyping+of+genetically+altered+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MRI phenotyping of genetically altered mice.</a> Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).</li>
<li>Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+growth+hormone+on+the+ontogenetic+allometry+of+craniofacial+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones.</a> Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+developmental+biology%3A+a+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li>
<li>Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+specimen+shrinkage+in+iodine-enhanced+microCT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT.</a> Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).</li>
<li>Dawood, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+soft-tissue+shrinkage+artefacts+caused+by+staining+with+Lugol%27s+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol's solution.</a> Scientific Reports. 11, 19781(2021).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

本研究介绍了一种使用微计算机断层扫描（micro-CT）结合对比剂扫描小鼠新生脑组织的简明实验方案。此外，还包括获取定性和定量结果的简单操作步骤。基于这些方法，可进一步开展其他替代性或互补性分析。
如实验方案所示，微计算机断层扫描（micro-CT）图像可通过多种方式进行分析。在之前的研究中，本课题组通过对点坐标进行数字化，并应用几何形态测量技术，估算了小鼠围产期大脑的大小和形状变异8,14。坐标的数字化还可用于通过简单的欧氏距离估算获取线性测量数据。这些数据结合来自脑组织和感兴趣区域（ROI）分割所得到的体积，可为传统形态学评估提供有价值的输入参数。
尽管本文所述方案易于应用于 离体 小样本（如我们所使用的样本）不适用 体内 研究，由于固定尤其是使用卢戈氏液作为对比剂并不可行，因此采用显微CT成像 体内，通常用于硬组织检查<sup class='xref'...

微型计算机断层扫描（micro-CT）成像技术是多个研究领域中的重要工具。在生物学中，由于矿化组织对X射线具有吸收特性，该技术特别适用于骨组织研究。基于这一特点，研究人员已利用micro-CT探讨了骨发育1、骨代谢2以及骨的进化3,4等多个科学问题。2008年，de Crespigny 等人5证明，使用碘作为对比剂可获得成年小鼠和兔脑的micro-CT图像。这项研究拓展了该成像技术的新应用，因为碘的使用使得原本对X射线不敏感的软组织也能被成像。因此，将micro-CT与碘基对比剂结合的主要目标是获得高分辨率图像，从而在中观或宏观解剖学水平上区分并识别软组织结构。
该技术在需要对小型标本（如小鼠胚胎）进行详细离体（ex vivo）表型表征的研究中具有显著潜力，而小鼠胚胎在实验设计中被广泛使用6。碘染色结合显微CT成像已被用于获取器官的体积定量数据7以及关键的三维（3D）结构信息8,9。近年来，染色样本的显微CT扫描已被应用于描述啮齿类动物脑部的表型特征10，并提出了对该技术的多种改进方法。对于成年动物脑组织，研究发现采用先经水凝胶灌注、再浸入碘溶液48小时的方案可获得高质量图像11。Gignac 等人12进一步拓展了该技术的应用范围，证明经碘染色的大鼠脑组织仍可用于常规组织学技术处理。类似地，这些方法在胚胎期及断奶前啮齿类动物脑组织中也显示出良好的应用前景8,13,14,15。
尽管神经科学在很大程度上采用基于显微镜的技术来评估脑发育的不同结构和功能特征，但此类研究更适用于表征特定的细胞群体或空间范围有限的结构。相比之下，显微CT成像能够描述完整的结构，并获取保留重要空间信息的三维模型，从而与显微技术形成互补。磁共振成像（MRI）同样是用于探索小型动物结构特征的标准技术。16,17,18然而，采用对比剂的显微CT在以下两个方面具有主要优势 离体 固定样本：微型CT扫描仪的成本通常较低，操作简便，且空间分辨率高于MRI12.
本研究旨在描述利用卢戈氏碘液（一种含碘对比剂）染色后，通过显微CT扫描获取新生小鼠脑部高分辨率图像的操作流程。本文提供了一套完整的实验方案，涵盖样本采集与组织固定的前期步骤，以及后续的染色、显微CT图像采集和常规图像处理。图像处理包括对整个头部及脑组织的三维体积进行分割，并选取特定解剖平面以数字化坐标点，这些坐标点可进一步用于形态测量分析。尽管本研究重点为新生小鼠脑组织，但类似策略亦可应用于其他软组织。因此，本方案具有良好的灵活性，仅需少量调整即可推广至其他类型的样本。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;&amp;micro;CT 35</td><td>Scanco Medical AG</td><td></td><td>请注意，Scanco 不再提供&amp;nbsp; &amp;micro;CT 35。其目前最小的扫描仪为&amp;nbsp; &amp;micro;CT 45&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Avizo</td><td>Visualization Sciences Group, VSG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>拉普拉塔国立大学兽医学院动物饲养中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>锥形管</td><td>Daigger</td><td>CH-CI4610-1856</td><td></td></tr><tr><td>通风柜</td><td>Esco</td><td>AC2-458&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>玻璃烧杯&amp;nbsp;</td><td>Glassco</td><td>GL-229.202.10</td><td></td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td>Simax</td><td>CFB017</td><td></td></tr><tr><td>玻璃漏斗</td><td>HDA</td><td>VI1108</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carlo Erba</td><td>403872</td><td>操作时应在通风柜内进行，并使用个人防护装备（口罩、护目镜和手套）</td></tr><tr><td>I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Cicarelli</td><td>804211</td><td>配制 I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;KI 时，应在通风柜内操作，并使用个人防护装备（口罩、护目镜和手套）</td></tr><tr><td>KI</td><td>Cicarelli</td><td>PA131542.1210</td><td>配制 I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;KI 时，应在通风柜内操作，并使用个人防护装备（口罩、护目镜和手套）</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Arcano</td><td>4925</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Cicarelli</td><td>1580110</td><td>操作时应在通风柜内进行，并使用个人防护装备（口罩、护目镜和手套）</td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Biomint</td><td>BM021</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>Biopack</td><td>2000959400</td><td>操作时应在通风柜内进行，并使用个人防护装备（口罩、护目镜和手套）</td></tr><tr><td>帕顿刮勺</td><td>Glassco</td><td>GL-377.303.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biopack</td><td>2000988800</td><td></td></tr><tr><td>塑料巴斯德吸管</td><td>Daigger</td><td>9153</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>R Project</td><td></td><td>本实验方案中使用了 R 的 geomorph 软件包（https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html）</td></tr><tr><td>剪刀&amp;nbsp;</td><td>Belmed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Biopack</td><td>2000163500</td><td></td></tr><tr><td>温度计</td><td>Daigger</td><td>7650</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠新生脑组织的显微ct成像与形态计量学分析

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

神经影像学是利用动物模型研究脑形态的重要工具。磁共振成像（MRI）已成为软组织研究的标准方法，但其空间分辨率较低，限制了在小型动物中的应用。本文介绍了一种利用显微计算机断层扫描（micro-CT）获取新生小鼠脑和颅骨高分辨率三维（3D）信息的实验方案。该方案包括样本解剖、脑组织染色与扫描，以及对整个器官和感兴趣区域（ROIs）进行形态测量的全部步骤。图像分析涵盖结构分割和坐标点的数字化处理。综上所述，本研究证明，将显微CT与卢戈氏碘液（Lugol's solution）作为对比剂结合使用，是成像小型动物围产期脑组织的一种可行替代方法。该成像流程可广泛应用于发育生物学、生物医学及其他关注遗传和环境因素对脑发育影响的科学研究领域。

本文介绍了一种获取新生小鼠脑部高分辨率图像的基本实验方案。将头部浸入卢戈氏液后进行扫描。尽管样本体积较小，但主要的脑部解剖结构，如嗅球、大脑皮层、中脑、小脑和后脑，均可清晰分辨（图1）。
可以利用这些图像作为输入进行多种分析。在两个不同的解剖平面上对一组标志点和半标志点进行了数字化。如图2所示，这些点被放置在选定平面上脑组织边界的各个位置。完成数字化后，可从一个.txt文件中读取这些点的坐标（图3）。点的数字化目的在于获取可用于几何形态测量分析的原始坐标数据。本方案以单个样本为例进行说明，而形态测量分析适用于更大的样本量，但使用相同点集所得的结果已在其他文献中报道14。
最后，全脑手动分割的结果是一个脑部的三维模型（图4）。对于这些体积数据，可...

本研究介绍了通过结合微型计算机断层扫描（micro-CT）与对比剂获取新生小鼠脑部高分辨率图像的步骤 离体 样本。我们描述了用于量化这些图像中脑大小和形状的基本形态测量分析方法。

小鼠新生脑组织的显微CT成像与形态计量学分析

神经影像学是利用动物模型研究脑形态的重要工具。磁共振成像（MRI）已成为该领域的标准技术。

在实验神经科学中，特别是针对发育相关问题的研究，对胚胎期和围产期样本的大脑进行定量表征具有重要意义。结合常用对比剂的显微计算机断层扫描技术能够生成高分辨率图像，适用于进一步的形态测量分析。由于矿化组织对X射线的吸收特性，显微计算机断层扫描已应用于不成熟心脏组织的研究，类似于其在骨组织中的应用。然而，在过去几十年中，卢戈氏液作为对比剂的应用提升了该新兴技术在软组织研究中的使用价值。本方案结合了该领域常用的操作步骤与工具，展示了显微计算机断层扫描在研究小型动物产前大脑方面的巨大潜力。本方案的优势在于精确呈现从样本制备到形态测量数据处理的完整流程。由微型计算机断层扫描获得的图像能够保留特殊信息，而这些信息采用标准组织学技术难以获取。此外，与磁共振成像相比，使用对比剂的微型计算机断层扫描具有两项优势：扫描设备成本较低、操作简便，并且能够实现更高的空间分辨率。本方案经过细微调整后，可适用于固定来自不同物种的多种器官样本，进而解决一系列科学问题。由于造影剂通过浸渍方式施加，主要限制因素应为样本尺寸，但其潜在应用前景极为广阔。首先，用40毫升4%多聚甲醛填充50毫升锥形管，使用玻棒或勺子将刚断头的新生动物头部浸入其中。将锥形管置于负4摄氏度环境中固定48小时。随后将头部转移至含有0.1%叠氮化钠的40毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，并继续将样本置于冷藏条件下保存。染色时，将每个样本头部浸入含有40毫升卢戈氏碘液的50毫升锥形管中，在恒定振荡条件下于摇床中孵育15至20小时。扫描前，将染色后的样本置于含有10毫升1%琼脂糖溶液的15毫升离心管中，静置30分钟。操作开始时，启动图像处理软件，选择“文件”，然后打开数据，并选取先前获得的以BMP格式保存的显微CT扫描图像。当图像读取参数窗口打开时，确认参数，若正确则接受。在主面板中，单击项目视图以找到以BMP文件名创建的新对象。右键单击该对象，选择正交切片（ortho slice）选项。然后点击“创建”。在属性中，选择方向平面和切片编号以进行查看。要在主面板中获得完整头部的3D体积图像，请进入项目视图，右键单击图像对象，选择“交互式阈值分割”选项，然后点击“创建”。在属性中，调整最小阈值 RGB 和最大阈值 RGB 的数值，直到图像中对应动物头部的区域被选中为止。然后选择应用。在项目视图下创建的阈值对象上单击右键。在属性中，选择等值面。选择一个阈值以可视化表面，然后点击应用。要数字化标记点，请在项目视图中单击鼠标右键，选择创建对象，然后依次选择点和线，接着选择标记点。然后单击“创建”。接着右键单击新对象的标记点，选择标记点视图并单击“创建”。在“大小”选项下，修改点的尺寸。在编辑模式下，若要在属性中添加标记点，请选择“添加”。在曲线上均匀数字化五个点，直至中脑皮层交界处的下一个标记点。然后在皮层周围数字化八个半标记点。要保存数字化的点，请右键单击对象上的解剖标志点并选择保存数据。要分割脑部结构，请在项目视图中右键单击，然后选择创建对象。选择图像和区域，随后标记该区域。单击“创建”。选择标签字段对象，然后在属性中按下分割编辑器选项。在“材料”下，添加一种新材料并将其重命名为脑组织。在“选择”中，选择当前切片以分割每幅切片中对应于脑组织的区域。在“工具”中，使用魔棒工具和画笔工具选择每幅切片中的脑组织。然后在“选择”中点击“添加”。现在，返回项目视图，右键单击标签字段并选择生成表面。然后点击应用。获得表面后，应用提取表面功能以导出该表面。通过微型CT扫描，尽管新生小鼠大脑体积较小，但仍可区分其解剖结构，如嗅球、大脑皮层、中脑、小脑和后脑。对全脑进行手动分割后，成功重建了新生小鼠大脑的三维模型。

micro-ct-imaging-and-morphometric-analysis-of-mouse-neonatal-brains

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

小鼠新生儿脑的显微CT成像和形态分析

来源： Choi, J. P. et al. 小鼠模型中脑海绵状血管畸形的诱导与显微CT成像。J. Vis. Exp.

小鼠脑内脑海绵状血管畸形病变的增强对比微计算机断层成像

来源： Mizuno, H., et al. In Vivo 新生小鼠皮层神经元的双光子成像. J. Vis. Exp.

双光子显微镜用于成像小鼠幼崽的神经元形态

本文中，我们详细描述了以高分辨率重建荧光标记小鼠大脑精细脑解剖结构的完整实验流程。所述方案包括样本制备与透明化处理、成像用样本的装载、数据后处理以及多尺度可视化。...

利用共聚焦光片显微镜对整只小鼠大脑进行微米级分辨率光学断层成像

本方案展示了在小鼠模型中诱导脑海绵状血管畸形疾病，并利用对比增强微计算机断层扫描技术测量病灶负荷。该方法提高了现有小鼠模型的价值，可用于研究脑海绵状血管畸形及其他脑血管疾病的分子基础和潜在治疗方法。...

小鼠模型中脑海绵状血管畸形的诱导与微计算机断层成像

本文介绍一种用于小鼠脑组织透明化、荧光标记及大规模成像的实验流程，该方法可实现新皮层中细胞类型三维空间组织结构的可视化。...

小鼠新皮层细胞组织的大规模三维成像

体内双光子成像技术在新生小鼠皮层神经元中的应用

本文介绍了一种制备小型动物脑组织以进行显微CT成像的简便方法，该方法可在全脑背景下高精度地量化损伤并定位电极。...

一种基于显微CT的小动物脑部病变表征与电极定位方法

透射电子显微镜与宫内转导相结合是一种研究神经系统发育过程中精细超微结构形态变化的有力方法。这种联合技术能够深入揭示神经可塑性相关结构细节的变化及其拓扑表征。...

子宫内转导发育期小鼠脑和脊髓后超微结构神经可塑性参数的评估

本方案描述了使用iDISCO+对完整小鼠脑组织进行磁共振成像、透明化处理和免疫标记的方法，随后详细介绍了利用光片显微镜进行成像，以及使用NuMorph进行后续分析的步骤。...

利用MRI、组织透明化和光片显微镜对完整新生小鼠脑进行全脑单细胞成像与分析

本文深入描述了一种基于显微计算机断层扫描技术的方法，用于对小鼠颅面骨进行三维模型的分割与测量，相较于现有方法，可更准确地评估小鼠颅面骨的发育情况。...

利用三维显微计算机断层扫描分析小鼠颅颌面畸形

学习使用显微CT结合卢戈氏液对小鼠新生儿脑进行高分辨率成像和三维形态分析的方法。该技术可精确量化脑结构发育，为发育神经科学研究提供可靠的数据支持。

小鼠新生脑组织的显微CT成像与形态计量学分析

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