Name: 测量哺乳动物线粒体功能的氧非依赖性测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: 学习使用高分辨质谱和稳定同位素示踪技术测量哺乳动物细胞线粒体功能的方法。该方案可在缺氧条件下评估延胡索酸作为替代电子受体的代谢机制。

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本文中生成的图示使用 BioRender.com 制作。我们感谢 Amy Walker 为本文提供的反馈意见。J.B.S. 的研究得到了伍斯特生物医学研究基金会资助的支持。

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

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作者声明无任何利益冲突。

随着新兴研究证明哺乳动物线粒体可以在不消耗分子氧的情况下发挥功能，研究人员迫切需要采用多种正交检测方法，而不仅限于氧消耗率（OCR）测量，以准确量化线粒体功能。本文汇总了一系列可直接评估复合物I、复合物II、复合物V以及二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）活性的检测方法，这些方法通过测量线粒体内的NAD+/NADH平衡、适应性末端电子受体的利用、ATP的生成、从头嘧啶生物合成以及线粒体来源的活性氧（ROS）来实现功能评估。值得注意的是，这些检测方法相较于OCR测量能更直接地反映线粒体功能。此外，这些方法为研究人员提供了切实可行的手段，用于量化缺氧条件下的线粒体功能——在此条件下，由于延胡索酸被优先用作末端电子受体，OCR测量基本不再适用。最后，本文所述基于细胞增殖的检测方法比传统的呼吸测定实验更具成本效益，因而为在哺乳动物系统中研究线粒体功能提供了一种广泛可及的途径。
在利用这些检测方法测定培养细胞中线粒体功能时，有一些关键因素需要考虑。关于增殖检测，重要的是根据每种细胞系的倍增速率调整接种的细胞数量。细胞接种密度应至少达到10%汇合度，并留有足够空间，使其能够进行三到四次倍增，以便量化增殖差异。每种检测方法的另一个考虑因素是用作各电子传递链（ETC）复合物活性对照的小分子化合物的浓度。由于不同细胞系对这些抑制剂的敏感性可能不同，因此必须测试这些小分子的剂量，以确定其最佳浓度。
研究线粒体功能的检测方法普遍存在局限性 体外，包括OCR测定及本文所述所有检测，是培养基的代谢成分。标准细胞培养基往往会使系统产生线粒体功能表面性升高的偏差。例如，超生理浓度的谷氨酰胺会增强其对三羧酸循环的回补作用25，这会促进线粒体NADH的合成，从而增加氧化磷酸化。类似地，氧气的分压范围在3 mmHg至100 mmHg之间（约0.1%–13% O₂）。2）在哺乳动物组织中较低，而在大气中较高（140 mmHg，约21%） 体外26,27。这种过量的O2 最大化线粒体呼吸能力和超氧化物产生28近年来，研究人员致力于设计出更具生理性的培养基29,30值得注意的是，在模拟人血浆的培养基中培养细胞会降低某些癌细胞系的线粒体呼吸作用30T细胞中的线粒体活性氧31以及线粒体对癌症治疗药物的适应性变化32因此，必须注意所用培养基的成分，并了解其可能对线粒体功能产生的影响。
解释线粒体功能时另一个重要且普遍的局限性在于线粒体数量可能存在差异。因此，必须通过定量线粒体DNA（mtDNA）33、使用膜电位不敏感性染料测定线粒体质量34，或对线粒体标志物进行蛋白质印迹（western blotting）来测量线粒体含量。这一对照至关重要，以避免将线粒体数量的减少误判为线粒体功能的下降。
此处所述的检测方法也存在特定的局限性和注意事项。首先，由于分化后的细胞不再增殖，基于增殖的检测方法将不适用于评估此类细胞中的线粒体功能。使用13C4-天冬氨酸示踪法测定DHODH活性的一个关键局限性在于，细胞对天冬氨酸的摄取效率可能极低35。为克服这一潜在局限，研究人员可过表达天冬氨酸转运蛋白SLC1A3，以促进13C4-天冬氨酸的摄取35。
使用13C5-谷氨酰胺示踪法测定琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的一个局限性在于，该检测方法依赖细胞通过还原性羧化途径富集M+3同位素异构体，以测量其逆向活性。某些细胞系由于ATP柠檬酸裂解酶表达水平较低36，缺氧诱导因子（HIF）稳定性不足37，或α-酮戊二酸与柠檬酸的比例过低38，无法产生还原性羧化通量。为克服这一局限，可采用13C4-天冬氨酸示踪法来同时测定SDH的正向与逆向活性7。在此检测中，SDH的正向活性可通过延胡索酸M+2与琥珀酸M+2的比值来衡量，而逆向反应则通过琥珀酸M+4与延胡索酸M+4的比值来评估。值得注意的是，该示踪策略绕过了还原性羧化途径中的大部分酶促步骤。
使用DCPIP还原作为检测指标的复合物I活性测定法存在一个局限性，即线粒体并非结构完整。为使线粒体在测定中能够摄取NADH而进行的冻融处理，必然会损害线粒体膜的结构完整性39。该测定应与复合物I增殖测定等其他测定方法平行进行，以确保所观察到的复合物I活性变化在结构完整的&#160;细胞中同样成立。
在今后的研究中，其中一些技术可被改进用于测量线粒体功能 体内 使用小鼠等模式生物 秀丽隐杆线虫 测量线粒体功能的现有方法 体内 以生物体水平的耗氧率（OCR）为核心，特别是在使用小鼠模型时的呼吸交换率。该方法的一个明显局限在于，氧气在生物体内的作用远不止作为线粒体电子传递链（ETC）中普遍存在的末端电子受体。例如，氧气还参与多种生物化学反应和信号传导功能。 &#34;消耗&#34; 由双加氧酶家族酶的催化活性所介导。尽管这些酶参与细胞耗氧速率，但并不参与、调控或反映线粒体功能。经典的呼吸测定实验 体外 通常用于对照 &#34;非线粒体耗氧率&#34;而生物体的呼吸交换率（RER）实验无法对此进行控制，限制了将RER作为线粒体功能指标的解释能力 在体内 然而，可以通过调整方案来检测DHODH活性&#160;13C4-天冬氨酸示踪，通过复合体II活性&#160;13C5-谷氨酰胺示踪、利用组织中纯化的线粒体测定复合物I活性，以及使用适合液相色谱-质谱联用的化合物（如MitoB）检测线粒体活性氧，以评估线粒体功能 体内这些用于检测线粒体功能的直接检测方法，结合经典的呼吸测定实验，为研究人员提供了对哺乳动物细胞和组织中线粒体功能更全面、更准确的评估。

线粒体功能是衡量细胞健康的关键指标，因为它维持着哺乳动物细胞中重要的生物合成、生物能量和信号传导功能1。绝大多数线粒体功能依赖于电子传递链（ETC）中的电子传递，而ETC中电子传递的障碍会导致严重的线粒体疾病2。ETC由一系列嵌入线粒体内膜的氧化还原（redox）反应组成，这些电子转移反应释放的自由能可用于驱动ATP合成、产热等生理过程、de novo嘧啶生物合成等生物合成途径，以及NADH等辅因子氧化还原状态的平衡。ETC复合物I和&#160;III会产生活性氧（ROS）3,4,5，进而调控HIF、PI3K、NRF2、NFκB和MAPK等关键信号通路6。因此，ETC中电子传递的测量指标通常被用作评估哺乳动物细胞线粒体功能的替代参数。
呼吸测定实验常用于测量哺乳动物细胞中的线粒体功能。由于O2 是哺乳动物电子传递链（ETC）中最普遍的末端电子受体，其还原程度常被用作评估线粒体功能的指标。然而，越来越多的证据表明，哺乳动物线粒体可利用延胡索酸作为电子受体，以维持依赖电子传递链的功能，包括 从头合成 嘧啶生物合成7，NADH 氧化7以及硫化氢的解毒8因此，在某些情况下，尤其是在缺氧环境中，氧气的测量2 耗氧率（OCR）并不能精确或准确地反映线粒体功能。
在此，我们概述一系列可独立于氧消耗率（OCR）来测定线粒体功能的实验方法。我们提供了直接测定由复合物I介导的NADH氧化以及由二氢乳清酸脱氢酶介导的 从头合成 嘧啶生物合成、复合体V依赖性ATP合成、琥珀酸脱氢酶（SDH）复合体的净反应方向性以及线粒体来源的活性氧（ROS）。这些检测旨在用于培养的哺乳动物细胞，尽管其中许多方法可经调整后用于研究线粒体功能。 体内 值得注意的是，本方案中描述的检测方法相较于氧消耗率（OCR）能更直接地测量线粒体功能。此外，这些方法可在低氧条件下评估线粒体功能，而在低氧环境中，OCR 并不能作为有效的测量指标。综上所述，将这些检测方法与经典的呼吸测定实验相结合，将为研究人员提供对哺乳动物细胞线粒体功能更为全面的评估。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;1.5 mL 离心管</td><td>细胞处理</td><td>667443</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 离心管</td><td>细胞处理</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>细胞处理</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12孔板</td><td>细胞处理</td><td>229112</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>604852</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;谷氨酰胺</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>285978-14-5</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>细胞处理</td><td>667411</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>细胞处理</td><td>667421</td><td></td></tr><tr><td>150 毫米组织培养皿</td><td>细胞处理</td><td>229651</td><td></td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2,6-二氯酚靛酚</td><td>霍尼韦尔</td><td>33125</td><td></td></tr><tr><td>碳酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37999</td><td></td></tr><tr><td>抗霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascentis Express C18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53825-U</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 瓶顶滤器，0.22 μm &amp;micro;m，PES 9 9 mm 膜直径</td><td>细胞治疗</td><td>229717</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Brequinar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0113</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀，双头扁平窄刃</td><td>细胞处理</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -105 冷阱</td><td>Labconco</td><td>7385020</td><td></td></tr><tr><td>完整蛋白酶抑制剂片剂</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>库尔特计数杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-694</td><td></td></tr><tr><td>Decylubiquinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7911</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000908</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5910 Ri</td><td>Eppendorf</td><td>5943000343</td><td></td></tr><tr><td>半乳糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>无葡萄糖DMEM</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>无谷氨酰胺DMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HPLC级35%氨水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>460801000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC级乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td>HPLC级氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>HPLC级甲酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>HPLC级异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>色谱纯甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900688</td><td></td></tr><tr><td>HPLC级水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>人骨肉瘤细胞系 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>等渗缓冲液</td><td>贝克曼库尔特</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MitoSox Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem 组织研磨器，21 号规格</td><td>Kimble</td><td>885502-0021</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>无丙酮酸钠的DMEM培养基</td><td>Gibco</td><td>11965175</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus 质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>726030</td><td></td></tr><tr><td>ReCO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;孵育器</td><td>贝克</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷藏式Centrivap台式真空浓缩仪</td><td>Labconco</td><td>7310020</td><td></td></tr><tr><td>RIPA缓冲液</td><td>默克生命科学</td><td>20188</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 5&amp;mu;150 x 2.1 mm 分析柱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.50460.0001</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 保护柱套件</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.50438.0001</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠，颗粒状</td><td>Millipore Sigma</td><td>567530-250GM</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW，TRACEFINDER 5.1 SP3</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>OPTON-31001</td><td></td></tr><tr><td>叔丁基过氧化氢溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红</td><td>Gibco</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>VANQUISH HORIZON / FLEX 高效液相色谱系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>VF-S01-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Z2 库尔特颗粒计数与粒径分析仪</td><td>贝克曼库尔特</td><td>BZ10131270</td><td></td></tr></tbody></table>

不依赖氧气的哺乳动物线粒体功能检测方法

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

线粒体电子传递链（ETC）中的电子流动在哺乳动物细胞中支持多种生物合成、生物能量及信号传导功能。随着氧气（O₂）2）是哺乳动物电子传递链（ETC）中最普遍的末端电子受体，O2 消耗速率常被用作线粒体功能的替代指标。然而，新兴研究表明，这一参数并不总能准确反映线粒体功能，因为在缺氧条件下，延胡索酸可作为替代性电子受体以维持线粒体功能。本文汇编了一系列实验方案，使研究人员能够独立于氧气消耗来测量线粒体功能2 消耗速率。这些检测方法在研究缺氧环境下线粒体功能时尤为有用。具体而言，我们描述了测量线粒体ATP生成的方法， 从头合成 嘧啶生物合成、复合体I介导的NADH氧化以及超氧化物生成。结合经典的呼吸测定实验，这些正交且经济的检测方法将为研究人员提供其感兴趣体系中线粒体功能的更全面评估。

DHODH、复合体I和复合体V的活性均可通过增殖实验进行评估。当培养基中缺乏尿苷时，细胞对这些通路的依赖性增加 从头合成 嘧啶生物合成途径。因此，当细胞在无尿苷培养基中增殖时，相较于在含尿苷培养基中培养的细胞，其对brequinar抑制DHODH活性的作用更为敏感（图6A）。类似地，当培养基中缺乏丙酮酸时，细胞增殖对复合物I活性的依赖性增加。因此，当细胞在无丙酮酸培养基中增殖时，其对鱼藤酮抑制复合物I活性的敏感性高于在含丙酮酸培养基中培养的细胞（图6B). 可通过将细胞置于含半乳糖而非葡萄糖的培养基中促使其增殖，以评估复合体V的活性。由于半乳糖在糖酵解过程中净生成零ATP，因此以此为能源生长的细胞更依赖于线粒体通过复合体V产生ATP。因此，在含半乳糖培养基中增殖的细胞对寡霉素抑制复合体V的敏感性高于在含葡萄糖培养基中增殖的细胞（图6C).
SDH 活性可通过13C5-谷氨酰胺示踪并监测其在延胡索酸和琥珀酸同位素异构体中的掺入来测定。在对照处理条件下，SDH 复合物倾向于正向反应，13C4-琥珀酸掺入至13C4-延胡索酸的水平高于13C3-延胡索酸掺入至13C3-琥珀酸（图 7）。在抗霉素处理条件下，SDH 复合物倾向于逆向反应，13C3-延胡索酸掺入至13C3-琥珀酸的程度大于13C4-琥珀酸掺入至13C4-延胡索酸（图 7）。
可使用荧光探针 MitoSox 检测线粒体内超氧化物的产生，MitoSox 与超氧化物反应后生成 2-羟基-线粒体乙啶。本研究中，在叔丁基过氧化氢存在下用 MitoSox 处理的细胞中，2-羟基-线粒体乙啶水平升高，而加入抗氧化剂 NAC（可清除细胞内活性氧）后该升高受到抑制（图 8）。
<img alt="代谢通路示意图；显示糖酵解和半乳糖代谢过程中的酶及ATP/ADP循环。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：复合物V增殖实验的机制基础。 葡萄糖和半乳糖通过糖酵解途径被氧化。葡萄糖经糖酵解净生成两个ATP，而半乳糖经糖酵解净生成零个ATP，因为UDP-半乳糖的合成需要消耗UTP。因此，由于缺乏糖酵解产生的ATP，生长在半乳糖培养基中的细胞更依赖线粒体ATP合成。缩写：GALK = 半乳糖激酶；GALT = 半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶；PGM1 = 磷酸葡萄糖变位酶1；GPI = 葡萄糖-6-磷酸异构酶；UGP = UDP-葡萄糖焦磷酸化酶；GALE = UDP-半乳糖-4-差向异构酶；NDK = 核苷二磷酸激酶；UMPK = 尿苷单磷酸激酶；HK = 己糖激酶；PFK = 磷酸果糖激酶；ALDO = 醛缩酶；TPI = 三碳糖磷酸异构酶；GAPDH = 3-磷酸甘油醛脱氢酶；PGK = 磷酸甘油酸激酶；PGM = 磷酸葡萄糖变位酶；ENO = 烯醇化酶；PK = 丙酮酸激酶。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="鱼藤酮在丙酮酸培养基中抑制线粒体电子传递；三羧酸循环示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：复合物I增殖实验的机制基础。 复合物I活性受抑制后发生改变的代谢通路示意图。在高丙酮酸培养基中，通过乳酸脱氢酶（LDH）介导的NADH氧化可绕过复合物I的抑制。而在低丙酮酸培养基中，这种适应机制较难实现，细胞更依赖复合物I活性来重新氧化NADH。缩写：LDH = 乳酸脱氢酶；TCA cycle = 三羧酸循环。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DHODH酶示意图，显示涉及^13C标记的乳清酸和天冬氨酸转移的代谢过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：使用13C4-天冬氨酸示踪时DHODH反应的示意图。 Brequinar抑制二氢乳清酸氧化为乳清酸，从而阻断UMP的下游合成。13C4-天冬氨酸通过DHODH活性被掺入至13C3-UMP中。缩写：OMM = 线粒体外膜；IMM = 线粒体内膜；DHODH = 二氢乳清酸脱氢酶。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SDH 正向琥珀酸氧化和逆向延胡索酸还原过程示意图；线粒体功能。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：通过13C5-谷氨酰胺示踪法测定复合体 II 的正向与逆向活性。 为测定复合体 II 的正向活性（左），监测13C5-谷氨酰胺掺入13C4-琥珀酸和13C4-延胡索酸的情况。为测定复合体 II 的逆向活性（右），监测13C5-谷氨酰胺掺入13C3-琥珀酸和13C3-延胡索酸的情况。缩写：SDH = 琥珀酸脱氢酶；CytC = 细胞色素 C。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="MitoSox 被超氧阴离子氧化的化学反应图示、分子式、[M+H] 316.6600 m/z。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：MitoSox Red 与超氧阴离子的反应。MitoSox 与线粒体中的超氧阴离子反应生成 2-OH-MitoE2+。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞增殖柱状图；DHODH、复合物I、复合物V活性；相对细胞计数分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：基于增殖的检测方法用于测量线粒体功能（A）在添加或不添加100 µg/mL尿苷的培养基中，用5 µM brequinar（DHODH抑制剂）处理的143B骨肉瘤细胞的增殖情况。数据表示为均值±标准误；每组条件n = 3。（B）在添加或不添加5 mM丙酮酸的培养基中，用2 µM鱼藤酮（复合物I抑制剂）处理的143B骨肉瘤细胞的增殖情况。数据表示为均值±标准误；每组条件n = 3。（C）在分别以10 mM葡萄糖或10 mM半乳糖作为唯一中心碳源的培养基中，用5 µM寡霉素（复合物V抑制剂）处理的143B骨肉瘤细胞的增殖情况。数据表示为均值±标准误；每组条件n = 3。*表示使用Graphpad Prism软件进行单因素方差分析时，p &lt; 0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SDH 活性图；琥珀酸氧化，延胡索酸还原；柱状图，抗霉素对 Caki 1、DLD1 的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图 7：13C5-谷氨酰胺示踪法测定复合体 II 活性。 在 DMSO 和 500 nM 抗霉素 A 处理的 Caki1 与 DLD1 细胞中进行的琥珀酸氧化及延胡索酸还原（SDH 逆向反应）。数据表示为均值 ± 标准误；每组条件 n = 3。*** 表示使用 GraphPad Prism 软件进行非配对 t 检验，p &lt; 0.05。缩写：SDH = 琥珀酸氧化；SDH 逆向 = 延胡索酸还原。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="2-OH-Mito E2+的离子色谱图；DMSO、tBuOOH、tBuOOH+NAC处理；峰面积分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图8"> 
图8：基于LCMS的MitoSox检测法检测超氧阴离子。 经MitoSox处理30分钟并同时给予tBuOOH ± NAC的Caki1细胞中分离得到的2-OH-Mito E2+的提取离子色谱图。缩写：LCMS = 液相色谱-质谱联用；NAC = N-乙酰半胱氨酸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：本实验方案中所用试剂、缓冲液和培养基的组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本文介绍了一系列检测方法，用于独立于哺乳动物细胞消耗分子氧能力之外直接测量其线粒体功能。

线粒体电子传递链（ETC）中的电子流动支持多种生物合成、生物能量及信号传导功能……

我们的研究重点是线粒体如何感知并适应代谢应激。一种关键的代谢应激是缺氧，即细胞缺乏氧气时发生的情况。我们正在开发更优的检测方法，以研究线粒体在低氧环境中的功能。采用高分辨率质谱法研究细胞和组织中的代谢物水平。我们利用稳定同位素示踪实验追踪特定代谢物的去向，揭示与健康及疾病状态下哺乳动物生理相关的新型代谢通路。本研究团队发现，哺乳动物线粒体在低氧环境中仍可维持关键功能。从机制上讲，它们利用延胡索酸作为电子传递链的替代性电子受体。本方案整合了多种检测方法，研究人员可借此更全面地评估哺乳动物细胞中的线粒体功能。尤为重要的是，这些方案可用于研究缺氧条件下的线粒体功能，因为传统的呼吸测定实验在此情况下将不足以提供充分信息。首先，观察六孔板中的143B人骨肉瘤细胞。当细胞融合度达到75%时，将每孔中的培养基更换为含有10毫摩尔13C4天冬氨酸的培养基，并孵育8小时，以实现细胞标记的稳态。为分离代谢物，将预先配制的缓冲液在-80摄氏度下过夜冷却，或置于干冰上。同时，从培养箱中取出一块培养板，使用移液器吸去每个孔中的培养基。用 PBS 洗涤两次，然后在继续下一步操作前去除残留的 PBS。现在将培养板置于干冰上，并向每个孔中加入 800 微升的预冷缓冲液。为促进细胞裂解，将培养板在 80 摄氏度下孵育 15 分钟。孵育结束后，使用细胞刮在干冰上刮取每个孔中的样品，并将裂解液转移至置于干冰上的 15 毫升微量离心管中。在 4 摄氏度下涡旋震荡裂解液 10 分钟，然后在 4 摄氏度、17,000 G 条件下离心 10 分钟。然后将上清液转移至1.5毫升微量离心管中，在4摄氏度下使用带有冷阱的高真空浓缩仪干燥约六小时。将干燥后的代谢物沉淀物于80摄氏度保存，直至后续使用。若需采用液相色谱-质谱联用技术（LCMS）分析样品，向干燥的沉淀物中加入100微升HPLC级水，并按所示方法涡旋混匀。将样品在 4 摄氏度、最大转速下离心 10 分钟。然后转移 25 微升上清液至 LCMS 进样瓶中，并将 2 微升注入 LCMS 系统。进行液相色谱时，使用流动相 B 在梯度模式下运行：流动相 B 从 80% 降至 20% 耗时 20 分钟，再从 20% 升至 80% 耗时 0.5 分钟，随后在 80% 条件下保持 7.5 分钟，流动相 A 作为对照。接着进行质谱分析，选择质荷比（MZ）70 至 1000 道尔顿的全扫描模式，分辨率设为 70,000。设定AGC目标值为1 × 10⁶，最大注入时间为20毫秒。接下来，将运行时间设置为16.5分钟。极性设为正极。将AGC目标值设为10的5次方，最大离子阱时间设为20毫秒，扫描范围设为70至1000质荷比。然后将喷雾电压设为3.0千伏，加热毛细管温度设为275摄氏度。选择鞘气流速为40单位，辅助气体流速为15单位，扫气流速为1单位。对于13C5谷氨酰胺同位素示踪实验，当细胞达到75%融合度时，更换培养基为含有2毫摩尔13C5谷氨酰胺的培养基，并孵育以实现目标细胞标记的稳态。随后按照先前所述方法分离并分析代谢物。分离并分析代谢物后，通过计算13C3延胡索酸、13C4延胡索酸、13C3琥珀酸和13C4琥珀酸的标记百分比，分析琥珀酸脱氢酶（SDH）活性。然后使用公式评估琥珀酸氧化和延胡索酸还原。在对照处理条件下，SDH复合物倾向于正向反应，13C4琥珀酸掺入到13C4延胡索酸的量高于13C3延胡索酸掺入到13C3琥珀酸的量。在经抗霉素处理的骨肉瘤细胞中，琥珀酸脱氢酶复合体倾向于进行逆向反应，13C3延胡索酸掺入13C3琥珀酸的过程比13C4琥珀酸掺入13C4延胡索酸更为显著。

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