利用癌细胞系生成线粒体杂交细胞

本研究旨在更深入地理解线粒体在癌症进展和转移中的作用。通过构建线粒体细胞融合杂交体（transmitochondrial cybrid），有助于阐明线粒体基因型在何种程度上参与了肿瘤细胞的侵袭性。其中，构建细胞融合杂交体（cybrid）是获取线粒体在癌症中作用信息的技术之一。

我们将该工具与多种其他方法结合使用，包括电泳分析、呼吸分析以及其他线粒体功能检测、流式细胞术、蛋白质组学等。癌细胞的可塑性以及核基因与线粒体基因之间的相互作用网络，增加了实验设计和数据解读的复杂性。这也是为何有必要开发新的实验方法的原因之一。

我们研究中最令人振奋的发现之一，是鉴定出两种与细胞从培养皿脱离相关的线粒体DNA突变，这种脱离现象类似于转移灶的形成，并使细胞完全依赖有氧糖酵解，同时在体内模型中表现出更强的致瘤性和转移性。该线粒体交换方案可应用于悬浮生长的癌细胞。此方法能够克服传统技术的局限性，因为在传统方法中，受体细胞系的去核过程以及线粒体DNA的完全清除常常成为实际操作中的重大挑战。

为了对线粒体受体细胞系进行线粒体耗竭，将100万个细胞接种于六孔板中，使用含10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素的完全培养基。根据细胞系类型，每天用最适浓度的罗丹明6G处理细胞，持续三至七天。为维持细胞存活，需在细胞培养基中补充50微克/毫升尿苷和100微克/毫升丙酮酸钠。

处理后、与供体细胞系的线粒体融合之前，移除经罗丹明6G处理的细胞的培养基，并加入不含罗丹明6G的完全细胞培养基。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育三至四小时。最后，为准备用于融合的罗丹明6G预处理细胞，将其收集至15毫升离心管中，并在室温下以520 ×g离心五分钟。

注意，由于经罗丹明6G处理，沉淀呈现亮粉色。在第七天获得约2500万个线粒体供体细胞后，将指数生长的细胞收集至50毫升离心管中，并在室温下以520 ×g离心5分钟进行收集。用冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞，并在室温下以520 ×g离心5分钟进行沉淀。

从现在开始，使用预冷的试剂并在4°C条件下进行整个线粒体提取过程，细胞或线粒体始终置于冰上。第三次离心后，使用连接真空泵的玻璃移液管抽吸弃去上清液。然后将沉淀的细胞重悬于低渗缓冲液中，缓冲液体积为细胞沉淀体积的七倍。

然后将细胞悬液转移至匀浆管中，冰上孵育2分钟使细胞膨胀。使用连接至电机驱动杵头（转速为每分钟600转）的匀浆器，进行8到10次研磨，以破碎细胞膜。向细胞匀浆液中加入高渗缓冲液，体积为初始沉淀体积的7倍，以形成等渗环境。

将匀浆转移至15毫升离心管中，在4摄氏度条件下，使用固定角转子以1,000 G离心5分钟。然后仅收集上清液的四分之三，保留较大距离避开沉淀，以避免混入细胞核或完整细胞，将上清液转移至另一离心管中。重复此步骤两次后，将含有线粒体组分的上清液转移至1.5毫升离心管中。

在4°C条件下，以18,000 G的最大速度离心试管2分钟。弃去上清液，并用缓冲液A洗涤线粒体富集沉淀。将两个试管中的内容物合并至一个试管中，并按之前所述方法进行离心。重复此过程，直至所有材料均集中于同一试管中。

用300微升缓冲液A洗涤上一次离心获得的沉淀。使用Bradford法测定线粒体蛋白浓度。在与线粒体受体细胞系融合之前，通过核蛋白的免疫检测来评估线粒体组分中是否存在细胞核污染物。或者，可对核基因进行定量聚合酶链式反应（QPCR）扩增。

在构建线粒体胞质杂交细胞（transmitochondrial cybrid）时，使用经罗丹明6G处理而线粒体被耗竭的线粒体受体细胞，并将其与来自线粒体供体细胞的分离线粒体进行融合。为确保受体细胞中线粒体功能被完全消除以及供体细胞中细胞器的纯化，可将少量经罗丹明6G处理的细胞和分离的线粒体接种于六孔板内的完全培养基中。培养一个月后，检查各孔中是否无存活细胞残留。

进行融合时，将经罗丹明6G处理的细胞小心地加入分离得到的线粒体沉淀中，然后在520 G条件下离心5分钟，使细胞与线粒体充分混合。加入100微升50%聚乙二醇，轻轻重悬沉淀30秒。随后静置悬浮液，保持不动30秒。

最后，将混合物转移至六孔板中，加入新鲜的完全细胞培养基，并置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育。通常约一周后，应开始出现线粒体转染的胞质杂交细胞，形成可单独挑选或在分析前混合成池的克隆。通过野生型线粒体的限制性片段长度多态性（RFLP）分析获得的限制性片段与突变型的限制性片段不同。

对新构建的线粒体置换细胞系进行的RFLP分析表明，其限制性片段与相应线粒体供体细胞的片段完全相同，而与受体细胞系产生的片段不同。此外，杂交过程中所用两种细胞系典型的核DNA基因分型谱型存在差异，也可用于确认核DNA的纯度。