Name: 一种使用纳米草本封装精油的抗菌织物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 了解纳米草本封装精油技术制备抗菌织物的方法，用于实验室防护服开发。该技术对四种人类病原体具有99.99%的杀菌效果，经十次洗涤后仍保持90%功效，为生物安全实验室和医疗机构降低感染风险提供实用解决方案。

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本研究由以下机构资助： &#34;应用研究、创新与创业服务&#34; （ARIES），加拿大百年理工学院

1. 纳米颗粒的制备
<ol>
	<li>纳米草药包封
	<ol>
		<li>配制 50 mL 的 1% (v/v) 乙酸溶液。 
		警告：冰乙酸具有刺激性，可导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。操作时应穿戴全长实验服、丁腈手套和护目镜，并在通风橱内进行。</li>
		<li>将 0.6 g 壳聚糖碎片（中等分子量）溶于 50 mL 的 1% 乙酸溶液（上一步配制）中，制备 1.2% (w/v) 的壳聚糖溶液。在室温（R/T）下搅拌过夜（O/N），以获得均匀的乳液。</li>
		<li>加入 0.5 g Tween 80，在 60 °C 下以 1,000 rpm 搅拌 2 小时，得到均匀溶液。在加入活性化合物（香芹酚或百里酚）前，将溶液冷却至室温（R/T）。</li>
		<li>在室温下以 1,000 rpm 搅拌的同时，逐滴或逐步加入 0.75 g 香芹酚（或百里酚），持续搅拌 20 分钟。壳聚糖与活性化合物的质量比为 1:1.25。</li>
		<li>在持续室温搅拌下，逐滴加入 50 mL 的 0.5% (w/v) TPP 溶液。继续搅拌 30 分钟，以获得均匀乳液。</li>
		<li>按照相同步骤制备阴性对照组，但不添加活性化合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心乳液 30 分钟，倾去上清液后收集形成的纳米颗粒（沉淀）。保留上清液用于测定包封效率。</li>
		<li>使用体积为沉淀两倍的 1% (v/v) 水性 Tween 80 溶液洗涤颗粒（来自步骤 1.2.1），以去除未结合或游离的活性化合物。每次洗涤时需通过涡旋充分扰动沉淀，直至形成均匀溶液。</li>
		<li>用去离子水洗涤颗粒（来自步骤 1.2.2）两次，以去除杂质。</li>
		<li>将沉淀（来自步骤 1.2.3）重新悬浮于 30 mL 去离子水中，以重建纳米颗粒悬液。将纳米颗粒在 4 °C 下保存，最长可达 6 个月。 
		​注：实验可在此阶段暂停。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表征
	<ol>
		<li>用去离子水稀释纳米颗粒，使紫外-可见（UV-Vis）光谱在 250 至 400 nm 范围内的读数处于合适范围（吸光度 >1）。</li>
		<li>使用紫外-可见分光光度计记录纳米颗粒在 250 至 400 nm 波长范围内的 UV-Vis 吸收光谱。</li>
		<li>取一份纳米颗粒样品（1 mL）在室温（R/T）下保存不同时间（例如 1 至 6 个月），并与新鲜样品一起通过圆柱平板法检测其抗菌效果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>织物涂层
	<ol>
		<li>采用浸轧-烘干-固化法将纳米颗粒涂覆于机织棉布上7,21。
		<ol>
			<li>将布样浸入含有纳米颗粒和织物粘合剂的溶液中 3 分钟，直至完全浸透。然后通过双辊实验室轧车去除多余液体。</li>
			<li>在 100 °C 下烘箱干燥 30 分钟，并在 130 °C 下固化 10 分钟。</li>
			<li>最后，在超声波浴中清洗布样 15 分钟，以去除未结合的纳米颗粒。 
			注：也可采用下述简化方法。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将棉布（或实验服布样）裁剪成 10 cm × 10 cm 的正方形。</li>
		<li>在室温下，将裁剪好的布片浸入装有 2 mL 合成的 10% 纳米颗粒溶液的塑料容器（12 cm × 12 cm）中，持续 2 分钟。通过风干去除多余液体。</li>
		<li>在 100 °C 下热压 3 分钟，使纳米颗粒固定在织物上。</li>
		<li>用 2% (w/v) 水性 Tween 80 溶液冲洗以去除未结合的纳米颗粒，然后在 100 °C 烘箱中干燥 30 分钟。 
		注：该抗菌织物可在室温下保存长达 2 年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤耐久性
	<ol>
		<li>将织物裁剪成 50 mm × 50 mm 的正方形布样。</li>
		<li>将布样放入玻璃或塑料容器中的 50 mL 温自来水（40 °C）中，并加入两滴普通洗涤剂（非抗菌型）。</li>
		<li>在摇床或磁力搅拌器上振荡清洗 30 分钟。</li>
		<li>风干或在 60 °C 下孵育 2 小时，随后检测其抗菌效能。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于纳米颗粒筛选的圆柱板测定法
<ol>
	<li>根据制造商说明配制胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、抗生素基础琼脂（ABA）和抗生素种子琼脂（ASA），并通过121 °C、15 psi条件下高压灭菌15分钟对培养基进行灭菌。</li>
	<li>将待测功效的目标微生物（来自保存菌种）在新配制的TSA平板（或任何合适的培养基）上采用三区划线法进行转接培养，并进行培养以获得纯化平板。（推荐菌种：S. aureus、E. coli、P. aeruginosa 和 C. albicans。）</li>
	<li>从新鲜纯化平板中挑取菌落接种至TSB（10 mL试管）中，在35 °C下振荡培养过夜（O/N），振荡速度为中等（100–200 rpm）。</li>
	<li>将熔化的ASA培养基每管分装5.0 mL至各测试试管中。试管数量应与待测微生物种类数相对应。</li>
	<li>无菌操作将预先灭菌的熔化ABA培养基每皿20 mL倒入每个培养皿（100 mm × 20 mm）中，形成底层。培养皿数量应与待测微生物种类数一致。待培养基凝固后备用。</li>
	<li>底层凝固后，向每管熔化的ASA中加入步骤2.3中获得的过夜培养物（1.0 mL，预热至35 °C），立即将其内容物（ASA与菌液的混合物）转移至ABA平板表面。轻轻旋转平板使熔化的琼脂层均匀铺展。确保种子层表面光滑，无凸起或气泡。</li>
	<li>使用无菌镊子在每个琼脂平板上以六边形排列方式均匀放置最多六个不锈钢圆筒（6 mm × 6 mm × 10 mm；预先高压灭菌）（图1）。</li>
	<li>向各圆筒中加入不同体积（30 µL、50 µL、75 µL 和 100 µL）的合成纳米颗粒（NPs）溶液，用于筛选其抗菌效果。阴性对照组不添加任何生物活性成分。</li>
	<li>将常见细菌病原体（如 E. coli、S. aureus、P. aeruginosa）在35 °C下培养24小时，真菌（如 C. albicans）在室温（R/T）下培养3天。</li>
	<li>测量透明抑菌圈的直径，并比较所合成纳米颗粒的抑菌效果。 
	​注意：本实验可用于初步筛选适合涂覆于织物上的最佳纳米颗粒。</li>
</ol>
3. 平行划线法（改良自 AATCC 147）
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>将经过纳米颗粒处理的织物裁剪成 50 mm × 25 mm 的样品片。</li>
		<li>根据制造商说明书配制 Mueller-Hinton 琼脂（MHA）、TSA 和 TSB 培养基，并在 121 °C、15 psi 条件下高压灭菌 15 分钟。</li>
		<li>采用三区划线法将待测试效力的目标微生物（来自保存菌种）接种至新制备的 TSA 平板（或其他适宜培养基）上，于 35 °C 培养 2 天（细菌）或室温培养 5 天（真菌），以获得纯培养物。（推荐菌种：S. aureus、E. coli、P. aeruginosa 和 C. albicans。）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微生物培养物接种
	<ol>
		<li>从新鲜纯培养平板中挑取菌落接种于 TSB 液体培养基（10 mL 试管）中，在 35 °C 条件下振荡过夜培养（O/N），转速为 100–200 rpm。</li>
		<li>将过夜培养物稀释至 1.5 × 108 菌落形成单位（CFU）/mL，或调整至相当于 0.5 麦氏浊度标准（通常为 1/10 至 1/20 稀释倍数，适用于大多数健康菌体）。</li>
		<li>使用 4 mm 无菌接种环取上述稀释后的菌液，按以下方式接种：蘸取一环液体培养物，在 MHA 琼脂平板表面划五条平行线，每条长 6 cm，间距 1 cm，如 图 2 所示。接种过程中不得重复蘸取菌液。</li>
		<li>用无菌刮刀轻轻将织物样品压在五条划线上，使样品居中并与所有划线区域充分接触。于 35 °C 培养 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗菌效果的定性评估
	<ol>
		<li>观察培养后的平板，检查沿划线方向在织物边缘以外是否出现生长中断现象（透明区域表示生长被抑制）。</li>
		<li>使用公式（1）计算织物样品两侧沿划线方向的抑菌圈平均宽度（W）。 
		W = (T - D)/2    （1） 
		W = 透明区宽度；T = 包括样品宽度在内的透明区总长度；D = 织物样品宽度（25 mm）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 定量对数减量法（改良自 AATCC 100）
<ol>
	<li>实验准备
	<ol>
		<li>将织物裁剪成 50 mm × 50 mm 的正方形样品。</li>
		<li>根据制造商说明书配制 TSA、TSB、Letheen 肉汤和磷酸盐缓冲液（PBS），并通过高压灭菌对培养基进行灭菌。</li>
		<li>通过将纯化平板上的单菌落接种至无菌 TSB 中，在 35 °C 下培养 18–24 小时，制备待测微生物的过夜（O/N）培养物。（推荐菌种：S. aureus、E. coli、P. aeruginosa 和 C. albicans。）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微生物培养物接种
	<ol>
		<li>将过夜培养物稀释至 1.5 × 108 CFU/mL，或相当于 0.5 麦氏浊度标准（对于大多数健康菌液，通常为 1/10 至 1/20 的稀释倍数）。</li>
		<li>通过测定织物的持液能力，确定用于接种的培养物体积，方法如下：
		<ol>
			<li>将一系列体积的稀释肉汤培养物（例如 100–500 µL）分别加至置于不同培养皿中的织物样品上，选择能使样品完全吸收液体且无残留/游离液体的体积。持液能力因织物类型和厚度而异。对于普通棉质实验服，约为 200 µL。</li>
			<li>将上述确定的持液量（例如 200 µL）的每种培养物接种到置于无菌培养皿中的样品上。样品数量应与测试项目数量相对应（例如立即测试和洗涤后测试[以及所测试的洗涤循环次数]），并在不同接触时间点检测抗菌效果（设定时间/天数，例如 30 分钟、2 小时、第 1–3 天）。 
			​注意：使用带气溶胶滤芯吸头的微量移液器（以防止后续使用时移液器污染），将培养物均匀接种于样品上。</li>
			<li>阴性对照使用相同类型的未经处理的织物样品。针对每种相应的测试微生物、接触时间、不同织物类型及洗涤循环次数均需设置阴性对照。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过活菌平板计数法回收微生物
	<ol>
		<li>将接种后的样品（包括处理和未处理的）置于培养皿中（盖子微开），在室温（R/T）下干燥所需测试的接触时间（例如 0 分钟、30 分钟、60 分钟等，或为评估长期效果可延长至数天）。务必包含“0 分钟”时间点，以反映即时作用及中和效果。</li>
		<li>将样品无菌转移至独立的无菌离心管（50 mL）中，并拧紧管盖。</li>
		<li>加入 Letheen 肉汤（或其他合适的中和缓冲液），制成 1/100 稀释液（例如，若接种量为 200 µL，则加入 19.8 mL）。</li>
		<li>拧紧离心管盖，涡旋振荡 1 分钟（中等速度）。</li>
		<li>用无菌 PBS 对悬液进行连续 1/10 梯度稀释，使“未处理”组的菌落数降至无法计数（TLTC）。</li>
		<li>取稀释液 0.1 mL 接种至合适的培养基平板上，该培养基应支持目标微生物生长（例如细菌使用 TSA，真菌使用沙氏葡萄糖琼脂 [SDA]），或选择能优化生长并提供良好对比度以确保菌落计数准确的培养基。</li>
		<li>细菌平板在 35 °C 下培养 2 天，真菌平板在室温下培养 5 天。</li>
		<li>使用菌落计数器或图像分析软件（例如 CFU AI）直接计数可存活的菌落形成单位（CFU）。</li>
		<li>使用公式（2）计算抗菌织物引起的微生物对数减少值（R）： 
		R = <img alt="数学分析中比例计算的分数公式 (A-B)/A。" src="/files/ftp_upload/65187/65187eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> × 100     (2) 
		A = 从未处理织物回收的 CFU 数量的对数值；B = 从处理织物回收的 CFU 数量的对数值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Antimicrobial Efficacy of Nano-Herbal-Coated Fabrics

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</ol>

作者无利益冲突。

杀菌剂的抗菌效果通常通过定量实验进行检测，例如最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），在这些实验中，细菌被浸没于抗菌液体中培养24小时。然而，这些方法不适用于涂层织物，因为涂层织物缺乏液体界面，且杀菌剂在织物纤维中扩散缓慢。因此，已建立多种标准织物测试方法，例如AATCC 147、ISO 20645、AATCC 100和JIS L 1902。Pinho等人23对这些标准进行的比较研究指出，目前尚无关于最合适测试方法的共识。本研究对实验方案进行了轻微修改，以更真实地模拟生物安全实验室中抗菌实验服的使用情况。所用测试微生物是基于先前一项研究（未发表）中在BSL-2实验室实验服上频繁检出的物种。这些微生物也代表了制药测试中常用的多种病原微生物，例如一种革兰氏阳性人类病原菌（S. aureus）、一种革兰氏阴性指示菌（E. coli）、一种高度耐药菌（P. aeruginosa）以及一种皮肤致病真菌（C. albicans）。
本研究中观察到的总体抗菌效果（99....

在微生物学实验室和医疗机构中，防护白大褂是必须佩戴的个人防护装备（PPE），可防止直接接触病原体、液体溅洒和烧伤。由于多种因素，这种棉质大褂容易促进微生物生长：织物结构提供了附着位点和通气环境，制造过程中使用的棉纤维和淀粉，以及使用者脱落的上皮细胞为其提供了营养，而贴近人体则提供了温暖和湿气。纺织品上微生物的积聚还可能引发过敏和医院感染等健康问题，产生难闻气味，并导致织物劣化1。
与普通衣物不同，防护服很少被清洗或消毒，这一点在许多调查中均有发现2,3。大量研究表明，实验服可能成为微生物传播的媒介，并在医疗环境中引发医院感染的风险2,4，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等耐药菌株3；因此，这些本应防止微生物污染的个人防护装备（PPE）反而引发了健康隐患。目前在生物安全二级（BSL-2）设施或微生物学教学实验室背景下，关于实验服相关感染的横断面研究仍不充分，但许多监管机构已限制在密闭等级内使用实验服。然而，由于实际操作中的限制，如在设施内部清洗衣物和储存的问题，北美许多学术机构难以完全满足这些要求，实验服在食堂、图书馆等公共区域穿着的情况十分普遍。解决这些问题的一个实用方案是在纺织品后整理过程中应用抗菌剂。
抗菌织物在运动服、健身服和袜子中的应用日益广泛，主要用于减少体味。然而，除了一些银涂层棉质口罩和医疗保健服装外，这类织物在个人防护装备（PPE）开发中的应用尚不普遍5。我们报道了一种用于实验服的抗菌织物的开发，该织物可抑制生物安全二级（BSL-2）实验室中常见的病原体，并有效防止常见病原体的交叉污染。
目前，市场上已有多种抗菌织物和整理剂，但大多数产品使用重金属胶体颗粒（如银、铜、锌）、有机金属化合物或三氯生、季铵盐类等合成化学品，这些成分对环境不友好1，并可能引发皮肤刺激和过敏等健康问题6。某些合成制剂因可能影响非靶向微生物（如正常菌群）或诱导微生物产生抗菌耐药性（AMR），而引发担忧。美国食品药品监督管理局（FDA）对商用抗菌织物进行监管，要求其对使用者无毒且不具有生态毒性。因此，基于天然生物杀菌剂、可抑制广泛微生物的抗菌织物更具优势。精油（EOs）被广泛用作抗菌和治疗性物质，但由于其耐久性不足，限制了其在抗菌整理中的应用6,7,8。根据我们对纳米草本整理技术的了解及市场调研8，目前尚无商业化上市的草本类抗菌织物。这主要是因为合成涂层易于制造且耐久性长。少数仅用于研究目的的纳米草本涂层纺织品包括印度苦楝7、辣木9和咖喱叶9。
本研究采用两种从牛至精油中提取的生物活性成分——香芹酚和百里酚，这两种成分对多种细菌病原体和病毒均有效，且通常被认为对人体安全10。然而，这些生物活性成分具有挥发性，若直接应用于织物上，其抗菌效果持续时间较短。纳米草本封装技术是一种将生物活性成分或药物包载于聚合物外壳内的过程，该外壳可保护核心成分免受环境降解，从而延长其保质期。此外，这些聚合物颗粒尺寸较小，通常在10 nm至100 nm之间，可提高应用效率，并延缓生物活性化合物在织物上的释放。这些生物活性化合物已被用于多种用途，例如食品保鲜10，但尚未用于纺织品涂层。
在众多聚合物封装材料中，壳聚糖因其多种特性而成为一种极具吸引力的候选材料，例如无毒、可生物降解、黏膜黏附性和生物相容性11。壳聚糖是一种天然多糖，通过甲壳素脱乙酰化过程获得，而甲壳素广泛存在于贝壳和真菌细胞壁中。它被应用于生化和食品保鲜领域，如药物或蛋白质递送11,12,13、可控释放14以及抗菌薄膜10。壳聚糖在水中不易溶解，但在酸性介质中可形成胶体悬浮液。生物活性分子可通过一种简单的两步离子凝胶法加载到壳聚糖纳米颗粒（NPs）中14,15,16。在此过程中，百里香酚和香芹酚等疏水性生物活性化合物在表面活性剂吐温80的辅助下形成水包油乳液。随后，使用多阴离子化合物五钠三聚磷酸盐（TPP）在多阳离子聚合物分子上的氨基与TPP分子的磷酸基团之间形成交联，从而稳定该复合物。该复合过程使生物活性化合物在壳聚糖基质内固化，随后经纯化并涂覆于棉布片上，制得抗菌织物。
在将纳米制剂应用于织物之前，必须首先测试其乳液状态下的抗菌效果。这可以通过定性方法方便地进行评估，例如 Kirby-Bauer 纸片扩散法、孔扩散法和圆柱扩散平板法。然而，圆柱扩散平板法17具有可加载不同体积制剂并比较抑菌圈范围的灵活性。该方法中，将抗菌制剂加入不锈钢圆柱中，然后放置于已接种测试微生物或病原体的软琼脂层上。所产生的抑菌圈直径与抗菌制剂的抑制能力成正比，因此可作为肉汤稀释法的替代方法。然而，除非维持特定标准，否则清晰区大小仅能在同一平板内作为比较性或定性指标。抗菌剂通过抑制病原体生长（抑菌）或杀死细胞（杀菌）发挥作用，其效果可分别通过最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）进行量化。然而，生物活性化学物质在其制剂形式（液态）中与涂覆于织物等基材上时，其效能和行为存在差异18。这是因为多种因素会影响其效果，例如抗菌剂在织物上的附着稳定性、水分含量、基材类型以及微生物的附着能力。如果目标仅为评估抑菌活性，可采用如&#34;平行划线法&#34;19等定性检测方法，以相对快速简便地评估可扩散性抗菌制剂。但如果需要测定杀菌效果，则可采用&#34;纺织材料上抗菌整理剂的评估&#34;20方法，该方法可提供接种病原体的对数减少值。

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>抗生素基础琼脂</td><td>BD Difco</td><td>DF0270-17-4</td><td>又称抗生素培养基2</td></tr><tr><td>抗生素种子琼脂</td><td>BD Difco</td><td>DF0263-17-3</td><td>又称抗生素培养基1</td></tr><tr><td>血琼脂（含5%绵羊血的营养琼脂）</td><td>由CFIA捐赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>溴甲酚紫乳糖琼脂</td><td>由CFIA捐赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt;</td><td>ATCC 全球生物资源中心</td><td>ATTC 10231</td><td></td></tr><tr><td>香芹酚</td><td>Millipore Sigma</td><td>282197 (CAS# 499-75-2)</td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp; Allergra X-22R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>型号 # X-22R</td><td>带制冷功能。启动后需等待至少20分钟，或直至温度降至设定的低温值（例如4 &amp;deg;C），因制冷需要时间。</td></tr><tr><td>中等分子量壳聚糖（CS）</td><td>Millipore Sigma</td><td>448877 (CAS # 9012-76-4)</td><td></td></tr><tr><td>对开式热压机</td><td>Intiva</td><td>IM1200</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli (E. coli)&lt;/em&gt;</td><td>ATCC 全球生物资源中心</td><td>ATTC 23725</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>1205M34</td><td></td></tr><tr><td>Letheen 肉汤</td><td>BD Difco</td><td>DF0681-17-7</td><td>用于中和抗菌作用。不同厂家的产品可能需要添加吐温80，而Difco产品中已预先添加。</td></tr><tr><td>Milli Q 水</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZR0Q16WW</td><td>去离子水</td></tr><tr><td>穆勒-欣顿琼脂</td><td>BD Difco</td><td>DF0252-17-6</td><td></td></tr><tr><td>五钠三聚磷酸盐（TPP）</td><td>Millipore Sigma</td><td>238503 (CAS# 7758-29-4)</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt;</td><td>ATCC 全球生物资源中心</td><td>ATTC 9027</td><td></td></tr><tr><td>沙氏葡萄糖琼脂</td><td>BD Difco</td><td>DF0109-17-1</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱/恒温振荡器</td><td>VWR</td><td>型号# SHKA2000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC 全球生物资源中心</td><td>ATTC 6538</td><td></td></tr><tr><td>百里酚</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0501 (CAS# 89-83-8)</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆琼脂</td><td>BD Difco</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>BD Difco</td><td>215235</td><td></td></tr><tr><td>吐温80</td><td>Millipore Sigma</td><td>STS0204 (CAS # 9005-65-6)</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>GENESYS 30 (840-277000)</td><td></td></tr></tbody></table>

一种利用精油纳米草本封装技术的抗菌织物

An Antimicrobial Fabric Using Nano-Herbal Encapsulation of Essential Oils

在生物危害实验室和医疗机构中，实验服被广泛用作防护服装，以防止直接接触病原体、液体溅洒和烧伤。这些以棉为基础的防护服由于其多孔性、持水能力以及保留使用者体温的特性，为微生物的生长和附着提供了理想的条件。多项研究已证实，致病细菌可在医院工作服和实验服上存活，并成为微生物传播的媒介。
解决这些问题的常用方法是在纺织品整理过程中应用抗菌剂，但由于许多合成化学品具有毒性和环境影响，已引发担忧。持续的疫情也为研究高效、环保且无毒的抗菌制剂提供了契机。本研究采用两种天然生物活性化合物——香芹酚和百里酚，将其包封于壳聚糖纳米颗粒中，可对四种常见于生物危害实验室所用实验服上的人类病原体提供有效防护，抑菌率高达4个对数级（99.99%）。
经处理的织物在经历多达10次洗涤循环后仍可实现90%的微生物减少，足以满足预期用途。我们对现有的标准织物测试方法进行了改进，以更真实地反映实验服使用中的典型场景。这些优化有助于更准确地评估抗菌实验服的有效性，并模拟任何意外微生物泄漏后需在短时间内被灭活的情况。建议进一步开展研究，以比较抗菌实验服与普通防护服在长期使用过程中病原体的累积情况。

合成纳米颗粒的初步筛选 
采用两步乳化-溶剂挥发法（油包水乳化法）16，成功将生物活性化合物（香芹酚和百里酚）包封于壳聚糖中。通过紫外-可见分光光度法检测，与对照组（即不含任何生物活性成分的壳聚糖纳米颗粒）相比，相应生物活性成分在特征吸收峰处的吸收峰证实了包封的成功。所制备的纳米颗粒在4 °C下保存12个月仍保持均匀且稳定。抗菌效果的初步筛选通过管碟法进行验证（图1）。该方法为定性方法，因为抑菌圈的大小受多种因素影响，如琼脂厚度、接种菌液浓度以及待测样品的浓度。尽管也可采用其他较简单的方法（如Kirkby-Bauer纸片扩散法或打孔扩散法）进行检测，但管碟法可通过稀释纳米颗粒实现不同浓度的测试（图1A），且每个管腔最多可容纳200 µL的样品体积。此外，通过在含菌琼脂上覆盖上层琼脂，可形成均匀的菌层，从而更精确地测定抑菌圈大小17。实验结果表明，抑菌圈大小与纳米颗粒浓度的逐步增加呈正相...

抗菌实验服可防止病原体积聚造成的交叉污染和意外生物溢出。本文介绍了利用纳米草本封装技术开发对皮肤友好的抗菌织物的实验方案，以及改进的标准测试方法，以精确评估该实验服在常规使用条件下的有效性和适用性。

实验服在生物危害实验室和医疗机构中被广泛用作防护服装，以防止病原体、溢洒物和……的直接接触

本研究概述了一种安全且环保的抗菌织物的制备方案，可用于设计实验服。该研究回答了抗菌织物开发领域的诸多关键问题。例如，经处理的织物中和病原体的效果如何？抗菌织物开发中的关键挑战是在保持抗菌效果的同时，选择合适的生物活性化合物比例，并确保织物具有亲肤性。我们的抗菌织物可有效防护四种人类病原体，最高可达4个对数级的减少，即99.99%的有效性。此外，该织物在经历多达10次洗涤循环后，仍能保持高达90%的抗菌效果。与现有标准技术相比，该方法的主要优势在于提供了一种简化且贴近实际的评估方式，可准确评价抗菌织物的功效。它更能代表实验室外套使用的典型场景，例如在短时间内必须处理的意外微生物溢出。该技术在防护服制造中的应用将降低生物安全实验室中的生物危害风险以及医疗环境中的医院感染。我们正在生物安全二级实验室中测试全长的抗菌实验服。我们未来的研究问题将聚焦于长期连续使用中防止微生物污染的有效性。首先，通过将0.6克壳聚糖碎片溶解于50毫升1%乙酸中来配制壳聚糖溶液。在室温下搅拌过夜，以获得均匀的乳液。加入0.5克Tween 80，在60°C下以1000 RPM搅拌两小时，得到均一溶液。将溶液冷却至室温后，在搅拌条件下逐滴或逐步加入0.75克生物活性化合物香芹酚或百里酚，持续搅拌20分钟。在室温搅拌条件下，向混合物中逐滴加入50毫升五钠三聚磷酸盐。继续搅拌30分钟以获得均匀的乳液。纯化时，在4摄氏度下以10,000g离心乳液30分钟，倾去上清液并收集形成的纳米颗粒。使用体积为所形成沉淀物两倍的水性Tween 80洗涤颗粒，以去除未结合或游离的生物活性化合物。随后用去离子水洗涤颗粒两次，以除去杂质。通过将沉淀物重悬于30毫升去离子水中，重新配制纳米颗粒。取一块经纳米颗粒处理的织物，剪成50毫米×25毫米的样品。将新鲜纯化平板上的微生物培养物接种至胰蛋白胨大豆肉汤中，在35°C下以中等转速振荡培养过夜。将过夜培养物稀释至每毫升1.5亿CFU，或相当于0.5麦氏标准浊度。使用四毫米的无菌接种环接种稀释后的培养物时，先取一环富集培养液，然后在 Mueller-Hinton 琼脂（MHA 琼脂）平板表面划五条平行线，每条长六厘米，相互间隔一厘米。用无菌刮刀轻轻按压织物样品，使其覆盖在这五条划线上，位于中央位置，并与所有五条划线充分接触。于 35 °C 培养 24 小时。对于抗菌效果的定性评估，观察培养后的平板上，在织物边缘之外沿划线区域是否存在生长中断现象。使用屏幕上显示的公式，计算织物样品两侧沿划线方向的抑菌圈平均宽度 W。平行划线法的结果在此图中展示。未经处理的织物和百里香酚纳米颗粒涂层织物对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的作用，以及未经处理的织物和百里香酚纳米颗粒涂层织物对白色念珠菌（C. albicans）的作用如图所示。这些结果表明，经处理的织物样品显示出明显的抑菌圈。选取经纳米颗粒处理的织物，并将其裁剪成 50 毫米 × 50 毫米的方形样品。通过将纯度平板上的分离菌落接种至无菌胰蛋白酶大豆肉汤中，制备目标微生物的过夜培养物。在35摄氏度下孵育18至24小时。将过夜培养物稀释至每毫升1.5亿CFU，或调整至相当于0.5麦氏标准浊度。接下来，为确定用于加标的培养物体积，将一系列稀释后的液体培养物加入到织物样品上，选择合适的体积，使织物样品能够完全吸收液体，无残留或游离液体。将每种培养物的选定体积加标至置于无菌培养皿中的织物样品上。同样，针对每项相应实验，使用相同类型的未处理织物样品进行阴性对照实验。为了通过活菌平板计数法回收微生物，将接种后的样品在培养皿内于室温下空气干燥，达到待测所需的接触时间。随后将样品无菌转移至不同的无菌离心管中，并拧紧管盖。加入Letheen肉汤或任何适用的中和缓冲液，制成1:100的稀释液。关闭离心管后，以中等速度涡旋震荡一分钟。用无菌 PBS 对悬浮液进行连续稀释，随后进行 1 比 10 的系列稀释，直至未处理组的菌落数量过低而无法计数。将稀释后的样品接种至合适的培养基平板上，该培养基应能支持微生物生长，或选择可优化生长并提供良好对比度以确保菌落计数准确的任何培养基。将细菌培养皿在35摄氏度下孵育两天，将真菌培养皿在室温下孵育五天。使用菌落计数器或成像软件直接计数可存活的菌落形成单位。根据屏幕上显示的公式，计算抗菌织物引起的微生物对数减少值 R。其中，A 为未经处理的织物上回收的菌落形成单位数的对数值，B 为经处理织物的相应值。此处展示了在血琼脂上针对金黄色葡萄球菌（S-aureus）、在紫色乳糖琼脂上针对大肠杆菌（E.coli）、在十六烷基三甲基溴化铵琼脂上针对铜绿假单胞菌（P-aeruginosa）、在沙氏葡萄糖琼脂上针对白色念珠菌（C-albicans）测试时，经百里香酚包封的壳聚糖纳米颗粒涂层抗菌织物的对数减少结果。将病原体接种于未经处理和经处理的织物小样上作用 30 分钟，中和后通过稀释涂布法回收菌体。稀释倍数显示了处理组与未处理组之间的比例关系。此处展示了两种生物活性化合物浸渍的抗菌织物与一种真菌接触后，对三种细菌的对数减少量。经洗涤循环后，百里香酚和香芹酚涂层织物的抗菌效果均有所减弱。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一种使用纳米草本封装精油的抗菌织物

取含有纳米复合材料的培养管，该材料由过渡金属与碳组合而成。将耐药的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性病原菌分别接种至不同的试管中作为测试样本。以未经处理的细菌作为阴性对照，以抗生素处理的细菌作为阳性对照。将样品置于振荡条件下孵育。在革兰氏阴性细菌中，多孔的外膜和较薄的肽聚糖层有利于纳米颗粒进入，导致膜结构破坏。随后，这些纳米颗粒会触发活性氧物种的生成，从而损伤DNA、蛋白质和膜结构，导致细菌死亡率升高。在革兰氏阳性菌中，富含磷壁酸的厚肽聚糖层限制了纳米颗粒的渗透，导致细菌死亡率较低。接下来，使用培养基对细菌悬液进行连续稀释。将稀释液接种至琼脂平板，培养以使菌落形成，并计数菌落。与两个对照组相比，测试样品中菌落数量较少，证实了纳米颗粒的抗菌作用。然而，该作用在革兰氏阴性菌中比在革兰氏阳性菌中更强。...

一种纳米颗粒复合物对致病菌抗菌活性的评估

本文描述了一种制备和表征Griffithsin修饰的聚乳酸-羟基乙酸电纺纤维的方法，该纤维对1型人类免疫缺陷病毒感染具有强效的黏附性和抗病毒活性...

用于预防性传播感染的凝集素修饰纤维支架的制备与表征

本报告详细阐述了一种通过微波引发的方法，将功能化卟啉多孔有机硅吸附剂沉积在棉织物上，并证明了经此处理后，2-氯乙基乙基硫醚（CEES）在织物中的穿透显著减少。...

织物载体上多孔吸附剂的沉积

本研究通过多壁碳纳米管的酸性氧化反应，随后还原沉积银纳米颗粒，合成了抗菌纳米材料。使用所制备的纳米材料进行了抗菌活性和细胞毒性测试。...

银纳米颗粒修饰的多壁碳纳米管的合成及其抗菌活性与细胞毒性评估

我们提出了一种用于先进材料抗菌性能表征的实验方案。在此，通过两种相互补充的方法测定材料表面的抗菌活性：一种基于琼脂平板扩散试验，另一种则是依据ISO...

用于生物工程应用的先进材料的抗菌性能表征

我们介绍四种利用纳米颗粒和纳米结构表面评估其抗菌活性的方法 体外...

纳米颗粒与纳米结构表面抗菌活性的评估 体外

光致发光是目前最有效的防伪机制之一。利用并增强天然来源材料固有的光致发光特性，并将其整合到织物基底中，可推动绿色、可持续且具有功能性的智能纺织品的开发。...

增强的光致发光 姜黄 基于壳聚糖介导能量转移的纺织品认证应用提取方法

本文介绍了氧化石墨烯/铜（GO/Cu）纳米复合材料作为一种抗菌纳米材料。评估了GO/Cu纳米复合材料对耐药性革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌效果。...

抗菌型氧化石墨烯/铜纳米复合材料的制备

液滴包封细胞

在本视频中，我们演示一种利用免疫过氧化物酶检测法这一酶联抗原检测技术来检测病毒并测定其滴度的替代方法。我们将向您展示如何采集病毒样本、制备用于检测的细胞，最后通过系列稀释进行免疫过氧化物酶检测，以确定病毒滴度。...

利用免疫过氧化物酶法滴定人冠状病毒

了解纳米草本封装精油技术制备抗菌织物的方法，用于实验室防护服开发。该技术对四种人类病原体具有99.99%的杀菌效果，经十次洗涤后仍保持90%功效，为生物安全实验室和医疗机构降低感染风险提供实用解决方案。

一种利用精油纳米草本封装技术的抗菌织物

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