Name: 基于扩增子的超快速二代测序在非鳞状非小细胞肺癌中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 了解基于扩增子的超快速二代测序技术用于非鳞状非小细胞肺癌的分子诊断。该方法可在三小时内完成FFPE样本的基因组分析，为259例患者提供靶向治疗决策支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢赛默飞世尔科技公司为我们提供了使用其设备和材料的机会。

所有操作均已获得当地伦理委员会（法国尼斯大学医疗中心人类研究伦理委员会，肿瘤库编号 BB-0033-00025）的批准。所有患者均已签署知情同意书，同意使用其样本及生成的数据。所有样本均来自 2022 年 9 月 20 日至 2022 年 1 月 31 日期间在法国尼斯 LPCE 诊断为非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）的患者，采集作为医疗护理的一部分。
1. 使用自动化纯化仪器（API）制备FFPE DNA和RNA样本（处理时间：5小时15分钟）
<ol>
	<li>在仪器上运行方案规划。
	<ol>
		<li>打开仪器电源，使用用户名和密码登录（材料表）。通过点击创建纯化运行方案 运行，然后 添加方案，并通过为运行计划命名。</li>
		<li>然后，选择合适的纯化试剂盒及方案，用于从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品中依次纯化DNA和RNA。纯化后进行定量检测。</li>
		<li>从下拉列表中选择所需的洗脱体积（50 µL），然后单击 下一步选择将要提取的样本数量。</li>
		<li>然后选择每个样本，单击 编辑，输入 样本编号，然后单击 保存.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用GPI制备FFPE DNA和RNA样本
	<ol>
		<li>准备石蜡包埋组织样本（使用切片机切取4片厚度为10 µm的切片），或直接在石蜡包埋块上进行大体解剖。将每份石蜡包埋组织样本分别放入已标记的石蜡包埋样本处理管中材料表).</li>
		<li>2000 x g 离心 g 1 分钟，以使组织沉淀至管底。</li>
		<li>向每个FFPE样本处理管中加入由核酸纯化试剂盒制备的蛋白酶消化主混合液，在60 °C孵育至少60分钟（材料表). 将样品在 90 °C 下孵育 60 分钟。</li>
		<li>孵育后，将样品在室温（RT）下冷却5分钟。</li>
		<li>对于每个FFPE样本处理管，提起内管，向左旋转锁定，然后以2000 x g离心样本 g 10 分钟。</li>
		<li>向右旋转打开内管，将其与外管分离并丢弃。将外管中的样品置于冰上保存，直至上样至API。</li>
		<li>配制DNase消化主混合液，并将其加入预装的FFPE DNA和RNA纯化板2中。然后，将制备好的样品加入FFPE DNA和RNA纯化板1中材料表).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在API上启动纯化运行。
	<ol>
		<li>在 API 界面上，点击 运行，选择 运行方案，然后点击 下一步.</li>
		<li>根据屏幕提示，将纯化运行所需的耗材和试剂加载到API中材料表).</li>
		<li>当所有试剂加载完毕后，单击 下一步关闭API门并点击 开始.</li>
		<li>运行结束后，单击 卸载 在触摸屏上操作后，立即取出含有纯化后样本DNA和RNA的48孔核酸存档板。</li>
		<li>导出定量结果。密封培养板并将纯化后的样品于-80 °C保存。将96孔板转移至测序仪进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>创建样本并创建运行。
	<ol>
		<li>打开软件并登录，然后在菜单栏中选择 样品 并单击 创建样本.</li>
		<li>输入样本名称、性别和肿瘤细胞百分比，并根据需要填写必填项和选填项。</li>
		<li>保存详细信息（性别和肿瘤细胞百分比对于分析拷贝数变异 [CNVs] 至关重要）。</li>
		<li>选择 运行 和 核酸 到 结果 在菜单栏中。</li>
		<li>输入运行名称 设置 步骤。点击 下一步.</li>
		<li>选择检测方法在 检测方法 步骤。点击 下一步.</li>
		<li>选择样本中的 样本 运行检测的步骤。</li>
		<li>然后，在 精选实验方法 窗格中，单击 分配. 点击 下一步.</li>
		<li>检查样品输入板上的样品位置。点击 下一步.</li>
		<li>查看运行计划摘要，然后 保存 &amp;#38; 打印 或 保存.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 测序仪上的自动化NGS（处理时间：30分钟）
<ol>
	<li>加载样本板。 
	注意：最佳核酸浓度为 0.5 ng/µL。已验证的核酸浓度范围为 0.33–1 ng/µL。对于 DNA 和 RNA，实验室已验证 1 ng/µL 的浓度。
	<ol>
		<li>测序仪需要总共 20 µL 的体积。确保有足够的体积用于上样。</li>
		<li>将阳性对照（DNA 和 RNA）以及 NTC（DNA 和 RNA）添加至纯化仪的第一阶段，无需进行提取。每次运行均需使用 DNA 和 RNA 对照以验证运行过程及所用批次。在 API 运行结束时，将 DNA 和 RNA 对照加入板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载测序仪并启动运行。
	<ol>
		<li>从冰箱或冷冻柜中取出所有试剂，并在室温下解冻至少 30 分钟（材料表），最长不超过 12 小时。</li>
		<li>在实验室中，根据供应商在现场培训期间提供的建议，始终保持测序仪处于开启状态。登录系统。</li>
		<li>将纯化仪中的样本板（包含样本）密封后，用一张粘性 PCR 板箔膜封板（材料表），然后加载到测序仪中。</li>
		<li>将所有耗材安装到仪器载台。测序仪会提供逐步指示，提示将每个所需耗材安装至高亮显示的位置（材料表）。</li>
		<li>检查 Strip 2-HD 的第 3 号管中是否有沉淀物。如有需要，轻弹管子或轻轻涡旋混合条带以溶解沉淀。</li>
		<li>Strip 1 和 Strip 3 含有磁珠。此步骤非常关键：必须确保磁珠充分重悬，管子上部不得残留磁珠。</li>
		<li>将条带倒置并翻转 3–4 次以使磁珠混匀。一手握住条带一端，使条带密封面向上，然后迅速向下甩动条带，利用快速的离心手臂动作完成，并以手腕的快速轻弹结束动作。</li>
		<li>在 300 × g 条件下离心 15 秒。如有需要可重复一次。使用适配器和条带架对条带进行离心，以尽量减少因磁珠残留在条带上部而随机出现的失败情况。</li>
		<li>关闭系统并点击 下一步。安装测序试剂舱门（材料表），关闭舱门。测序仪将自动开始运行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁
	<ol>
		<li>运行结束后进行清洁时，当运行完成，点击 下一步。</li>
		<li>舱门将依次打开。按照屏幕上的指示清空废液并移除所有耗材。点击 下一步。</li>
		<li>完成清洁后关闭载台，点击 下一步。系统将开始 2 分钟的紫外清洁。测序仪即可准备启动下一次运行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用集成软件分析结果（每位患者的分析时间 [DNA 和 RNA 样本]：15 分钟）
注意：该技术已获得法国认可委员会（COFRAC）ISO 15189 认证（https://www.cofrac.fr/）
<ol>
	<li>数据与结果
	<ol>
		<li>在 结果 菜单中选择一个运行结果或样本结果。在 结果/运行结果 界面中，将列出所有运行记录。</li>
		<li>通过列标题中的筛选功能搜索结果列表。</li>
		<li>点击 结果 ，然后点击 样本结果。接着，在样本名称列中点击目标样本的名称，以查看该唯一样本的测序结果。</li>
		<li>点击屏幕左上角的 列 ，或从表格中取消选中某些列以隐藏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>查看质控结果及扩增子覆盖度。
	<ol>
		<li>在 结果 界面中点击 质控 标签页。</li>
		<li>对于DNA样本，需确保中位数绝对成对差异（MAPD）在0至0.5之间，以验证拷贝数变异（CNV）分析的有效性。比对上的读段数必须超过150万。</li>
		<li>对于RNA样本，检查比对上的读段数是否在15万至40万之间。低于此范围可能导致假阴性，高于此范围则可能导致假阳性。</li>
		<li>点击某个样本名称以打开 关键发现 标签页。</li>
		<li>向下滚动至扩增子 覆盖度图。</li>
		<li>审阅覆盖度图。由于供应商未提供最低覆盖度阈值，需自行定义。为确定合适的范围和阈值，可混合一个对照样本和一个野生型（WT）样本，然后观察一个或多个选定突变位点的扩增子覆盖度最小值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>查看变异结果。
	<ol>
		<li>如需以表格格式导出数据，请点击屏幕右上角的 导出 按钮。</li>
		<li>要查看单核苷酸变异/插入缺失变异（SNV/INDEL）结果，请点击 变异 标签页，然后点击 SNV/InDel。点击 编辑筛选条件，并选择 无筛选。 
		注：根据法国国家癌症研究所（INCA）专家组的建议，灵敏度阈值已设定为5%（https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes）。</li>
		<li>查看 融合 结果及 RNA外显子变异：点击 变异 标签页，然后点击 融合。</li>
		<li>在右上角点击 可视化 和 RNA外显子变异，然后审阅 RNA外显子变异 图谱。</li>
		<li>使用该试剂盒可检测 EGFR、MET 和 AR 基因的外显子跳跃现象。点击 可视化 可更便于分析。</li>
		<li>查看RNA外显子片段融合不平衡：点击 变异 标签页，然后点击 融合。</li>
		<li>在右上角点击 可视化 和 RNA外显子片段融合不平衡，然后审阅 RNA外显子片段融合不平衡 图谱。融合不平衡是指已知伙伴基因与未被检测面板覆盖的伙伴基因之间的融合。</li>
		<li>查看CNV结果：在 变异 标签页中点击 CNV 以显示数据。 
		注：在分析CNV结果时，必须谨慎对待样本准备过程中提供的性别信息及肿瘤细胞百分比。由于 AR 基因仅存在于 X 染色体上，若未注明性别，男性样本可能出现信号丢失，从而导致男性患者出现假阳性结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>审阅插件结果。
	<ol>
		<li>审阅 覆盖度分析 插件结果：在右上角点击并选择下载文件。</li>
		<li>覆盖度分析 插件会生成一份 覆盖度分析报告。</li>
		<li>审阅分子 覆盖度分析 插件结果：在右上角点击并选择下载文件。该分析用于验证所有扩增子是否均被覆盖，并确认软件提供的拷贝数变异（CNV）结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>查看检测指标与运行报告
	<ol>
		<li>在 运行概要 中点击 运行报告 标签页。</li>
		<li>要查看 运行报告，请在下拉菜单中选择 选择样本 选项。</li>
		<li>检测指标与运行报告：在屏幕顶部可找到测序指标，随后在 运行样本 表格中列出各样本的具体指标。 
		注：客户支持归档（CSA）文件中的信息有助于排查结果问题，但无法直接进行分析。CSA文件汇总了整个运行的数据，并在运行失败时突出显示可能的问题原因。</li>
		<li>下载运行报告：点击 报告 标签页。</li>
		<li>点击 下载报告 以PDF格式下载运行报告摘要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成变异报告。
	<ol>
		<li>在 设置 步骤中启用 生成报告 功能，以便在运行数据分析期间自动为每个样本生成变异报告。</li>
		<li>生成某个样本的变异报告后，系统将在两个位置提供该报告：首先，在 结果/样本结果 界面中提供一个链接，点击该链接即可下载PDF文件。</li>
		<li>其次，进入 报告 标签页中的 变异报告 面板，点击 下载报告 按钮。可对变异报告进行电子签名或手动签名。 
		注：已进行电子签名的报告在 样本结果 界面中其样本名称后会显示（签发）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Assessing Genomic Alteration in Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer Patients

<ol><li>Howlader, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+advances+in+lung-cancer+treatment+on+population+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality.</a> New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).</li>
<li>Melosky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapidly+evolving+landscape+of+novel+targeted+therapies+in+advanced+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).</li>
<li>Hanna, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+for+stage+IV+non-small-cell+lung+cancer+with+driver+alterations%3A+ASCO+and+OH+%28CCO%29+joint+guideline+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update.</a> Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).</li>
<li>Kerr, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+landscape+of+biomarker+testing+for+non-small+cell+lung+cancer+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">The evolving landscape of biomarker testing for non-small cell lung cancer in Europe.</a> Lung Cancer. 154, 161-175 (2021).</li>
<li>Mosele, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+use+of+next-generation+sequencing+%28NGS%29+for+patients+with+metastatic+cancers%3A+a+report+from+the+ESMO+precision+medicine+working+group%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group.</a> Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).</li>
<li>Kazdal, D., Hofman, V., Christopoulos, P., Ilié, M., Stenzinger, A., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion-positive+non-small+cell+lung+carcinoma%3A+Biological+principles%2C+clinical+practice%2C+and+diagnostic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+and+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fusion-positive non-small cell lung carcinoma: Biological principles, clinical practice, and diagnostic implications.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 61 (5), 244-260 (2022).</li>
<li>Li, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+deruxtecan+in+HER2+-mutant+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).</li>
<li>Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+practice+assessment+of+KRAS+status+in+NSCLC+patients%3A+A+new+challenge+for+the+thoracic+pathologist+is+right+around+the+corner%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner.</a> Cancers. 14 (7), 1628(2022).</li>
<li>Skoulidis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sotorasib+for+lung+cancers+with+KRAS+p.G12C+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sotorasib for lung cancers with KRAS p.G12C mutation.</a> New England Journal of Medicine. 384 (25), 2371-2381 (2021).</li>
<li>Hellyer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tumor+suppressor+gene+co-mutations+on+differential+response+to+EGFR+TKI+therapy+in+EGFR+L858R+and+Exon+19+deletion+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Impact of tumor suppressor gene co-mutations on differential response to EGFR TKI therapy in EGFR L858R and Exon 19 deletion lung cancer.</a> Clinical Lung Cancer. 23 (3), 264-272 (2022).</li>
<li>Mograbi, B., Heeke, S., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+stk11%2Flkb1+assessment+in+non-small+cell+lung+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">The importance of stk11/lkb1 assessment in non-small cell lung carcinomas.</a> Diagnostics. 11 (2), 196(2021).</li>
<li>Nadal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+patients+with+advanced-stage+lung+adenocarcinoma+with+radiologic+complete+response+to+nivolumab+treatment+harboring+an+STK11%2FLKB1+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22JCO+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Two patients with advanced-stage lung adenocarcinoma with radiologic complete response to nivolumab treatment harboring an STK11/LKB1 mutation.</a> JCO Precision Oncology. 4, 1239-1245 (2022).</li>
<li>Smeltzer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+international+association+for+the+study+of+lung+cancer+global+survey+on+molecular+testing+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">The international association for the study of lung cancer global survey on molecular testing in lung cancer.</a> Journal of Thoracic Oncology. 15 (9), 1434-1448 (2020).</li>
<li>Ahern, E., Solomon, B. J., Hui, R., Pavlakis, N., O'Byrne, K., Hughes, B. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoadjuvant+immunotherapy+for+non-small+cell+lung+cancer%3A+Right+drugs%2C+right+patient%2C+right+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neoadjuvant immunotherapy for non-small cell lung cancer: Right drugs, right patient, right time.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 9 (6), e002248(2021).</li>
<li>Wu, Y. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osimertinib+in+resected+EGFR-mutated+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osimertinib in resected EGFR-mutated non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 383 (18), 1711-1723 (2020).</li>
<li>Hanna, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+for+stage+IV+non-small-cell+lung+cancer+without+driver+alterations%3A+ASCO+and+OH+%28CCO%29+joint+guideline+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer without driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update.</a> J Clin Oncol. 38 (14), 1608-1632 (2020).</li>
<li>de Maglio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+storm+of+NGS+in+NSCLC+diagnostic-therapeutic+pathway%3A+How+to+sun+the+real+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">The storm of NGS in NSCLC diagnostic-therapeutic pathway: How to sun the real clinical practice.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 169, 103561(2022).</li>
<li>DiStasio, M., Chen, Y., Rangachari, D., Costa, D. B., Heher, Y. K., VanderLaan, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+testing+turnaround+time+for+non-small+cell+lung+cancer+in+routine+clinical+practice+confirms+feasibility+of+CAP%2FIASLC%2FAMP+guideline+recommendations%3A+A+single-center+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular testing turnaround time for non-small cell lung cancer in routine clinical practice confirms feasibility of CAP/IASLC/AMP guideline recommendations: A single-center analysis.</a> Clinical Lung Cancer. 18 (5), e349-e356 (2017).</li>
<li>Heeke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+ion+PGM+and+the+genereader+NGS+systems+in+daily+routine+practice+for+advanced+lung+adenocarcinoma+patients%3A+A+practical+point+of+view+reporting+a+comparative+study+and+assessment+of+90+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Use of the ion PGM and the genereader NGS systems in daily routine practice for advanced lung adenocarcinoma patients: A practical point of view reporting a comparative study and assessment of 90 patients.</a> Cancers. 10 (4), 88(2018).</li>
<li>Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+evaluating+predictive+biomarkers+using+small+biopsy+tissue+samples+and+liquid+biopsies+from+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients.</a> Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).</li>
<li>Ilié, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+up+an+ultra-fast+next-generation+sequencing+approach+as+reflex+testing+at+diagnosis+of+non-squamous+non-small+cell+lung+cancer%3B+experience+of+a+single+center+%28LPCE%2C+Nice%2C+France%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France).</a> Cancers. 14 (9), 2258(2022).</li>
<li>Zacharias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflex+testing+in+non-small+cell+lung+carcinoma+using+DNA-and+RNA-based+next-generation+sequencing-a+single-center+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience.</a> Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).</li>
<li>Miller, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+reflex+testing+using+focused+nextgeneration+sequencing+for+management+of+patients+with+advanced+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma.</a> Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).</li>
<li>Al-Ahmadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+of+advanced+non-small+cell+lung+cancer%3A+utilization+based+on+race+and+impact+on+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival.</a> Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).</li>
<li>Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-world+utility+of+next-generation+sequencing+for+targeted+gene+analysis+and+its+application+to+treatment+in+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma.</a> Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).</li>
<li>Sheffield, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+of+care+molecular+testing%3A+Community-based+rapid+next-generation+sequencing+to+support+cancer+care%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology%22%5BJournal%5D)">Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care.</a> Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).</li>
<li>Camidge, D. R., Doebele, R. C., Kerr, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+and+contrasting+predictive+biomarkers+for+immunotherapy+and+targeted+therapy+of+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparing and contrasting predictive biomarkers for immunotherapy and targeted therapy of NSCLC.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (6), 341-355 (2019).</li>
<li>Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+1+gene+%28Nrg1%29.+A+potentially+new+targetable+alteration+for+the+treatment+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer.</a> Cancers. 13 (20), 5038(2021).</li>
<li>Shapiro, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Phase+1+study+of+RO6870810%2C+a+novel+bromodomain+and+extra-terminal+protein+inhibitor%2C+in+patients+with+NUT+carcinoma%2C+other+solid+tumours%2C+or+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma.</a> British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).</li>
<li>Schoenfeld, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+landscape+of+SMARCA4+alterations+and+associations+with+outcomes+in+patients+with+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The genomic landscape of SMARCA4 alterations and associations with outcomes in patients with lung cancer.</a> Clinical Cancer Research. 26 (21), 5701-5708 (2021).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+deleterious+NOTCH+mutation+as+novel+predictor+to+efficacious+immunotherapy+in+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of deleterious NOTCH mutation as novel predictor to efficacious immunotherapy in NSCLC.</a> Clinical Cancer Research. 26 (14), 3649-3661 (2020).</li>
<li>Shen, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-world+evidence+of+the+intrinsic+limitations+of+PCR-based+EGFR+mutation+assay+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Real-world evidence of the intrinsic limitations of PCR-based EGFR mutation assay in non-small cell lung cancer.</a> Scientific Reports. 12 (1), 13566(2022).</li>
<li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+value+and+cost-effectiveness+of+next-generation+sequencing-based+testing+for+treatment+of+patients+with+advanced%2Fmetastatic+non-squamous+non-small-cell+lung+cancer+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).</li>
<li>Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+next+generation+sequencing+in+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Application of next generation sequencing in laboratory medicine.</a> Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).</li>
<li>Bruno, R., Fontanini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+for+gene+fusion+analysis+in+lung+cancer%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review.</a> Diagnostics. 10 (8), 521(2020).</li>
<li>Hofman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+gene+fusion+assessment+for+non-squamous+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22JTO+Clinical+and+Research+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer.</a> JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457(2022).</li>
<li>Horgan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine+perspective+identifying+the+steps+required+to+effectively+implement+next-generation+sequencing+in+oncology+at+a+national+level+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Personalized+Medicine%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe.</a> Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72(2022).</li>
<li>Cohen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+mutation+and+fusion+detection+in+NSCLC+by+sequential+DNA+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing.</a> Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).</li>
<li>Goswami, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+factors+affecting+the+success+of+next-generation+sequencing+testing+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors.</a> American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).</li>
<li>Ilie, M., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+in+Lung+Cancer+Molecular+Pathology%3A+How+to+Limit+them+in+Routine+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice.</a> Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).</li>
</ol>

Christophe Bontoux 参与Thermo Fisher Scientific的付费演讲活动并从中获益。Paul Hofman 参与Thermo Fisher Scientific的付费演讲活动，并获得利益和资助。

开发一种基于超快速扩增子的NGS方法，作为在任何分期的非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）诊断时进行分子改变评估的补充检测，是检测所有指南推荐及新兴生物标志物的最佳选择5,22,23。尽管序贯检测方法（如IHC、PCR、FISH）仅针对特定基因且可能导致组织样本耗尽，但该NGS工作流程可在核酸量较低的情况下（根据本研究，每项DNA和RNA测序最低需13 ng），对50个基因的突变、融合和扩增状态进行特异且敏感的全面评估。
此外，该方法可为非小细胞肺癌（NS-NSCLC）患者的管理提供快速且具有临床意义的结果。与定制化方法相比，该方法无需根据肿瘤分期预先筛选待分析病例，也无需等待医生提出检测申请，从而节省了宝贵的时间。已有研究表明，对晚期非小细胞肺癌直接进行高通量测序（NGS）检测可直接影响患者的总体生存率24,<sup cla...

近十年来，靶向治疗和免疫治疗的发展显著提高了非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）的总生存期（OS）1,2。因此，近年来在治疗NS-NSCLC时需要分析的必需基因和分子靶点数量也有所增加3,4。
目前国际指南推荐进行检测 EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET，以及 MET 晚期非鳞状非小细胞肺癌诊断时5此外，由于近期一些新药在临床试验中取得了非常有前景的结果，很快将对更多基因进行额外的基因组变异筛查，特别是 KRAS 和 HER2，以及 BRAC1/BRAC2，PI3KA, NRG1, 和 NUT6,7,8,9此外，不同相关基因的状态，例如 STK11, KEAP1，以及 TP53 可能对更准确地预测某些靶向治疗和/或免疫检查点抑制剂（ICIs）的治疗反应或耐药性具有重要意义10,11,12.
重要的是，必须在无明显延迟的情况下报告分子改变，以确保临床决策的严谨性。若缺乏对肿瘤的分子特征分析，可能导致启动非靶向治疗，例如单独或联合免疫治疗的化疗，从而形成次优的治疗策略，因为在具有可操作性分子改变（如EGFR突变或基因融合）的患者中，化疗的疗效有限13。
此外，目前在新辅助和/或辅助治疗背景下靶向治疗/免疫治疗的进展，可能导致需要系统性地至少对早期非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）检测EGFR和ALK的改变，因为免疫检查点抑制剂（ICIs）仅应用于EGFR和ALK野生型的肿瘤14。现在也必须对早期NS-NSCLC患者检测EGFR突变的存在，因为奥希替尼（第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂）可用于EGFR突变型NS-NSCLC的辅助治疗15。
在非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）患者中，评估不同生物标志物以预测对各种靶向治疗和/或免疫治疗反应的策略正在迅速发展，这使得这些生物标志物的逐一识别变得愈发困难3,16。在此背景下，下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）现已成为对NS-NSCLC中基因变异进行高通量并行分析的最佳方法5,17。
然而，NGS 工作流程可能难以掌握，并可能导致更长的周转时间18,19因此，许多中心仍然采用序贯方法（免疫组织化学（IHC）、荧光 原位 杂交（FISH）和/或靶向测序）。然而，该策略在样本量较小时存在局限性，尤其是由于非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）中需要检测的可操作性突变数量不断增加20因此，能够快速评估基因改变的超快速且简便的检测方法，在优化临床决策中变得愈发重要。此外，针对特定靶向治疗的处方，使用经批准和认证的分子检测系统正逐渐成为强制性要求。
本文介绍一种用于非小细胞肺癌（NS-NSCLC）分子检测的超快速、全自动扩增子测序DNA/RNA高通量测序（NGS）检测方法，该方法由法国尼斯大学医院临床与实验病理学实验室（LPCE）应用，并已通过法国认可委员会（COFRAC）依据ISO 15189标准认证（https://www.cofrac.fr/）。COFRAC认证表明，该实验室在分子分析领域开展的自动化NGS测序检测项目，符合ISO 15189标准以及COFRAC在测试/校准活动中的应用规则。通过国际公认的ISO 15189标准认证，证明该实验室在特定检测范围内具备技术能力，并建立了适当的管理体系以确保检测工作的规范运行。本文还讨论了该检测流程从组织活检样本制备到报告出具全过程中的优势与局限性。

<table><tbody><tr><td>96 孔硬壳透明板</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>4483354</td><td></td></tr><tr><td>PCR 板用粘性封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>AutoLys M 管&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>A38738</td><td>FFPE 样本处理管</td></tr><tr><td>Genexus 条形码 1-32 HD</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>A40261</td><td></td></tr><tr><td>Genexus GX5 芯片和 Genexus 耦合器</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>A40269</td><td></td></tr><tr><td>Genexus 移液器吸头</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>A40266</td><td></td></tr><tr><td>Genexus 纯化仪</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>A48148</td><td>自动化纯化仪器 (API)</td></tr><tr><td>Genexus 测序试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>A40271</td><td></td></tr><tr><td>Genexus 模板制备条带 3-GX5 和 4</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>A40263</td><td></td></tr><tr><td>Genexus 集成测序仪</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>A45727</td><td></td></tr><tr><td>Ion Torrent&amp;nbsp; Genexus FFPE DNA/RNA 纯化组合试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>A45539</td><td></td></tr><tr><td>Oncomine&amp;nbsp; Precision Assay GX (OPA) 面板（包含条带 1 和 2-HD）</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>A46291</td><td></td></tr></tbody></table>

基于超快速扩增子的非小细胞非鳞状肺癌下一代测序

Ultra-Fast Amplicon-Based Next-Generation Sequencing in Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer

近年来，针对非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）患者靶向治疗所需检测的分子改变数量显著增加。对于晚期或转移性NS-NSCLC患者，检测分子异常是实现最佳诊疗的必要步骤，有助于实施靶向治疗并改善总体生存率。然而，这些肿瘤会发展出可能通过新型疗法干预的耐药机制。某些分子改变还可能影响治疗反应。根据国际指南建议，NS-NSCLC的分子特征分析必须在短时间内完成， turnaround time（TAT）应少于10个工作日。此外，用于基因组分析的组织活检来源多样，且随着微创方法和检测方案的发展，样本尺寸持续减小。因此，病理学家面临在维持高效快速诊断策略的同时，开展有效分子检测技术的挑战。本文介绍了在NS-NSCLC患者诊断日常实践中所采用的超快速扩增子-based下一代测序（NGS）工作流程。我们证实，该系统能够在符合要求的TAT内，识别胸科肿瘤学精准医疗中当前所使用的分子靶点。

根据我们近期发表文献中详细描述的方法21，我们建立了一种优化的工作流程，用于在临床常规实践中对非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）患者进行分子改变的评估，作为诊断中的反射性检测，采用基于超快速扩增子的下一代测序技术。该方法的分子检测流程如图1所示。检测面板所包含的基因列表见补充图1。
对259例非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）患者进行了分子分析。其中包括153例支气管活检样本、47例经胸壁活检样本、39例外科手术标本，以及来自13例胸腔积液和7例支气管内超声（EBUS）的25例细胞块（表1）。在242例有效的或可获取的NGS DNA/RNA分析中检测到以下驱动基因突变：KRAS（25.4%）、EGFR（18.2%）、BRAF（6.3%）、ERBB2（1.7%）和MET（1.7%）。检测到的基因融合包括：ALK（4.3%）、<em...

非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）治疗管理中需检测的分子生物标志物日益增多，推动了快速且可靠的分子检测方法的发展。本文介绍了一种采用超快速下一代测序（NGS）技术对NS-NSCLC患者进行基因组变异评估的工作流程。

非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）患者靶向治疗所需检测的分子改变数量已显著增加……

如今，非小细胞肺癌的靶向治疗需要快速检测多种基因组变异，这对于实现最佳诊疗至关重要，因为胸部活检样本通常较小且所含肿瘤细胞较少。因此，我们提出一种超快速的下一代测序工作流程，已在病理科常规用于非小细胞肺癌的诊断。目前，用于检测分子变异的方法包括采用不同大小基因面板的靶向高通量测序，以及采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、数字PCR、荧光原位杂交和免疫组织化学的一基因一检测方法。然而，这些方法大多耗时且消耗大量组织材料，可能导致诊断延迟以及组织耗损的风险。挑战在于如何在节约材料的同时高效检测多种分子改变，并确保快速诊断。该工作流程为胸部肿瘤科医生提供全面的肿瘤信息，包括组织学诊断、PD-L1 状态以及可靶向的基因组异常。它能够实现快速治疗决策，以选择最佳疗法。我们的方案基于ESMO、NCCN和ASCO的推荐，识别胸部肿瘤学中的所有关键分子靶点，即使样本量小、DNA/RNA有限，也能及时提供结果。并且实现了自动化。该系统将技术人员的工作量减少至仅需三小时的湿实验操作。我们的目标是通过未来开发适用于组织和血浆样本的大规模高通量测序（NGS） panel，实现对肿瘤快速且全面的基因组学特征分析。然而，亟需增加利用大规模 panel 在小样本量及细胞学样本中检测多种分子变异的策略。首先，切取福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的DNA和RNA样本。打开自动化纯化（API）仪器，并使用用户名和密码登录。接着，在整合基因组浏览器软件的“样本”部分，点击“创建样本”。输入样品名称并选择应用类别。输入样品详细信息后，点击保存。然后，选择运行。单击“从样本到结果”，输入运行名称后点击“下一步”。选择检测方法，然后选择感兴趣的样本，再点击下一步。选择每个样本后，单击“分配”，然后检查Ellucian参数并保存运行。将FFPE组织样本放入样本处理管中。以2000 G离心1分钟。加入由核酸纯化试剂盒配制的蛋白酶消化主混合液至管中。将样品在60摄氏度下孵育1小时，随后在90摄氏度下孵育1小时。样品冷却后，提起样本处理管的内管，并向左旋转锁定。将内管在2000 G下离心10分钟，然后向右旋转解锁，并将其从另一管中分离。弃去内管，将外管置于冰上，直至在API上样。配制DNase消化主混合液，并将其加入预填充的FFPEDNA和RNA纯化板二中。将制备好的样品加入FFPEDNA和RNA纯化板一中。在 API 界面上，点击运行。然后选择运行方案并点击下一步。按照屏幕上的说明加载纯化运行所需的耗材和试剂。所有试剂加载完毕后，点击“下一步”。关闭 API 门，然后点击“开始”。运行结束后，点击“卸载”，并立即取出含有纯化 DNA 和 RNA 的 48 孔核酸存档板。样本纯化结束后，密封反应板并将其在零下80摄氏度条件下保存。首先，将所有测序试剂在室温下解冻30分钟，启动测序仪并登录系统。使用一张自粘式PCR板封膜密封含有纯化后FFPEDNA和RNA样本的96孔板，并将其加载至测序仪中。根据测序仪的说明书，将所有耗材安装到相应的甲板位置。检查2-HD条带中的第3号管是否有沉淀物。如果该管中存在任何沉淀物，可通过轻弹管壁或轻轻涡旋条带使沉淀物脱落。将第一条和第三条条带倒置，来回翻转三至四次以去除珠粒。一手握住条带一端，使条带封膜朝上，然后通过快速的离心手臂动作向下甩动条带，最后用手腕猛然一抖完成操作。将条带在300 G条件下离心15秒。关闭系统后，安装测序试剂盒舱门，并关上舱门。开始操作时，打开整合基因组浏览器软件，在“结果”菜单中，单击“样本结果”。然后点击样本名称列中目标样本的名称，以查看测序结果。要查看分子覆盖度分析插件的结果，请在右上角点击“下载文件”。接着在运行摘要中，点击“运行报告”标签页，以查看检测指标和运行报告。要查看SNV和INDEL结果，请点击“变异”标签，然后点击“SNV和INDEL”。点击“编辑过滤器”，并选择“无过滤器”。接下来，再次点击“变异”标签，然后点击“融合”以查看融合结果和RNA外显子变异。在右上角点击“可视化”和“RNA外显子变异”。然后查看RNA外显子变异图谱。点击“变异”标签，再选择“融合”，以查看RNA外显子片段融合失衡情况。在右上角点击“可视化”，然后选择“RNA外显子微阵列融合不平衡”，查看RNA外显子微阵列融合不平衡图。在“变异”标签页中，点击“CNV”以显示CNV结果。最后，点击链接下载PDF，生成变异报告。本研究对259例非鳞状非小细胞肺癌（NS-NSCLC）患者进行了分子分析，包括多种活检类型和手术标本。通过DNA/RNA分析还检测到了驱动突变基因和基因融合。该方法在检测单核苷酸变异、插入和缺失、拷贝数变异以及基因融合方面的敏感性较高，范围为91.67%至100%。

ultra-fast-amplicon-based-next-generation-sequencing-non-squamous-non

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

基于扩增子的超快速二代测序在非鳞状非小细胞肺癌中的应用

本文描述了两种下一代测序 panel 的临床方案。其中一个 panel 检测血液系统恶性肿瘤，而另一个 panel...

用于检测实体瘤和液体肿瘤中可靶向突变的下一代测序

本文描述了一种用于肿瘤学样本靶向二代测序的集成系统。该跨平台系统针对质量差、数量少的肿瘤活检样本进行了优化，可兼容低量DNA输入，包含经过充分表征的多变异对照，并采用一种新型变异检出算法，该算法结合了定量的分析前质量控制指标。...

湿实验与干实验流程的整合优化了低质量与低数量肿瘤活检样本的靶向下一代测序

本文描述了一种用于检测循环肿瘤DNA（ctDNA）中低频突变的技术——ER-Seq。该方法的独特之处在于采用了双向错误校正、特殊的背景过滤以及高效的分子富集。...

利用下一代测序技术检测循环肿瘤DNA中的稀有突变

从肿瘤组织中获取高质量基因组DNA是利用下一代测序技术分析遗传变异的关键第一步。本文介绍一种简单快速的方法，可从印片细胞学标本中富集肿瘤细胞并提取完整的DNA。...

利用触印细胞学技术从临床病理标本中简单快速获取高质量肿瘤DNA的方法

本方案描述了一种用于检测非小细胞肺癌（NSCLC）福尔马林固定石蜡包埋组织中可靶向基因组改变的自动化、通过ISO15189认证的下一代测序工作流程。...

使用下一代测序技术检测非小细胞肺癌中的可靶向基因变异

我们介绍了一种用于分析小鼠胚胎肢部皮肤中复杂血管网络形成的全胚免疫组织化学结合多重标记激光扫描共聚焦显微镜技术。...

胚胎肢皮肤血管系统的整体免疫组织化学分析：研究胚胎血管分支形态发生的一种模型系统

本文中，我们展示了从小鼠肺组织中分离常驻肺间充质干细胞（肺MSC）、扩增、鉴定及其免疫调节特性的分析方法。...

分离 &amp;#38; Hoechst 染料的表征低 CD45阴性 小鼠肺间充质干细胞

细胞生物学的一个基本研究目标是阐明构成真核细胞的细胞器身份特征背后的机制。本文提出一种利用荧光显微镜和下一代测序技术鉴定植物细胞器形态与功能完整性的相关基因的方法。...

荧光显微镜筛选与高通量测序：鉴定参与细胞器完整性的基因的有用工具

我们描述了一种用于制备荧光明胶包被的显微镜盖玻片的典型方法，以可视化由侵袭性伪足介导的基质降解。本文介绍了利用现有软件进行计算分析的技术，可用于定量混合细胞群体中单个细胞以及涵盖整个显微视野的多细胞群体所导致的基质蛋白水解水平。...

单细胞与多细胞环境中侵袭足介导的细胞外基质降解的定量测量

我们描述了条形码DNA文库的制备，以及随后基于杂交的外显子捕获方法，用于通过大规模并行的“下一代”测序技术在临床肿瘤样本中检测关键的癌症相关突变。靶向外显子测序具有高通量、低成本和深度测序覆盖的优势，因而能够高灵敏地检测低频突变。...

通过外显子捕获与大规模并行测序检测肿瘤标本中的体细胞遗传改变

了解基于扩增子的超快速二代测序技术用于非鳞状非小细胞肺癌的分子诊断。该方法可在三小时内完成FFPE样本的基因组分析，为259例患者提供靶向治疗决策支持。

基于超快速扩增子的非小细胞非鳞状肺癌下一代测序

探索更多视频