用于植物分子递送的直接灌注装置

将治疗性分子递送至植物中病原体所在的位置可能具有挑战性。对仅局限于韧皮部的细菌——亚洲韧皮部杆菌（Candidatus Liberibacter asiaticus，CLas）进行靶向分子递送尤为困难，尤其是在使用喷雾施用等传统方法时。直接植物输注装置因其结构简单且易于打印，实施便捷，可为任何人所使用。

这使得能够对树木中分子的潜在治疗效果进行广泛筛选。额外的优势在于，分子的扩散利用了植物蒸腾作用的自然过程。我们的研究提高了向植物递送分子的效率和精确性，可用于多种研究应用。

通过在小型植物上筛选数百种分子，我们可以避免使用大型树木，从而降低费用并减少空间占用。要开始3D打印直接植物输注（DPI）装置及模具组件，需在打印机的打印平台上涂抹一层薄薄的聚醋酸乙烯酯基胶水。将尼龙丝材装入打印机，并按照制造商的说明准备打印机。

导入所需的 STL 文件后，设置打印机并开始打印。打印完成后，将部件从打印平台取下，并用水冲洗掉部件底部的聚醋酸乙烯酯基胶水。对打印出的 DPI 装置及其他部件喷涂两层透明亮光喷漆。

为制作塑溶胶环形模具，可通过在基座上使用可拼接的塑料块构建一个矩形围挡来组装模具成型结构，其尺寸应足以容纳图案部件。将室温硫化硅胶（RTV硅胶单体）与催化剂按10:1的比例混合，搅拌一分钟。

每25毫升硅胶混合物中加入三滴食用色素和一毫升洗手液以着色。然后将硅胶溶液倒入模具中，形成一层足够薄的液层，以完全覆盖模具底部。轻压以使倒出的硅胶表面平整，并静置24小时使其固化。

硅胶固化后，再倒入一层足够深的硅胶以覆盖图案的中心孔芯印模。将图案插入液态硅胶中，使中心孔芯印模朝下。确保无气泡滞留，且各图案之间充分分离，互不接触。

使用重物或胶带将图案固定，以防止其在硅胶固化过程中漂浮移位。固化后，向模具中继续倒入额外的硅胶层，直至液面与图案顶部齐平。让硅胶静置固化24小时。

拆开可拼接的塑料块以取出模具。然后，从模具中移除型芯，并检查模具是否有撕裂或变形。在浇铸塑溶胶环时，用食用油涂抹模具内表面、所有型芯组件和O形圈。

将一个 O 形圈放置在中心柱芯中部凹槽处，并将芯体插入塑溶胶环模具的中心孔中。将给药通道芯体插入塑溶胶环模具侧面的空腔内。调整给药通道芯体末端的 V 形尖端，使其与中心柱芯上的 O 形圈对齐。

接下来，将塑溶胶放入微波炉中，以每次10秒的短时间加热，直至溶液温度达到160至170摄氏度。加热过程中，需间歇性轻轻搅拌塑溶胶，以避免产生气泡。将熔融的塑溶胶倒入塑溶胶环形模具中，靠近模具外缘处注入，注意不要引入气泡。

等待一小时，使塑溶胶环冷却。然后将环从模具中取出。该 DPI 装置高 8 厘米，宽 3 厘米。

它具有一个与壶嘴相连的单一中央储液腔。这些部件可容纳的总体积为 2.0 毫升。这个高 1.8 厘米、宽 2.7 厘米的塑溶胶环还包含两个通道，一个用于容纳 DPI 装置的壶嘴，另一个则具有可变直径，用于环绕树干固定。

正确组装后，塑料溶胶环应紧贴DPI装置，且喷口应对准树干上钻出的孔。通过生根的营养枝条扦插或种子繁殖小型盆栽柑橘树。将盆栽柑橘品系在28摄氏度条件下培养，并维持适当的光照周期。

选择适合实验大小的柑橘植株。将3D打印的直接植株灌注（DPI）装置连接到植株主干时，需在主干上选择一处表面光滑、健康且无凸起或节瘤的部位。使用直径为2毫米的钻头，以与主干表面成90度角的方向，水平钻穿茎秆中心。

将钻头反复穿过孔洞数次，以形成一个畅通无阻的光滑孔道。然后，在邻近复合物递送通道的对侧，于塑溶胶环上制作一个垂直切口。将该环套在植物上，使递送通道与先前钻出的孔对齐。

将DPI装置连接到塑溶胶环上，确保两者紧密贴合，并将DPI装置的喷嘴与塑溶胶环的输送通道及钻孔对齐。用硅胶带紧密缠绕以固定装置。检查完全组装并连接好的装置，确保其对齐正确、方向无误。

垂直通道周围的凹槽可使化合物通过树皮被额外吸收。正确组装后，塑溶胶环应紧贴直接植物输注（DPI）装置，且喷嘴与树干上钻出的孔对齐。使用新型3D打印直接植物输注（DPI）装置向植物施加化合物时，需确保该装置已正确安装在植物上。

正确组装后，聚氯乙烯溶胶环应紧贴DPI装置，且其喷嘴应对准树干上钻出的孔洞。使用注射器或移液器将感兴趣的化合物溶液注入DPI装置中。用注射器刺穿DPI装置对面的硅胶带和聚氯乙烯溶胶环，以从内部通道中抽出空气。

将提取的化合物重新放回干粉吸入器（DPI）装置中。在注射器穿刺形成的孔洞上再贴一小块硅胶胶带，以加固该区域并防止撕裂。检查装置连接处是否有可见泄漏，并检查装置储液室中的液面是否稳定。

用石蜡封膜覆盖干粉吸入装置的开口端，并向下拉紧以形成密封，减少实验化合物的蒸发。用注射器针头在石蜡膜上刺一个小孔，以防止真空形成，随后可重新填充装置。每天检查仪器，确保各部件正确对齐，并使用注射器补充液体，避免储液器干涸，直至输送达到所需剂量。

当使用DPI装置将2毫升浓度为2毫摩尔的CFDA染料引入植物时，在处理过的植物维管组织中检测到荧光信号，而在用20% DMSO水溶液处理的对照植物中则未检测到该信号。该信号在处理后24小时内即可观察到，并均匀分布于解剖后的各类植物组织中。对感染‘ Candidatus Liberibacter asiaticus’（CLas阳性）的植物进行链霉素处理后，与对照组相比，处理28天后其平均细菌滴度显著降低。

所有合并时间点的数据显示，经处理的植株其CLas平均滴度较低。与对照组相比，链霉素处理的植株在60天后偶尔出现新的健康新梢生长。与相应的卵数量相比，最高浓度的吡虫啉处理显著降低了植株上若虫的羽化数量。

若虫蜜露产量的减少在视觉上显而易见。