Name: 一种基于智能手机的秀 丽隐杆线虫 草坪回避测定成像方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 了解如何使用智能手机和LED灯箱对秀丽隐杆线虫的草坪回避行为进行低成本成像记录。该方法支持长期观察与多组同时录制，助力神经功能与基因研究。

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感谢李德仲对稿件的审阅以及对Python代码的测试。本研究由韩国国家研究基金会资助，项目编号为2017R1A5A2015369（K.-h.Y.）和2019R1C1C1008708（K.-h.Y.）。

1. 设置成像装置（图1A-E）
<ol>
	<li>确保配备满足以下最低要求的智能手机摄像头： 
	12&#160;百万像素（MP）摄像头 
	1080p 分辨率视频 
	5 GB&#160;存储空间（20 分钟视频约为 3–4 GB） 
	从应用商店下载延时摄影应用程序（可免费获取）</li>
	<li>将 LED 光源箱放置于 25 °C 培养箱的底层搁架上，实验将在该培养箱中进行。</li>
	<li>为遮盖 LED 光源表面的点状图案，铺上两张纸巾以完全覆盖 LED 箱表面。</li>
	<li>为样品制作一个抬高的平台（图 1A、D）。该抬高平台由透明塑料片构成，由中空的矩形隧道支撑。这些隧道起到聚光器的作用，可聚焦光线，从而提高样品的成像对比度（图 1C）。确保隧道壁具有一定的暗度，以减少光散射。本研究使用了棕色纸盒。隧道尺寸为 5.5 cm × 17 cm × 4.5 cm（宽 × 长 × 高）。LED 光源箱最多可容纳五个隧道。</li>
	<li>在平台上方安装另一层搁架，用于放置用于录制的手机（图 1B、E）。每部手机可录制三至六个培养板（每排三个板，共一至两排），因此应相应调整搁架高度。搁架应位于样品上方约 15 cm 处（图 1B）。</li>
	<li>在培养箱内放置一个电源插座，以便在夜间录制期间为手机供电。</li>
</ol>
2. 缓冲液和培养基的制备
<ol>
	<li>制备 M9 缓冲液：将 3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4 和 5 g NaCl 加入 1 L 蒸馏 H2O 中。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟以灭菌。冷却缓冲液后，加入 1 mL 1 M MgSO4。</li>
	<li>制备 1 M KPO4 缓冲液：将 108.3 g KH2PO4 和 35.6 g K2HPO4 加入 1 L H2O 中。用 KOH 调节 pH 至 6.0。通过高压灭菌进行灭菌。</li>
	<li>制备线虫漂白溶液：将 1 mL 漂白剂、0.4 mL 1 M NaOH 和 2.6 mL H2O 混合。</li>
	<li>制备线虫生长培养基（NGM）琼脂平板。
	<ol>
		<li>在 3 L 的烧瓶中加入 3 g NaCl、2.5 g 细菌蛋白胨和 17 g 细菌琼脂。加入 975 mL 蒸馏水，并放入搅拌子。</li>
		<li>高压灭菌后冷却至 55 °C，加入 1 mL 胆固醇（乙醇中 5 mg/mL）、1 mL 1 M CaCl2、1 mL 1 M MgSO4 和 25 mL 1 M KPO4 缓冲液（pH 6.0）。充分搅拌混合。倒入 6 cm 培养皿中。让平板干燥至少 2 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 OP50 E. coli 接种 NGM 琼脂平板：用移液器吸取约 1 mL 过夜培养的 OP50 菌液，形成细菌菌苔。室温（RT）放置，待用。</li>
</ol>
3. 高蛋白胨NGM平板的制备（用于PA14）
注意：这些平板至少应在实验前5天制备。
<ol>
	<li>制备含0.35%蛋白胨的NGM培养基。在250 mL锥形瓶中加入0.3 g NaCl、0.35 g细菌蛋白胨和1.7 g细菌琼脂，再加入97.5 mL蒸馏水，并放入搅拌子。</li>
	<li>用铝箔封住瓶口，在121 °C条件下高压灭菌20分钟。</li>
	<li>冷却至55 °C后，加入0.1 mL胆固醇溶液（5 mg/mL溶于乙醇）、0.1 mL 1 M CaCl2、0.1 mL 1 M MgSO4以及2.5 mL 1 M KPO4缓冲液（pH 6.0），搅拌使其充分混匀。</li>
	<li>将高蛋白胨NGM培养基倒入35 mm培养皿中。</li>
	<li>将平板干燥至少2天。</li>
</ol>
4. 通过漂白法同步线虫
注意：在实验开始前3天启动此步骤。
<ol>
	<li>取含有产卵成虫的培养皿，用 M9 缓冲液冲洗培养皿，将虫体收集至 1.7 mL 微量离心管中。</li>
	<li>尽可能去除上清液，然后加入 400 µL 漂白液。间歇性涡旋振荡，静置约 4–5 分钟，直至成虫虫体裂解，释放出虫卵。</li>
	<li>加入 M9 缓冲液至微量离心管满，以稀释漂白液。在最大转速（12,000 至 13,000 × g）下离心 1–2 秒，弃去上清液，并用 M9 缓冲液再洗涤三次。</li>
	<li>将虫卵转移至含有 M9 缓冲液的空 35 mm 培养皿中。在 20 °C 下静置过夜，使虫卵孵化。在无食物条件下，孵化后的线虫将停滞于 L1 幼虫阶段，从而实现所有线虫发育阶段的同步化。 
	注意：使用明胶溶液（0.05% 明胶溶于高压灭菌水）包被 35 mm 培养皿，可防止虫卵粘附于皿底，减少虫卵损失。</li>
	<li>次日，将处于 L1 阶段的线虫转移至接种了 OP50 的 NGM 培养皿中。</li>
	<li>在 20 °C 下培养线虫 53–54 小时，直至线虫发育至 L4 幼虫阶段。</li>
</ol>
5. 细菌（&#160;Pseudomonas aeruginosa，PA14）的制备
注意：在检测开始前 4 天进行此步骤。
<ol>
	<li>从-80 °C中取出解冻的细菌，在不含任何抗生素的Luria Bertani（LB）琼脂平板上划线，并于37 °C过夜培养。 
	注意：始终使用新鲜细菌。划线后的平板应保存在4 °C，且不超过1周。</li>
	<li>挑取单个菌落接种至3 mL King's肉汤中，在37 °C摇床培养箱中过夜培养。</li>
	<li>次日，将7 µL过夜培养物接种到高蛋白胨NGM平板上，于37 °C培养24 h。</li>
	<li>将接种后的平板转移至室温，再孵育24 h后使用。准备就绪后，需在接下来的24 h内使用该平板。</li>
</ol>
6. 准备记录
注意：在进行检测前立即执行此步骤。
<ol>
	<li>将智能手机插入连接电源插座的电源插线板。确保关闭自动锁定设置，以防止手机在录制过程中返回锁屏界面。</li>
	<li>打开延时摄影相机应用程序，将延时拍摄间隔设置为 2 秒，视频质量设置为 1080p、30 fps。</li>
	<li>将智能手机屏幕朝上放置，使用后置摄像头进行录制。检查屏幕，确保纸盒通道完全位于视野范围内。</li>
</ol>
7. 草坪回避实验
<ol>
	<li>使用铂金丝接种环，将30条同步化的L4期线虫（从L1期起53-54小时）转移至PA14平板上，将线虫放置在细菌菌苔中央。本研究中每个实验条件测试两块平板（即每个条件共60条线虫）。</li>
	<li>将两块平板放置在记录装置的抬高平台上，平板盖朝下，含琼脂的一侧朝上，面向摄像头。</li>
	<li>在智能手机屏幕上点击平板所在位置，使摄像头对准检测平板。在平板上带有标签或文字有助于摄像头准确对焦。 
	注意：只要文字位于平板边缘，就不会干扰线虫成像。幸运的是，即使线虫离开菌苔后仍会停留在其附近，因此只需保证菌苔周围区域无遮挡即可获得清晰视野。</li>
	<li>开始录像。</li>
	<li>录像开始后，可继续将更多平板添加到平台上。由于通过挑取方式转移线虫耗时较长，不同平板之间可能存在显著的时间延迟。请记录后续各平板的延迟时间，以便按各自开始时间准确统计每个条件的数据。</li>
	<li>从最后一批放置到平台上的平板开始，持续录像20小时。在最终生成的时间序列视频中，20小时的录像将压缩为20分钟的视频。 
	注意：在实验结束后，至少在最初几次实验中，建议直接从平板上手动计数线虫数量。该结果可与视频成像获得的数据进行比较，以确认两者结果一致。</li>
</ol>
8. 使用 Python 脚本处理视频
<ol>
	<li>将视频文件传输到计算机进行处理。文件扩展名为 MOV（iPhone）或 MP4（Android）。</li>
	<li>使用 Python 代码处理视频。代码可在 github.com/khyoon201/wormavoid 获取。</li>
	<li>运行 Python 脚本前，请确保计算机已预装以下软件：用于转换视频文件的工具 ffmpeg（安装说明见其官网 ffmpeg.org/download），以及 Python 包 os、pandas、tkinter 和 ffmpeg-python。</li>
	<li>使用 extract_frame.py 脚本确定每块培养板的尺寸和坐标。
	<ol>
		<li>运行 extract_frame.py 脚本。将弹出窗口用于选择计算机中存储的视频文件。运行完成后，同目录下将生成一个同名的 jpeg 文件。</li>
		<li>在 ImageJ（imagej.org）中打开该 jpeg 文件。</li>
		<li>从菜单中选择 分析 &#62; 设置测量值。确保勾选 显示标签 选项（图 2A）。关闭窗口。</li>
		<li>使用 直线 工具，通过在培养板上画一条线测量其直径，然后从菜单中选择 分析 &#62; 测量。若视频分辨率为 1080p，每块培养板的宽度约为 480 像素。记录该信息并关闭 结果 窗口。</li>
		<li>使用 多点 工具，在每块培养板的左上角标记点。这些点将成为裁剪后视频的左上角（图 2B）。标记顺序很重要；应按照培养板开始实验的时间顺序依次标记。为所有培养板标记完成后，从菜单中选择 分析 &#62; 测量。包括各点 X 和 Y 坐标在内的测量结果将显示在结果窗口中。</li>
		<li>若需处理多个视频，请在 ImageJ 中对其他 jpeg 文件重复上述步骤。所有 X 和 Y 坐标将列在同一 结果 窗口中。</li>
		<li>将 结果 窗口保存为 csv 文件。该文件应保存在与视频文件相同的目录中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定每块培养板的起始时间。
	<ol>
		<li>在计算机或手机上播放视频，记录下每组置于摄像机下的培养板的开始时间。</li>
		<li>用坐标数据打开 Results.csv 文件，并添加一列名为 &#34;start&#34; 的列。对于对应各个培养板的每一行，在 &#34;start&#34; 列中输入相应的起始时间（单位为秒）（例如，若起始时间为 0:00:08，则输入 8）。保存文件。 
		注意：列名必须为 &#34;start&#34;（小写，不含引号），以便下一个裁剪和修剪脚本能正确识别。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>裁剪并修剪视频。
	<ol>
		<li>运行 crop_n_trim.py 脚本。</li>
		<li>提示时选择 Results.csv 文件。 
		注意：请确保 Results.csv 文件和所有视频文件位于同一目录中。</li>
		<li>输入培养板的尺寸。输入之前记录的像素值。 
		&#8203;注意：脚本将读取 Results.csv 文件的每一行，通过 &#34;label&#34; 列中的文件名找到对应的视频文件，并根据 &#34;X&#34; 和 &#34;Y&#34; 列指定的坐标进行裁剪。每块培养板的起始时间由 &#34;start&#34; 列中的时间确定。脚本运行完成后，将生成一个与视频同名并附加起始时间的文件夹（例如 &#34;Movie1_8&#34;），其中保存了对应实验各小时时间点的 10 秒视频。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 使用 ImageJ 进行手动计数
<ol>
	<li>在 ImageJ 中打开每个 AVI 文件。</li>
	<li>计数可见位于菌苔外部的线虫。在某一帧中重叠的线虫通常会在另一帧中分开，以便能够准确计数。</li>
	<li>计算每个时间点的占据率： 
	占据率 = (总虫数 - 菌苔外虫数) / 总虫数 
	注意：在视频记录过程中，线虫会进出菌苔，但这不会显著影响结果。应采用看起来接近平均值的数量，或采用视频中确切整点时间点（如视频开始后 5 秒）的虫数。</li>
</ol>

Smartphone-Based Imaging for C. elegans Lawn Avoidance Assay

<ol><li>Pradel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+avoidance+of+a+natural+product+from+the+pathogenic+bacterium+Serratia+marcescens+by+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).</li>
<li>Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+NPR-1-mediated+behaviors+are+suppressed+in+the+presence+of+mucoid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+shapes+the+C.+elegans+sensory+response+to+Pseudomonas+produced+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide.</a> eLife. 7, 36833(2018).</li>
<li>Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+pathways+that+surveil+and+defend+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria.</a> Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).</li>
<li>Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+conserved+C.+elegans+genes+engages+pathogen-+and+xenobiotic-associated+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses.</a> Cell. 149 (2), 452-466 (2012).</li>
<li>Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensation+of+bacterial+secondary+metabolites+modulates+neuroendocrine+signaling+and+behavior+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans.</a> Cell. 159 (2), 267-280 (2014).</li>
<li>Singh, J., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+infection+regulates+behavior+and+learning+via+neuroendocrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling.</a> eLife. 8, 50033(2019).</li>
<li>Lee, K., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intestine-derived+neuropeptide+controls+avoidance+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).</li>
<li>Singh, J., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lawn+avoidance+and+bacterial+two+choice+preference+assays+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-Protocol. 10 (10), 3623(2020).</li>
<li>Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymorphism+in+npr-1+is+a+behavioral+determinant+of+pathogen+susceptibility+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans.</a> Science. 323 (5912), 382-384 (2009).</li>
<li>de Bono, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+a+neuropeptide+Y+receptor+homolog+modifies+social+behavior+and+food+response+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans.</a> Cell. 94 (5), 679-689 (1998).</li>
<li>Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormScan%3A+a+technique+for+high-throughput+phenotypic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33483(2012).</li>
<li>Stroustrup, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+lifespan+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans lifespan machine.</a> Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).</li>
<li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652(2017).</li>
<li>Marquina-Solis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidergic+signaling+controls+the+dynamics+of+sickness+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Churgin, M. A., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+imaging+system+for+monitoring+C.+elegans+behavior+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging.</a> Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).</li>
<li>Barlow, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megapixel+camera+arrays+enable+high-resolution+animal+tracking+in+multiwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates.</a> Communications Biology. 5 (1), 253(2022).</li>
<li>Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+optogenetic+system+for+behavioral+analysis+of+freely+moving+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals.</a> Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

对动物行为进行成像记录，而非依赖直接观察，不仅操作便捷，而且具有留下可视化记录的优势。这使得客观的第三方可以进行盲法分析，甚至可用于基于图像识别技术的自动化分析。尽管存在这些优势，但通常可获得的标准设备成本较高，因此一旦购买，用户便需长期依赖该固定配置。
使用智能手机采集简单的秀丽隐杆线虫（C. elegans）行为视频具有多项优势。该方法对技术知识的要求极低，且设置极为简便，所需物品易于获取且成本低廉。另一优势在于智能手机的便携性——其体积小巧，可置于狭小空间内；同时因其自带存储功能，无需连接计算机。这使得实验装置可灵活放置于任何位置，即使空间极为有限亦可实现。将录制的视频文件转移至计算机也非常方便——由于视频采用压缩的MPEG-4格式编码，文件体积不大。当具备无线传输文件的条件时，文件传输尤为便捷。
由于在成像时未使用任何放大，视频中捕捉到的线虫仅由几个像素组成。L4期线虫刚好足够大，可以在无放大条件下被捕捉，但较小的像素尺寸限制了其在高质量图像识别和运动追踪中的应用。使用较新型号提供的变焦镜头或加装变焦...

在研究的众多优势中 秀丽隐杆线虫其简单的神经系统为研究基因和细胞水平的变化如何影响神经网络功能和行为输出提供了机会。尽管神经元数量有限， 秀丽隐杆线虫 表现出多种复杂行为。其中一种是避菌行为，即以细菌为食的线虫在面对有害食物来源时会离开细菌菌落。 秀丽隐杆线虫 避免病原菌的菌苔生长1,2,3产生毒素或添加了毒素的细菌菌苔1,4，甚至是表达RNAi且其靶基因敲低对线虫健康有害的细菌4,5研究表明，线虫会对病原细菌产生的代谢物等外部刺激作出反应1,6，或表明食物使其生病的内部信号4,7这些信号通过保守的信号通路进行传递，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和转化生长因子β（TGFβ）通路，并且需要肠道与神经系统之间的相互通讯。4,6,7,8.
尽管该检测方法较为简单，但习得行为的形成需要经历数小时，通常需要过夜。虽然存在一些无法离开的突变体，此时仅需在一个时间点进行避害评分即可证明其缺陷，但许多突变体最终仍会离开，只是出离速度较慢。对于这类情况，需要每隔几小时追踪一次线虫的运动，这在过夜期间可能难以实现。计数过程本身也耗时较长，导致不同培养板之间存在时间延迟，从而限制了可同时检测的培养板数量。若能使用成像装置在整个检测期间同时记录多个培养板，将非常有助于实验的开展，但该装置的搭建成本可能较高，具体取决于实验室的资金状况。
为解决这一问题，我们设计了一种非常简单的方法，利用智能手机记录避光实验。每部手机可同时录制最多六个实验板的时间序列视频。为提供透射光，我们使用一个可在线轻松购买的发光二极管（LED）光源箱。实验板放置在一个由中空矩形隧道支撑的抬高平台上，该平台可聚焦入射光，从而增强对比度。我们还提供了一个Python脚本，可将视频转换为音频视频交错（AVI）格式文件，每个文件包含每小时时间点的10秒片段。随后，视频被裁剪为单个实验板的独立片段，并保存为单独文件，以便进行人工计数。
该方法成本低廉，且操作极为简便，所用物品对大多数人而言都易于获取。本文以广泛应用的草坪回避实验为例，针对人类病原体 Pseudomonas aeruginosa （PA14）进行说明，其具体实验方案已有文献报道2,9。最后，我们还综述了该成像方法在应用于其他 C. elegans 行为实验时需考虑的因素与局限性。

<table><tbody><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>SPL</td><td>#10035</td><td></td></tr><tr><td>细菌用琼脂</td><td>BD</td><td>#214010</td><td></td></tr><tr><td>细菌用蛋白胨</td><td>BD</td><td>#211677</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>DAEJUNG</td><td>2507-1400</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>BioBasic</td><td>CD0122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾 (K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>JUNSEI</td><td>84120-0350</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>BioBasic</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>King B 肉汤</td><td>MB cell</td><td>MB-K0827</td><td></td></tr><tr><td>多面板 LED 光箱</td><td>Artmate</td><td>N/A</td><td>这是一种 USB 供电的 LED 透写台，用于描图和绘图。Artmate 是一个韩国品牌，但在任何搜索引擎中搜索“&quot;用于描图的 LED 光箱&quot;”均可找到其他品牌的多种选择。整体尺寸约为 9&quot; x 12&quot;（A4 尺寸）。例如，来自亚马逊美国站：https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&amp;amp;keywords=&lt;br/&gt; LED%2Blight%2Bbox&amp;amp;qid=1674183224&amp;amp;sprefix&lt;br/&gt; =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&amp;amp;sr=8-5&amp;amp;th=1</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>DAEJUNG</td><td>5514-4400</td><td></td></tr><tr><td>塑料文件套（透明）</td><td>Smead</td><td>#85753</td><td>任何具有一定硬度的透明塑料片均可用作平台。例如，来自亚马逊美国站：https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ&lt;br/&gt; 8</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>JUNSEI</td><td>84185-0350</td><td></td></tr><tr><td>电源插座排插&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>为容纳 3 部手机和 1 个 LED 光箱，至少需要 4 个插座。</td></tr><tr><td>智能手机</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>最低要求：1200 万像素广角摄像头，支持 30 fps 的 1080p 高清视频录制</td></tr><tr><td>氯化钠(NaCl)</td><td>DAEJUNG</td><td>#7548-4100</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>YAKURI</td><td>#31727</td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于智能手机的 c. elegans 菌苔回避实验成像方法

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

当暴露于有毒或致病性细菌时，线虫Caenorhabditis elegans会表现出一种习得性的菌落回避行为，即蠕虫逐渐离开其食物来源，更倾向于停留在细菌菌落之外。该检测方法可简便地评估蠕虫感知外部或内部信号并对其有害环境做出适当反应的能力。尽管该实验方法简单，但计数过程耗时，尤其在处理多个样本或实验持续过夜时对研究人员而言十分不便。虽然能够长时间对多块培养板进行成像的成像系统具有实用性，但成本较高。本文中，我们描述了一种基于智能手机的成像方法，用于记录C. elegans的菌落回避行为。该方法仅需一部智能手机和一个发光二极管（LED）光源箱，作为透射光源。通过使用免费的延时摄影应用程序，每部手机可同时对最多六块培养板进行成像，图像具有足够的清晰度和对比度，便于人工统计菌落外的蠕虫数量。所获得的视频被处理为每小时时间点对应的10秒音频视频交错（AVI）文件，随后裁剪为单独显示每块培养板的画面，以更便于计数。该方法是一种经济高效的方案，适用于希望研究回避缺陷的研究人员，并且有望扩展应用于其他C. elegans行为检测实验。

由该实验方案生成的第一个视频是从实验开始后1小时拍摄的。0小时的视频未被保存，因为线虫在菌苔内部开始实验，此时占据率始终为100%。
将野生型 N2 线虫与 npr-1 突变体进行比较，后者在文献中已有明确报道存在菌苔回避缺陷6,10（图 3A-E）。如野生型所示，线虫会逐渐离开菌苔并停留在外部区域（图 3A、B）。实验结果以图表形式展示随时间变化的占据率（图 3B）。在视频中可清晰观察到菌苔外的线虫，而位于浓密菌苔内部的线虫则较难分辨（图 3D、E）。但由于每块培养皿中恰好有 ...

本文介绍了一种使用智能手机和发光二极管（LED）光源箱等 readily available 物品记录秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）草坪回避行为的简单且低成本方法。我们还提供了一个 Python 脚本，用于将视频文件处理为更便于计数的格式。

一种基于智能手机的 C. elegans 菌苔回避实验成像方法

当暴露于有毒或致病性细菌时，线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）会表现出一种习得性的菌苔回避行为，即线虫会逐渐……

在秀丽隐杆线虫（C.elegans）表现出的多种行为中，病原菌草坪回避是该线虫为减少接触有害病原体而采取的一种防御策略。在我们的实验室中，我们利用这种行为作为工具，用于鉴定参与介导该行为的神经元正常功能的基因。草坪回避行为是一种简单的检测方法。然而，该过程需要经历数小时才能完成。因此，若能对实验进行记录以观察长时间内的行为变化，将十分便利。此外，若能同时记录多个实验，则更为理想。尽管文献中已描述了多种成像解决方案，但对于资源有限的实验室而言，即便是少数价格适中的相机也可能难以负担。此外，一些研究人员可能希望尝试该检测方法，但并无长期使用的计划。针对此类情况，短期解决方案（例如本方案）可能会有所帮助。我们的成像方案提供了一种简便且低成本的方法来记录线虫行为。我们使用智能手机记录实验过程，然后通过 Python 脚本处理视频，使其适用于计数。设置成像装置时，请使用满足最低配置的智能手机：摄像头至少 1200 万像素、分辨率 1080 像素、存储空间 5 GB，并从应用商店下载延时摄影视频应用程序。将LED光源盒放置于设定为25摄氏度的培养箱底层架上，实验将在该培养箱中进行。为遮盖LED光源表面的点状图案，用两张纸巾铺满LED盒的整个表面。为样本准备一个抬高的平台，该平台由透明塑料片构成，并由中空的矩形隧道支撑。确保隧道壁具有一定的暗度，以尽量减少光线散射。在载物台上方放置另一个支架，用于固定用于录制的手机。每部手机将录制三到六个培养板，因此需相应调整支架高度。在培养箱内放置一个电源插座，以便在过夜录制期间为手机供电。准备录制时，将智能手机插入连接至电源插座的电源插座上。务必关闭自动锁定设置，以防止手机在录制过程中返回锁屏界面。打开延时摄影相机应用程序，将视频质量设置为1080像素、每秒30帧。将延时摄影间隔设为2秒。将智能手机屏幕朝上放置，使用后置摄像头进行拍摄，并确保纸盒通道完全处于视野范围内。使用铂金丝挑取30条同步化的L4期线虫，转移到PA14平板上，将线虫放置在PA14细菌菌苔的中央。本研究中，每种条件均测试两个平板。将两个培养皿放置在记录装置的抬高平台上，皿盖朝下，使琼脂面朝上正对摄像头。在智能手机屏幕上点击培养皿所在位置，使摄像头对焦于检测用培养皿。开始录像后，再将更多培养皿添加到平台上。记录载物台上最后放置的一组培养皿的20小时影像。在最终的延时视频中，20小时的录制将生成一段20分钟长的视频。将野生型N2线虫与npr-1突变体进行比较。野生型蠕虫逐渐离开细菌菌苔并停留在其外。视频中可清晰看到位于浓密细菌菌苔外的蠕虫，而菌苔内的蠕虫则较难分辨。通过运行 Python 脚本 extract_frame.py 来确定含有 L4 期蠕虫的 PA14 平板的尺寸。然后，在 ImageJ 中打开 JPEG 文件。从菜单中选择“分析”，然后选择“设置测量”。确保勾选“显示标签”框，然后关闭窗口。使用直线工具，通过在培养皿上画一条线来测量其直径。然后从菜单中选择“分析”，再选择“测量”。如果视频分辨率为1080像素，则每个培养皿的宽度约为480像素。将此信息输入记事本以供后续使用，然后关闭结果窗口。使用多点工具，在每块培养皿的左上侧标记点，这些点将成为裁剪后视频的左上角。按照培养皿开始实验的顺序依次标记。在为所有培养板创建点后，从菜单中选择“分析”，然后选择“测量”。测量结果，包括点的 X 和 Y 坐标，将显示在“结果”窗口中。如需处理多个视频，请在 ImageJ 中对其他 JPEG 文件重复此过程。所有 X 和 Y 坐标将列在同一个结果窗口中。将结果窗口保存为 CSV 文件。该文件应保存在与视频文件相同的目录中。为了确定每块培养皿的起始时间，请在计算机或手机上播放视频，并记录下放置在摄像头下的每组培养皿的开始时间。使用包含坐标的 Results.csv 文件，并添加一个起始时间列。对于每一行对应的单个培养皿，在“开始”列下输入相应的起始时间（单位为秒）。保存文件。要裁剪和修剪视频，请运行 crop_n_trim。py 脚本。选择 Results.csv 文件。输入平板的尺寸和之前记录的像素值。脚本现在将读取 Results.csv 文件的每一行，以在脚本运行完成后找到正确的视频文件。将出现一个与视频同名的文件夹，并附加起始时间，用于保存与实验相对应的视频。进行手动计数时，在 ImageJ 中打开每个 AVI 文件，计数可见位于菌苔外部的线虫数量，然后计算每个时间点的占据率。野生型 N2 蠕虫随着时间的推移逐渐离开细菌菌苔，并停留在菌苔外，这通过随时间变化的占据率得以体现。直接从培养皿上获得的计数结果与通过成像获得的蠕虫计数结果进行了比较。结果显示，基于成像的蠕虫计数具有很高的准确性。将每种菌株的三次试验结果取平均值后，N2 和 npr-1 菌株的准确率分别为 99.5% 和 96.2%。

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Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

一种基于智能手机的秀 丽隐杆线虫 草坪回避测定成像方法

我们开发了一种视频速率追踪显微镜系统，能够以高分辨率和高速度记录并量化秀丽隐杆线虫（C.

C. elegans 追踪与行为学测量

研究人员可以通过施加电场来触发秀丽隐杆线虫（C.

趋化性电泳实验：一种观察秀丽隐杆线虫（C. elegans）运动行为的方法

本视频介绍了斑马鱼幼鱼的回避行为和接触趋向性实验。视频考察了斑马鱼幼鱼对视觉厌恶刺激的行为反应。...

斑马鱼回避与趋触性检测：一种高通量检测幼鱼对厌恶性视觉刺激行为反应的方法

本文描述了一种定量评估秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

C. elegans 趋化性实验

我们介绍了一种行为记录装置和实验方案，可实现对线虫Caenorhabditis...

线虫群体化学感应偏好性实验的自动化分析

本文介绍了一种改良的"嗅觉芯片"，用于高效进行秀丽隐杆线虫（C.

使用改良的微流控嗅觉芯片对雄性 C. Elegans 头部神经元中信息素诱导的神经元活动进行成像

本文介绍了一种组合方法，结合高分辨率显微镜、计算工具以及活体秀丽线虫（C.

亚细胞分辨率下利用各向同性光片显微镜与自动化细胞谱系分析记录秀丽隐杆线虫胚胎发育

本研究介绍了两种用于分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）复合体 I 疾病 gas-1(fc21) 蚓体运动活性的半自动化方法，分别为 ZebraLab（中通量检测）和...

动物活动量测定实验方法的比较分析 秀丽隐杆线虫 线粒体疾病模型

本方案描述了两种灵敏的检测方法，可用于区分肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）的 C. elegans 模型中轻度、中度和重度运动功能障碍，也可广泛适用于运动能力改变的 C. elegans...

肌萎缩侧索硬化症的 C. elegans 模型中运动功能障碍的评估

本方案描述了基于微流控技术的秀丽隐杆线虫（C.

高分辨率秀丽隐杆线虫（C. elegans）在所有幼虫阶段的成像

了解如何使用智能手机和LED灯箱对秀丽隐杆线虫的草坪回避行为进行低成本成像记录。该方法支持长期观察与多组同时录制，助力神经功能与基因研究。

一种基于智能手机的 C. elegans 菌苔回避实验成像方法

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